禾谷镰刀菌AY2-19及其在提取艾叶总黄酮中的应用

(一)技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一株禾谷镰刀菌AY2-19及其在艾叶总黄酮提取中的应用。

(二)背景技术

艾叶是菊科蒿属植物艾草(Artemisia argyi Levl.et Vant.)的叶片，是我国常用中药材，在历版中国药典中均有收载(中药材名为Artemisiae Argyi Folium)，其性味辛、苦，温，有小毒；归肝、脾、肾经；具温经止血，散寒止痛，外用祛湿止痒之功效；用于吐血，衄血，崩漏，月经过多，胎漏下血，少腹冷痛，经寒不调，宫冷不孕；外治皮肤瘙痒；醋艾炭温经止血，用于虚寒性出血治疗。现代药理学研究表明，艾叶及其提取物具有抗菌、抗病毒、抗氧化、保肝利胆、止血及抗凝血、抗炎、抗过敏、免疫调节、抗癌等多种药理作用。艾叶中含有多种生理活性成分，包括挥发油、黄酮、三萜、倍半萜、桉树烷和多糖等。近年来，黄酮类化合物因有降血脂、抗血栓、抗氧化、抗衰老和增强免疫力等药理作用，被广泛地用于医药和食品等行业，极具开发价值。艾叶中的黄酮含量比较高，是提取黄酮的良好原料。

目前，关于从艾叶中提取总黄酮的研究有不少报道，主要方法是乙醇提取法。常规乙醇浸提法操作简单，但提取得率往往不高。回流法能显著提高提取得率，但能耗高，过程复杂。在乙醇浸提法的基础上，辅以超声波、微波或高压处理，能促进总黄酮溶出，提取得率有一定程度的提高。目前报道最多的方法是乙醇超声提取法，其优势是超声波处理不会增加提取过程的复杂性，也不会显著增加生产成本。

近些年来，酶解技术应用于植物总黄酮的提取有较多报道。酶解提取法的条件温和，对黄酮类物质结构破坏小，提取得率可以显著提高，如宁娜等用纤维素酶和果胶酶(2:1)酶解艾叶后提取，总黄酮得率最高可达12.79％[宁娜,韩建军.一种响应面法优化酶解辅助超声提取艾叶总黄酮的方法,CN111358821A,2020-4-17]。植物细胞壁的构成包括纤维素、半纤维素、木质素和果胶等物质，使用一种酶往往对提高提取得率的效果不显著；同时使用几种酶辅助提取的效果一般优于单独使用一种酶，但多种酶的使用，无疑增加了提取成本。

微生物可以产生多种分解植物组织的水解酶，包括纤维素酶、半纤维素酶、木质素酶和果胶酶等，特别是一些霉菌和放线菌。因此，如果利用某种微生物在合适的条件下培养，发酵液中含有大量的水解酶，利用发酵液(粗酶液)直接水解植物原料，这些酶能协同分解细胞壁成分，从而有利于有效成分的释放，提取得率可以显著提高，重要的是，相比于使用纯酶，成本可以显著降低。

为了提高艾叶总黄酮提取得率，本发明用微生物发酵制备的粗酶液酶解艾叶后，再用乙醇超声法提取总黄酮，可使提取得率大幅度提高。

(三)发明内容

本发明目的是提供一株新的微生物菌株—禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)AY2-19，及其在提取艾叶总黄酮中的应用。艾叶经该菌株发酵制备的粗酶液酶解后，总黄酮提取得率可以大幅度提高。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一株新的微生物菌株—禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)AY2-19，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号GDMCC No:63062，保藏日期2022年12月20日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070。

本发明所述的禾谷镰刀菌AY2-19，是从艾叶的微生物富集培养物中分离，经过筛选和诱变选育获得的优良菌株。所述禾谷镰刀菌AY2-19的菌落形态特征如下：在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板培养基上，28℃条件下培养，初期菌落呈白色絮状，3d后菌落颜色略有加深，菌丝层较厚，表面无孢子粉，背面无色素扩散。光学显微镜下可以观察到有大型分生孢子和小型分生孢子两种。大型分生孢子呈镰刀型或月牙形，3–5个隔膜，大小4–5×25–40μm；小型分生孢子较少，呈卵圆形或椭圆形，大小2.5–4×4.5–1μm。禾谷镰刀菌AY2-19划线接种在PDA平板培养基上28℃培养3d的菌落照片见图1。

