一种近场直写静电纺丝3D仿生腱骨修复支架及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种近场直写静电纺丝3D仿生腱骨修复支架及其制备方法，属于骨组织修复及重建领域。

背景技术

许多研究提出了促进腱骨界面再生的方法，如使用骨诱导生长因子、用骨膜或高分子生物材料包裹移植物、基于干细胞的治疗和组织工程支架。尽管没有一个标准化的方法被证明是非常有效的，但构建负载干细胞的生物可降解支架为改善肌腱到骨骼的愈合带来了很大的希望。

近年来，静电纺丝技术制备的纳米纤维支架在肌腱-骨组织工程领域越来越受欢迎。静电纺丝纳米纤维膜是有良好生物相容性的生物可降解聚合物，其具有高表面/体积比和模仿细胞外基质(ECM)分层结构的潜力。这些特性使静电纺丝纳米纤维非常适合作为组织工程应用的支架。各种各样的材料(天然的和合成的)已经被用于静电纺丝，如聚己内酯(PCL)、聚乳酸(PLLA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、胶原蛋白和明胶等。由于PLLA所需打印温度较高，降解速率慢，而PLGA虽然降解快但粘性大，脆性高，无法满足构建3D立体支架要求，所以本发明选择降解速率适中、弹性较好的PCL作为打印材料。

已有许多研究证实PCL静电纺丝支架在体外的诱导成骨及成腱效果，但这些支架存在孔隙率低、结构单一以及负载细胞量少、细胞分布不均等缺点，无法满足体内肌腱与骨同时修复的需求，胶原蛋白和明胶虽然具有更好的仿生性能，但成纤能力较差，通常要加入其他合成聚合物来提高成纤性能。

综上所述，开发一种低成本、生物相容性好、可负载干细胞、诱导干细胞定向分化、手术植入方便的组织工程仿生支架对我国卫生事业发展具有重要意义。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种近场直写静电纺丝3D仿生腱骨修复支架及其制备方法。

本发明采取的技术方案如下：

一方面，本发明提供一种近场直写静电纺丝3D仿生腱骨修复支架，该支架由静电纺丝纳微纤维、PCL外骨架以及静电纺丝纳微纤维表面负载的羟基磷灰石与COL1组成。

进一步的，所述静电纺丝纳微纤维为具有结构梯度的多层结构，其使用近场直写技术打印制成，所述PCL外骨架采用3D打印而成，制成后的支架为具有一定强度的圆柱立体支架。

进一步的，使用近场直写技术打印的静电纺丝纳微纤维直径、排列和间距可控，纳微纤维直径为1-10μm，细胞易于攀附其上，纤维间距为150μm，便于骨和肌腱长入。

进一步的，所述支架具有结构分层和成分分层，分别对应促进成骨及促进成腱功能。

更进一步的，所述结构分层通过静电纺丝纳微纤维有序、无序排列实现，成分分层通过有序纤维表面负载COL1、无序纤维表面负载羟基磷灰石实现。

更进一步的，所述有序纤维表面负载COL1和无序纤维表面负载羟基磷灰石通过COL1-乙酸溶液浸泡法、模拟体液浸泡法制备得到。

另一方面，本发明还提供一种近场直写静电纺丝3D仿生腱骨修复支架的制备方法，其包括如下步骤：

步骤一、通过EFL-Potato E软件设计出支架的单层结构；

步骤二、使用普通打印模式打印一层PCL外骨架；

步骤三、使用近场直写模式打印在外骨架上打印具有结构梯度的多层纳微纤维；此时打印出的支架为复合薄层结构；

步骤四、制备I型胶原乙酸溶液、将复合薄层支架放入I型胶原溶液，浸泡后取出冻干，获得包被COL1的纺丝支架；

步骤五、制备明胶溶液和模拟体液，使用明胶溶液覆盖负载支架的纤维有序排列部分，然后待明胶溶液温度逐渐降低形成胶冻后，再在常温下将支架放入模拟体液中，加入碳酸氢钠调整溶液PH至6-7，然后放置一段时间，使羟基磷灰石沉积附着于支架无序部分；

