一种紫菜条件致病菌

技术领域

本发明属于养殖海藻病害防治技术领域，具体涉及一种紫菜叶状体和丝状体的条件致病菌。

背景技术

紫菜(Porphyra sensu lato)是我国重要的栽培海藻，每年的产值超百亿。其生产过程包括丝状体室内培育和叶状体海区养殖两个阶段。随着生产规模不断扩大，紫菜产业也面临诸多困难。一是种质退化与管养不当等问题愈加突出。二是紫菜育苗与海区栽培期间病害频发，产量和质量下降。据不完全统计，每年因紫菜病害造成的经济损失上亿元。

紫菜病害病因复杂，通常由多种病原体引发，发病早期病征呈现缓慢且不易被发觉。然而，当病斑或病烂可见时，往往已经进入到病程急剧恶化阶段，此时病害发展非常迅速且难以控制。此外，由不同致病菌导致的紫菜病害的表征可能均为紫菜细胞失色、贝壳丝状体出现黄斑或白斑，叶片病烂，不同种类病害的病征可能难以区分。病害发生的过程中，藻际微生物区系会发生剧烈变化。环境变化，微生物群落失衡可能导致一些起初对藻类生长无害的微生物转变成为病原菌，即条件致病菌。这使得紫菜病害致病因素更加复杂多变，为紫菜病害防控工作带来巨大困难，因此，发现条件致病菌对紫菜病害防控工作具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种紫菜叶状体和丝状体的条件致病菌，通过对该致病菌的研究可用于紫菜复杂病害的病因探究，有利于紫菜潜在病害的防控技术优化。

本发明首先提供一种紫菜叶状体和丝状体的条件致病菌粘液弧菌(Vibrio sp.)NH-13株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.25727，保藏日期为2022年09月13日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

所述的NH-13株的16S序列为SEQ ID NO:1；

本发明所提供的菌株可用于检测紫菜叶状体和丝状体的养殖方法的筛选评价中，用于确定避免紫菜发病的养殖条件。

本发明所提供的菌株还可应用于藻类抗病品系育种的筛选。

本发明所提供的菌株可应用于藻类病害诊断芯片的制作。

本发明所筛选获得的紫菜叶状体和丝状体的条件致病菌粘液弧菌可导致紫菜色素体解体和细胞空胞化。该菌株的分离发现有利于紫菜疾病预警工作推进，可以用于筛选具有抗病性的紫菜品系。

附图说明

图1：菌株NH-13感染紫菜叶状体的病程观察照片图；

图2：菌株NH-13感染紫菜贝壳丝状体的病程观察照片图；

图3：菌株NH-13及其近缘物种的16S rRNA基因序列的最大似然进化树图，其中Vibrio gallicus为外类群。

图4：基于NH-13菌株基因组OrthoANI值生成的UPGMA树和热图；

图5：粘液弧菌NH-13透射电镜镜检图；

图6：粘液弧菌NH-13透射电镜镜检图，其中C：叶绿体；M：线粒体；P：蛋白核；V：弧菌Vibrio mytili NH-13；W：细胞壁；N：细胞核；Fs：淀粉核；Plg：质体小球；Pit：孔状联系。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明进行详细的描述。

实施例1：致病菌的分离与纯化

2021年11月从健康的浙江瞻岐某紫菜育苗场“浙东1号”紫菜中分离细菌。用灭菌海水(使用玻璃纤维滤膜过滤，加热至沸腾，持续沸腾5min后冷却待用)将紫菜表面冲洗3～5次，然后用灭菌棉球(经湿热灭菌)擦干。取10mg紫菜置于装有1mL灭菌海水的匀浆研磨管中进行研磨。随后用灭菌海水将匀浆梯度稀释至10

分别配置盐度28‰的R

使用寡营养富集法培养紫菜附生细菌。取500μL上述稀释藻体匀浆溶液接种于50mL已灭菌的1/10R

经紫菜叶状体和贝壳丝状体感染实验发现，上述寡营养富集法培养5天，并纯化分离获得菌株NH-13具有致病性。

实施例2：菌株致病的研究

从-80℃取出NH-13菌种，接种于1/10R

感染所用的坛紫菜叶状体由浙江省海洋生物工程重点实验室藻种库提供。使用无菌海水培养叶状体，加入宁大三号母液，最终培养基中的营养物浓度为100mg/L KNO

感染所用坛紫菜贝壳丝状体由浙江省海洋生物技术重点实验室藻种库提供。取三个以上长势相同的坛紫菜贝壳丝状体，加入上述浓度的菌液至没过贝壳，感染过程中及时补充菌悬液。感染条件同上。感染后每天观察贝壳丝状体形态，拍照记录。如图2所示，染病初期(0d～10d)，紫菜丝状体贝壳的中心或边缘出现漂白的条纹或斑块。病程发展较缓慢。发病后期(20d～30d)，患病贝壳被完全漂白，且表面粗糙，珍珠层严重破损，30d对照组贝壳丝状体未出现白化现象。