所述禾谷镰刀菌AY2-19的核糖体DNA内转录间隔区(Ribosomal DNA internaltranscribed spacer，rDNA-ITS)核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供一种所述禾谷镰刀菌AY2-19在提取艾叶总黄酮中的应用，所述应用的方法为：(1)将禾谷镰刀菌AY2-19培养获得的发酵液过滤，收集的滤液为粗酶液；(2)将粗酶液与艾叶粉混合，于26–30℃条件酶解4–6h，得艾叶酶解物；(3)往艾叶酶解物解中补充去离子水和无水乙醇后，进行超声提取，抽滤，得总黄酮提取液；(4)总黄酮提取液经减压蒸干，无水乙醇溶解和真空干燥，得总黄酮提取物。

进一步，步骤(1)所述粗酶液制备方法为：将禾谷镰刀菌AY2-19孢子接种于产酶培养基中，于30℃、180–200r/min振荡培养64–72h，发酵液过滤，滤液即为粗酶液；所述产酶培养基终浓度组成为：小麦麸皮40–50g/L，蛋白胨8–10g/L，NaNO

进一步，优选所述产酶培养基组成为：小麦麸皮50g/L，蛋白胨10g/L，NaNO

本发明所述禾谷镰刀菌AY2-19在产酶培养前，需要先经平板培养基培养产生孢子，然后将孢子悬浮于生理盐水中，获得禾谷镰刀菌AY2-19孢子液，按体积分数3％–5％的量接入产酶培养基进行培养，具体产酶培养方法为：

①孢子液制备：将禾谷镰刀菌AY2-19接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板培养基，于28℃培养64–72h，获得平板培养物；平板培养物中加入无菌生理盐水，用接种环搅动使孢子悬浮，获得禾谷镰刀菌AY2-19孢子液；所述的PDA平板培养基是成品马铃薯葡萄糖琼脂培养基，购自青岛海博生物技术有限公司，用自来水按46g/L的浓度配制，pH自然，高压蒸汽121℃灭菌20min。

②产酶培养：用步骤①制备的禾谷镰刀菌AY2-19孢子液，按体积分数3％–5％的接种量，接入产酶培养基，于30℃、180–200r/min振荡培养64–72h，获得干菌体浓度为3.67–3.84g/L、纤维素酶活力为34.2–35.8U/mL的发酵液。

进一步，步骤(2)所述粗酶液体积用量以艾叶粉质量计为4–8mL/g[即料酶比为1:4–1:8(g:mL)]；所述艾叶粉是新鲜艾叶经自来水洗净后85℃烘干，粉碎后过40目筛的细粉。

进一步，步骤(3)所述总黄酮提取液的制备方法为：所述的艾叶酶解结束后，往艾叶酶解物中补充去离子水和无水乙醇，使体系的料液比达到1:20–1:25(g:mL)，乙醇体积分数达到50％–60％。搅拌均匀后于水温80–85℃、功率150W的超声波清洗机中提取30–45min；超声醇提结束后，趁热抽滤，得总黄酮提取液。

进一步，步骤(4)从总黄酮提取液中回收总黄酮的方法为：总黄酮提取液于45℃、–0.1MPa条件下蒸馏至无液体流出，加入体积为原料艾叶质量计1–2mL/g的无水乙醇，充分振荡后于8000r/min离心5–10min，上清液于转入一洁净培养皿中，50℃、–0.1MPa真空干燥，得总黄酮提取物。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：在乙醇超声提取艾叶总黄酮前，增加了微生物发酵制备的粗酶液酶解。所用的产酶微生物禾谷镰刀菌AY2-19，是针对能够水解艾叶细胞壁而有目的分离和筛选，并经过诱变获得。经产酶发酵制备的粗酶液中含有多种水解酶，能够协同水解艾叶中的纤维素、半纤维素和果胶等物质，使细胞壁破损，有助于黄酮类物质溶出，使总黄酮提取得率显著提高。本发明提供的微生物酶解辅助提取艾叶总黄酮的方法，较直接采用乙醇超声提取法相比，从艾叶中提取总黄酮的得率可以提高25.2％。