步骤六、取出支架溶解明胶，再进行冻干，获得包被COL1和羟基磷灰石的纺丝支架；

步骤七、体式显微镜下将薄层支架卷成三维立体支架，且尾部作封边处理。

进一步的，所述PCL外骨架的直径200-300μm；所述纳微纤维为20层，且直径1-10μm，纺丝间距150μm。

进一步的，所述步骤四中，将0.5g I型胶原溶于100ml 2％乙酸溶液，制备0.5％I型胶原乙酸溶液；再将复合薄层支架放入0.5％I型胶原乙酸溶液，室温浸泡3h，取出支架，去离子水冲洗去除多余COL1溶液，冻干机冻干24h得到负载COL1支架。

进一步的，所述步骤五中，使用10％明胶溶液和10倍浓度模拟体液。

进一步的，所述步骤六中，取出支架放入PBS溶液中，50℃水浴3min，待支架上的明胶脱落溶解后取出支架，放入冻干机冻干24h，获得有序部分纤维负载COL1及无序部分纤维负载羟基磷灰石复合薄层支架。

本发明的有益效果是：

(1)微结构可控特性：本发明使用近场直写技术打印静电纺丝纳微纤维，相较于传统的静电纺丝支架，本支架的纤维直径、排列和间距可控。纤维直径可通过调整打印喷头和平台距离以及打印电压调控，纤维排列和间距可通过EFL-Potato E软件设计代码调控。本支架纤维直径设计为1-10μm，明显小于细胞直径，使细胞易于攀附其上，纤维间距为150μm，便于骨和肌腱长入。亦可根据不同的接种细胞和所需修复组织调整纤维排列和间距。

(2)仿生特性：本发明根据腱骨交界处的生理结构设计支架结构，使支架具有分层结构，成腱部分使纤维呈有序排列，成骨部分使纤维呈无序排列。同时根据腱骨交界处不同组织的化学成分不同设计支架不同结构的表面修饰，使成腱部分纤维负载大量有序排列的COL1，成骨部分负载大量的羟基磷灰石，从而使支架的结构和成分达到仿生的效果。

(3)良好的生物安全性和促进干细胞分化特性：本发明所用的PCL材料广泛用于3D生物打印，安全性已被证实，支架纤维表面所负载的COL1和羟基磷灰石与生物体内所含具有同源性，安全性可靠，通过支架纤维表面修饰明显提高了支架的亲水性和生物相容性。另外，静电纺丝纳微纤维直径较细，易于干细胞粘附、迁移，仿生设计的支架微结构及微环境可使干细胞在支架不同结构上向不同方向分化，最终达到促进肌腱与骨一体化修复的效果。

附图说明

图1为近场直写静电纺丝打印平台示意图；

图2为EFL-Potato E软件支架平面设计图；

图3为打印完成的PCL外骨架+多层纺丝的薄层正面结构图；

图4为打印完成的PCL外骨架+多层纺丝的薄层侧面结构图；

图5为立体支架的解释示意图，其中：1-PCL外骨架，2-静电纺丝纳微纤维，3-I型胶原(COL1)，4-羟基磷灰石；

图6为支架纳微纤维有序部分(a)和无序部分(b)的电镜扫描图；

图7为支架纳微纤维有序部分负载COL1(a)和无序部分负载羟基磷灰石(b)的电镜扫描图；

图8为人脂肪间充质干细胞(hADSCs)在支架纳微纤维有序部分(a)及无序部分(b)扫描电镜图；

图9为人脂肪间充质干细胞(hADSCs)在未修饰及修饰支架不同部分的增殖情况；

图10为体内实验支架植入肌腱损伤处示意图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

一种近场直写静电纺丝3D仿生腱骨修复支架，由静电纺丝纳微纤维、PCL外骨架、纳微纤维表面负载的羟基磷灰石与I型胶原(COL1)组成。

所述的3D仿生腱骨修复支架，使用近场直写技术打印出具有结构梯度的多层静电纺丝纳微纤维，底部通过3D打印一层PCL外骨架，将静电纺丝纳微纤维制备成具有一定强度的圆柱立体支架。静电纺丝纳微纤维直径、排列和间距可控，纳微纤维直径为1-10μm，细胞易于攀附其上，纤维间距为150μm，便于骨和肌腱长入。