实施例3：NH-13的16S rRNA编码序列分析、全基因组测序与菌株特征

挑取NH-13平板上的单菌落进行菌落PCR，用以下引物(序列信息为：27F：5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1429R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')进行16S rRNA的PCR扩增，送测。测序结果经过NCBI和系统发育树比对(图3)，鉴定该菌属于Vibrio属。该菌16S序列为SEQ ID NO:1：

AAATTGAAGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGC

AAGTCGAGCGGAAACGAGTTAACTGACCCTTCGGGGAACGTTAACGGCGTCGAGCGG

CGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAAATTGCCCTGATGTGGGGGATAACCATTGGAAAC

GATGGCTAATACCGCATGATGCCTTCGGGCCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTCGC

GTCAGGATATGCCTAGGTGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAGGGCTCACCAAGGCGA

CGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAG

ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGC

CATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCAGTGAGGAAG

GGGTGTGTGTTAATAGCGCACATCTTTGACGTTAGCTGCAGAAGAAGCACCGGCTAAC

TCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGC

GTAAAGCGCATGCAGGTGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAAAGCCCGGGGCTCAACCTCG

GAATAGCATTTGAAACTGGCAGACTAGAGTACTGTAGAGGGGGGTAGAATTTCAGGTG

TAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGATGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGA

CAGATACTGACACTCAGATGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGT

AGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTTGGAGGTTGTGGCCTTGAGCCGTGGCTTTCGG

AGCTAACGCGTTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAATG

AATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAA

GAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTTCCTGAGATGGATTGGTGCCTTCGGG

AACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTA

AGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTGTTTGCCAGCGAGTCATGTCGGGAACTC

CAGGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATG

GCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAGAGGGCAGCCAACT

TGCGAGAGTGAGCGAATCCCACAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTC

GACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTT

CCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGCTGCAAAAGAAGTAG

GTAGTTTAACCTTCGGGGGGACGCTTACCACTTTGTGGTTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCGCTAGGGGAACCTGGCGCTGGATCACCTCCTTA。

将50mL的NH-13菌液送至武汉菲沙基因信息有限公司进行全基因组第三代测序。测序结果通过ANI Calculator分析，将菌株命名为粘液弧菌Vibrio mytili NH-13株(图4)。菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.25727，保藏日期为2022年9月13日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

粘液弧菌(Vibrio mytili)NH-13株菌落不透明，乳白色，表面凸起，且边缘规则。透射电镜显示粘液弧菌NH-13呈椭圆形，具有粗壮的单根鞭毛(图5)。使用弧菌科细菌生化鉴定管(中国杭州微生物试剂有限公司)进行生化测试，根据说明评估了粘液弧菌NH-13的生长和代谢特性，葡萄糖，蔗糖，阿拉伯糖，精氨酸双水解酶均呈阳性。

实施例4：基于透射电镜的NH-13的病理特征观察

感染所用坛紫菜自由丝状体由浙江省海洋生物工程重点实验室藻种库提供。在感染实验之前，将丝状体打碎至200μm～300μm的长度，恢复一周后使用抗生素进行无菌处理。培养条件及抗生素无菌处理过程同实施例1。取适量经预处理的坛紫菜自由丝状体于锥形瓶中，加入50mL菌液与其共培养。空白实验组加入50mL灭菌营养海水共培养。培养条件为：温度25℃，光照强度30μmol·photons·m

选取粘液弧菌NH-13侵染的紫菜丝状体，重复实施例1致病菌的分离、纯化步骤，经16S rRNA分子鉴定是同一株细菌。科赫法则验证该菌株是紫菜的致病菌。

本发明的菌株粘液弧菌NH-13分离自健康的紫菜叶状体，经感染实验证实，可导致紫菜叶状体和丝状体死亡，为一种条件致病菌。该致病菌可用于紫菜复杂病害的病因探究，本发明所提供的菌株可应用于藻类疾病防控和抗病品系育种的筛选。