(四)附图说明

图1为禾谷镰刀菌AY2-19在PDA上28℃培养3d的菌落照片。

图2为分光光度法测定总黄酮的标准曲线。

图3为DNS法测定葡萄糖的标准曲线。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明所述的艾叶为菊科蒿属植物艾草((Artemisia argyi)的新鲜叶片，经自来水洗净后85℃烘干，产地河南安阳市；艾叶粉是干燥的艾叶经粉碎后过40目筛的细粉。

实施例1：产酶菌株的分离和筛选

产酶酶解艾叶的微生物菌种，按如下步骤分离和筛选获得：

(1)250-mL三角烧瓶中加入5g艾叶粉，加入7.5mL无菌生理盐水搅拌均匀，于28℃培养72h。将长满霉菌的富集培养物用无菌生理盐水分别稀释1×10

(2)8个菌株的新鲜平板培养物中，分别加入10mL无菌生理盐水，用接种环搅动使得孢子悬浮，得各菌株的孢子液。

(3)取步骤(2)制备各菌株的孢子液1.5mL接入50mL产酶培养基中(接种量为3％的体积分数)，于30℃、180r/min振荡条件下产酶培养72h后，全部发酵液用布氏漏斗抽滤，收集的滤液即为粗酶液。

(4)8只50-mL离心管中分别加入0.5g艾叶粉，加入步骤(3)制备的各菌株粗酶液4mL[即料酶比为1:8(g:mL)]，搅拌均匀后于30℃水浴中酶解6h，得艾叶酶解物。

(5)步骤(4)经各个菌株粗酶液酶解的全部艾叶酶解物中，分别加入1mL去离子水和5mL的无水乙醇[体系料液比1:20(g:mL)，乙醇体积分数50％]。摇匀后于水温80℃、功率150W的超声清洗机中提取30min，趁热布氏漏斗抽滤，收集滤液，分光光度法测定其中的总黄酮含量。

从步骤(4)开始，用4mL未接种微生物的产酶培养基代替粗酶液做未酶解的对照；用4mL活力为2000U/mL纤维素酶磷酸盐缓冲液(pH 6.0，0.2mol/L)代替粗酶液做纤维素酶酶解对照。经不同菌株粗酶液酶解的艾叶及对照的总黄酮提取得率见表1。

表1经不同菌株粗酶液酶解的艾叶及对照的总黄酮提取得率

由表1数据可以看出，艾叶经AY2菌株发酵制备的粗酶液酶解后，总黄酮提取得率为7.75％，较未经酶解的对照7.13％相比，总黄酮提取得率提高了8.70％。用纤维素酶酶解的艾叶，也能提高总黄酮提取得率(7.46％)，较未酶解的对照提高了4.63％，但远不如AY2菌株发酵制备的粗酶液。艾叶经过有些微生物菌株的粗酶液酶解后，总黄酮提取得率并未提高，甚至显著降低，如AY6菌株，说明用于酶解艾叶以提高总黄酮提取得率的微生物菌株有选择性，不仅要求能产酶水解艾叶细胞壁成分，还要求不能产酶降解黄酮。本发明选定AY2菌株作为提高艾叶总黄酮提取得率的产酶菌种。

所述的PDA平板培养基是成品马铃薯葡萄糖琼脂培养基，购自青岛海博生物技术有限公司，用自来水按46g/L的浓度配制，pH自然，经高压蒸汽121℃灭菌20min，凝固前倒入直径9cm无菌培养皿，每皿15–20mL。

所述的产酶培养基终浓度组成和配制方法为：小麦麸皮50g/L，蛋白胨10g/L，NaNO

所述的总黄酮含量采用分光光度法测定，具体方法为：总黄酮提取液用体积分数60％的乙醇水溶液(以下简称“60％的乙醇”)做适当倍数稀释，使待测样品中总黄酮的浓度在标准曲线测定范围内；固体总黄酮提取物用60％的乙醇溶解，并做适当倍数稀释为待测样品。吸取待测样品溶液1mL于25-mL比色管中，加入1mL质量浓度5％亚硝酸钠(NaNO

芦丁标准曲线的绘制：用60％的乙醇配制浓度为0.25g/L的芦丁标准品溶液。分别取芦丁标准品溶液2、3、4、5、6、7mL于25-mL比色管中，加入1mL质量浓度5％亚硝酸钠(NaNO

所述的从艾叶中提取总黄酮的得率按公式(1)计算：

实施例2：发酵菌株AY2的诱变选育

对菌株AY2进行诱变育种，筛选发酵性能优良的菌株，具体方法为：

(1)孢子液的制备：菌株AY2经PDA平板培养基28℃活化培养64h后，加5mL无菌生理盐水，用接种环搅动使孢子悬浮。移取1mL孢子液到装有50mL无菌生理盐水的三角烧瓶中(加有20–30粒玻璃珠)，室温振荡15min。孢子液经过滤除去菌丝(三角漏斗底部塞一小团蓬松的脱脂棉)，在显微镜下用血球计数板对孢子液中的孢子计数，用无菌生理盐水做适当倍数稀释，调整孢子数量为1.32×10

(2)诱变：在红光照明下，分别取1.5mL上述孢子液和一枚无菌回形针于6只直径6cm的培养皿中，培养皿分别于磁力搅拌器上，在预热30min的15W紫外灯距离30cm处，分别照射1、2、3、4、5、6min。取0.5mL上述照射处理后的孢子液，作适当倍数稀释后，分别移取0.1mL涂布PDA平板培养基。以同样操作，做未经紫外线照射的孢子液稀释涂平板作为对照，以计算致死率。接种后的PDA平板用黑布包裹，倒置于28℃培养48h，对平板上的菌落进行计数，计算致死率。

(3)筛选：挑取致死率在90％以上PDA平板上的菌落转接新鲜PDA平板培养基上，获得40个菌株。各个菌株经28℃培养72h的新鲜平板培养物中，分别加入10mL无菌生理盐水，用接种环搅动使得孢子悬浮，得各菌株的孢子液。取各菌株的孢子液1.5mL，接入50mL产酶培养基中，于30℃、200r/min振荡培养72h后，发酵液用布氏漏斗抽滤，收集滤液(即为粗酶液)，测定各菌株发酵滤液的纤维素酶活力。选择酶活较野生菌株提高幅度相对较高的10个菌株，按实施例1方法，用这10个菌株发酵的粗酶液酶解艾叶，乙醇超声提取总黄酮，突变菌株粗酶液酶解的艾叶和对照的总黄酮提取得率见表2。

表2突变菌株粗酶液酶解的艾叶和对照的总黄酮提取得率

从表2数据可以看出，在复筛的10个菌株中，编号为AY2-19的菌株，发酵产纤维素酶的活力为35.4U/mL，较野生菌株AY2的26.7U/mL提高了32.6％，用该菌株发酵制备的粗酶液酶解艾叶后，总黄酮提取得率8.78％，较野生菌株AY2的7.75％提高了13.3％，较未经酶解的对照7.13％提高了23.1％。所以，本发明选定AY2-19菌株作为提高艾叶总黄酮提取得率的产酶菌株。

所述的产酶培养基终浓度组成和配制方法同实施例1。

所述的纤维素酶活力测定：10-mL刻度试管中分别加入1.5mL的10g/L羧甲基纤维素钠溶液(pH 6.0，0.2mol/L磷酸缓冲液配制)和0.5mL粗酶液，50℃水浴保温30min，然后加入3mL的DNS试剂，煮沸5min，流水冷却后加去离子水定容至10mL，摇匀；用100℃煮沸10min后失活的粗酶液做相同处理为参比，于分光光度计测定波长540nm处吸光度(A

纤维素酶活力按公式(2)计算。

公式(2)中，C：由标准曲线计算得到的葡萄糖浓度(μg/mL)；V

葡萄糖标准曲线的绘制：7支10-mL刻度试管中，分别加入浓度为1mg/mL的标准葡萄糖水溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL，然后各加入pH 6.0，0.2mol/L磷酸缓冲液2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8mL，再各加入DNS溶液3.0mL，混合液于沸水浴中煮沸5min，流水冷却后用去离子水定容至10mL，摇匀，于分光光度计测定A

DNS试剂的配制：6.3g的3,5-二硝基水杨酸、262mL浓度为2mol/L的NaOH水溶液加入到500mL含有182g酒石酸钠的热水溶液中，再加5g重蒸酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加去离子水定容至1L，贮于棕色瓶中，7d后使用。

实施例3：菌株AY2-19的分类鉴定

菌株AY2-19划线接种在马铃薯琼脂平板培养基上，28℃条件下培养，初期菌落呈白色絮状，3d后菌落颜色略有加深，菌丝层较厚，表面无孢子粉，背面无色素扩散。光学显微镜下可以观察到有大型分生孢子和小型分生孢子两种。大型分生孢子呈镰刀型或月牙形，3–5个隔膜，大小4–5×25–40μm；小型分生孢子较少，呈卵圆形或椭圆形，大小2.5–4×4.5–1μm。禾谷镰刀菌AY2-19划线接种在PDA平板培养基上28℃培养3d的菌落照片见图1。

测得菌株AY2-19的rDNA-ITS核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，该序列在NCBI(National Center for Biotechnology Information,https://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行BLAST比对，与77个Sporidiobolus(锁掷酵母)和Sporobolomyces(掷孢酵母)菌株有大于99％的同源性，显然，菌株AY2-19不是一株酵母菌，其菌落和分生孢子形态符合镰刀菌的特征，它的rDNA-ITS与一株禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum，Accession No.ON705448)的rDNA-ITS序列有99.45％的同源性，所以可以确定菌株AY2-19的生物学分类位置为(参考Mycobank，http://www.mycobank.org)：真菌界(Fungi)，子囊菌门(Ascomycota)，盘菌亚门(Pezizomycotina)，粪壳菌纲(Sordariomycetes)，肉座菌亚纲(Hypocreomycetidae)，肉座菌目(Hypocreales)，丛赤壳科(Nectriaceae)，镰刀菌属(Fusarium)，禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)。

所述菌株AY2-19的rDNA-ITS核苷酸序列为：

GTACATTTAACTTGGAACCCAAACTTCTCAATTCTAACTTTGTGCATCTGTATTAATGGCGAGCAACTTCGGTTGTGAGCCTTCACTTACAAAACACTAGTCTATGAATGTAAAATTTTTATAACAAATAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCATCTTGCGCTCTCTGGTATTCCGGAGAGCATGTCTGTTTGAGTGTCATGAATTCTTCAACCCAATCTTTTCTTGTAATCGATTGGTGTTTGGATTCTGAGCGTTGCTGGCGTTTGCCTAGCTCGTTCGTAATACATTAGCATCCCTAATACAAGTTTGGATTGACTTGGCGTAATAGACTATTCGCTAAGGATTCGGTGGAAACATCGAGCCAACTTCATTAAGGAAGCTCCTAATTTAAAAGTCTACCTTTTGATTAGATCTCAAATCAGGCAGGATTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAA。

综上，从艾叶粉微生物富集物中分离到菌株AY2，经紫外线诱变后，筛选获得了菌株AY2-19，即禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)AY2-19，该菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号GDMCC No:63062，保藏日期2022年12月20日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070。

实施例4：利用禾谷镰刀菌AY2-19酶解辅助提取艾叶总黄酮的应用

利用禾谷镰刀菌AY2-19酶解辅助提取艾叶中的总黄酮，可以按以下步骤操作：

(1)冻干管保存的禾谷镰刀菌AY2-19孢子粉，接种于新鲜PDA平板培养基，于28℃培养72h，加10mL无菌生理盐水于平板培养物中，用接种环搅动使孢子悬浮，得禾谷镰刀菌AY2-19的孢子液。所述的PDA平板培养基成分和配制方法同实施例1。

(2)用步骤(1)制备的孢子液3mL接种100mL产酶培养基(接种量为3％的体积分数)，于30℃、180r/min振荡条件下培养72h，得干菌体浓度为3.75g/L的发酵液。全部发酵液用布氏漏斗抽滤，收集的滤液即为粗酶液，滤液的纤维素酶活力为34.7U/mL。所述的产酶培养基终浓度组成同实施例1，250-mL三角烧瓶装100mL产酶培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。

(3)5g艾叶粉于250-mL三角烧瓶中，加入步骤(2)制备的粗酶液40mL[即料酶比为1:8(g:mL)]，搅拌均匀后于30℃水浴中酶解6h，得艾叶酶解物。

(4)步骤(3)全部艾叶酶解物中，加入10mL去离子水和50mL无水乙醇[体系料液比1:20(g:mL)，乙醇体积分数50％]。摇匀后于水温80℃、功率150W的超声清洗机中提取30min。超声醇提结束后，趁热布氏漏斗抽滤，得总黄酮提取液。

(5)步骤(4)制备的总黄酮提取液于45℃、–0.1MPa减压蒸馏至无液体流出，加10mL无水乙醇(按原料艾叶粉质量计的2mL/g)，充分振荡后转入离心管中，于8000r/min离心5min，上清液转入一洁净培养皿中，50℃、–0.1MPa真空干燥，得总黄酮提取物。

按上述步骤，得总黄酮提取物1.39g，总黄酮含量为31.7％，即得到总黄酮0.441g，提取得率为8.82％。

对比例1：未经酶解的艾叶总黄酮提取(与实施例4对比)

(1)5g艾叶粉于250-mL三角烧瓶中，加入50％体积分数的乙醇100mL[体系料液比1:20(g:mL)]。摇匀后于水温80℃、功率150W的超声清洗机中提取30min。超声醇提结束后，趁热布氏漏斗抽滤，得总黄酮提取液。

(2)步骤(1)制备的总黄酮提取液于45℃、–0.1MPa减压蒸馏至无液体流出，加10mL无水乙醇(按原料艾叶粉质量计的2mL/g)，充分振荡后转入离心管中，于8000r/min离心5min，上清液转入一洁净培养皿中，50℃、–0.1MPa真空干燥，得总黄酮提取物。

按上述步骤，得总黄酮提取物1.21g，总黄酮含量为29.6％，即得到总黄酮0.358g，提取得率为7.16％。

比较实施例4和对比例1的结果可以看出：在提取艾叶总黄酮前，增加了禾谷镰刀菌AY2-19发酵制备的粗酶液酶解，总黄酮提取得率由7.16％提高到8.82％，提高了23.2％。

实施例5：利用禾谷镰刀菌AY2-19酶解辅助提取艾叶总黄酮的应用

利用禾谷镰刀菌AY2-19酶解提取艾叶中的总黄酮，可以按以下步骤操作：

(1)4℃保存的禾谷镰刀菌AY2-19 PDA菌落孢子，接种于新鲜PDA平板培养基，于28℃培养68h，加10mL无菌生理盐水于平板培养物中，用接种环搅动使孢子悬浮，得禾谷镰刀菌AY2-19的孢子液。所述的PDA平板培养基成分和配制方法同实施例1。

(2)用步骤(1)制备的孢子液4mL接种100mL产酶培养基(接种量为4％的体积分数)，于30℃、200r/min振荡条件下培养68h，得干菌体浓度为3.84g/L的发酵液。全部发酵液用布氏漏斗抽滤，收集的滤液即为粗酶液，滤液的纤维素酶活力为35.8U/mL。所述的产酶培养基终浓度组成和配制方法同实施例4。

(3)10g艾叶粉于250-mL三角烧瓶中，加入步骤(2)制备的粗酶液60mL[即料酶比为1:6(g:mL)]，搅拌均匀后于28℃水浴中酶解5h，得艾叶酶解物。

(4)步骤(3)全部艾叶酶解物中，加入去离子水40mL和150mL无水乙醇[体系料液比1:25(g:mL)，乙醇体积分数60％]。摇匀后于水温85℃、功率150W的超声清洗机中提取40min。超声醇提结束后，趁热布氏漏斗抽滤，得总黄酮提取液。

(5)步骤(4)制备的总黄酮提取液于45℃、–0.1MPa减压蒸馏至无液体流出，加15mL无水乙醇(按原料艾叶粉质量计的1.5mL/g)，充分振荡后转入离心管中，于8000r/min离心8min，上清液转入一洁净培养皿中，50℃、–0.1MPa真空干燥，得总黄酮提取物。

按上述步骤，得总黄酮提取物2.67g，总黄酮含量为33.5％，即得到总黄酮0.894g，提取得率为8.94％。

对比例2：未经酶解的艾叶总黄酮提取(与实施例5对比)

(1)10g艾叶粉于500-mL三角烧瓶中，加入60％的乙醇250mL[体系料液比1:25(g:mL)]。摇匀后于水温85℃、功率150W的超声清洗机中提取40min。超声醇提结束后，趁热布氏漏斗抽滤，得总黄酮提取液。

(2)步骤(1)制备的总黄酮提取液于45℃、–0.1MPa减压蒸馏至无液体流出，加15mL无水乙醇(按原料艾叶粉质量计的1.5mL/g)，充分振荡后转入离心管中，于8000r/min离心8min，上清液转入一洁净培养皿中，50℃、–0.1MPa真空干燥，得总黄酮提取物。

按上述步骤，得总黄酮提取物2.35g，总黄酮含量为30.4％，即得到总黄酮0.714g，提取得率为7.14％。

比较实施例5和对比例2的结果可以看出：在提取艾叶总黄酮前，增加了禾谷镰刀菌AY2-19发酵制备的粗酶液酶解，总黄酮提取得率由7.14％提高到8.94％，提高了25.2％。

实施例6：利用禾谷镰刀菌AY2-19酶解辅助提取艾叶总黄酮的应用

利用禾谷镰刀菌AY2-19酶解提取艾叶中的总黄酮，可以按以下步骤操作：

(1)4℃保存的禾谷镰刀菌AY2-19 PDA菌落孢子，接种于新鲜PDA平板培养基，于28℃培养64h，加10mL无菌生理盐水于平板培养物中，用接种环搅动使孢子悬浮，得禾谷镰刀菌AY2-19的孢子液。所述的PDA平板培养基成分和配制方法同实施例1。

(2)用步骤(1)制备的孢子液5mL接种100mL产酶培养基(接种量为5％的体积分数)，于30℃、200r/min振荡条件下培养64h，得干菌体浓度为3.67g/L的发酵液。全部发酵液用布氏漏斗抽滤，收集的滤液即为粗酶液，滤液的纤维素酶活力为34.2U/mL。所述的产酶培养基终浓度组成和配制方法同实施例4。

(3)20g艾叶粉于500-mL三角烧瓶中，加入步骤(2)制备的粗酶液80mL[即料酶比为1:4(g:mL)]，搅拌均匀后于26℃水浴中酶解4h，得艾叶酶解物。

(4)步骤(3)全部艾叶酶解物中，加入120mL去离子水和300mL无水乙醇[体系料液比1:25(g:mL)乙醇体积分数60％，]。摇匀后于水温85℃、功率150W的超声清洗机中提取45min。超声醇提结束后，趁热布氏漏斗抽滤，得总黄酮提取液。

(5)步骤(4)制备的总黄酮提取液于45℃、–0.1MPa减压蒸馏至无液体流出，加20mL无水乙醇(按原料艾叶粉质量计的1mL/g)，充分振荡后转入离心管中，于8000r/min离心10min，上清液转入一洁净培养皿中，50℃、–0.1MPa真空干燥，得总黄酮提取物。

按上述步骤，得总黄酮提取物5.42g，总黄酮含量为32.7％，即得到总黄酮1.77g，提取得率为8.85％。

对比例3：未经酶解的艾叶总黄酮提取(与实施例6对比)

(1)20g艾叶粉于500-mL三角烧瓶中，加入60％的乙醇500mL[体系料液比1:25(g:mL)]。摇匀后于水温85℃、功率150W的超声清洗机中提取45min。超声醇提结束后，趁热布氏漏斗抽滤，得总黄酮提取液。

(2)步骤(1)制备的总黄酮提取液于45℃、–0.1MPa减压蒸馏至无液体流出，加20mL无水乙醇(按原料艾叶粉质量计的1mL/g)，充分振荡后转入离心管中，于8000r/min离心10min，上清液转入一洁净培养皿中，50℃、–0.1MPa真空干燥，得总黄酮提取物。

按上述步骤，得总黄酮提取物4.67g，总黄酮含量为30.8％，即得到总黄酮1.44g，提取得率为7.20％。

比较实施例6和对比例3的结果可以看出：在提取艾叶总黄酮前，增加了禾谷镰刀菌AY2-19发酵制备的粗酶液酶解，总黄酮提取得率由7.20％提高到8.85％，提高了22.9％。