所述的支架具有结构分层和成分分层，分别对应促进成骨及促进成腱功能。支架结构分层通过纳微纤维有序、无序排列实现，成分分层通过有序纤维表面负载COL1、无序纤维表面负载羟基磷灰石实现。

所述的纤维表面负载COL1、羟基磷灰石分别通过COL1-乙酸溶液浸泡法、模拟体液浸泡法制备得到。

实施例2

一种近场直写静电纺丝3D仿生腱骨修复支架的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)PCL外骨架、静电纺丝复合薄层结构制备：通过EFL-PotatoE软件设计出支架的单层结构，普通打印模式打印PCL外骨架，直径200-300μm；近场直写模式打印静电纺丝(图1)，直径1-10μm，纺丝间距150μm，打印1层骨架、20层纺丝的复合薄层结构(图2、3、4)

(2)制备0.5％COL1溶液：量取2ml 99.9％乙酸溶液，溶于98ml纯水中得到2％乙酸溶液。称量0.5g COL1粉末，溶于100ml 2％乙酸溶液，配制成0.5％COL1溶液。

(3)制备10％明胶溶液：称量10g明胶粉末，搅拌溶解于50℃纯水中，配制成10％明胶溶液，此浓度明胶溶液在常温下呈胶冻状，50℃时呈液体状。

(4)制备10倍浓度模拟体液：分别称量116.886g NaCl，0.7456g KCl，7.3508gCaCl2·2H2O，2.033g MgCl2·6H2O和2.3996g NaH2PO4，按顺序逐一溶解于去离子水中，溶液最终定量为2L，溶液PH 4-4.5。

(5)负载COL1支架制备：将复合薄层支架放入0.5％COL1溶液，室温浸泡3h，取出支架，去离子水冲洗去除多余COL1溶液，冻干机冻干24h得到负载COL1支架。

(6)负载羟基磷灰石支架制备：冰上操作，使用50℃10％明胶溶液覆盖负载COL1支架纤维有序排列部分，待明胶溶液温度逐渐降低形成胶冻后将支架放入常温10倍浓度模拟体液中，加入NaHCO3调整溶液PH至6.5左右，室温静置3h，使模拟体液中形成的羟基磷灰石充分包被支架无序部分纳微纤维表面。取出支架放入PBS溶液中，50℃水浴3min，待支架上的明胶脱落溶解后取出支架，放入冻干机冻干24h，获得有序部分纤维负载COL1及无序部分纤维负载羟基磷灰石复合薄层支架。

(7)立体支架的制备：体式显微镜下将薄层支架卷成直径4mm,高3.5mm的立体圆柱支架，尾部使用热塑法封边。

(8)将制备好的支架进行电镜扫描，可见支架结构分为纤维有序排列部分和无序排列部分(如图6)，包被了COL1的支架有序部分纤维表面可见明显皱褶，包被了羟基磷灰石的支架无序部分纤维表面可见磷酸盐结晶聚集(如图7)。

(9)制备好的支架放入75％酒精浸泡1h，紫外线照射2h消毒，负压吸附法将hADSCs接种于消毒好的支架上，培养3天后取出制样进行电镜扫描(如图8)，可见细胞在支架有序部分沿着纤维排列方向呈单向生长，在无序部分生长方向杂乱。

(10)采用CCK-8法检测hADSCs在支架各部分增殖活性，可见细胞在各组支架上均生长增殖良好，体现支架良好的生物相容性(图9)。

(11)通过手术将制备好的3D仿生腱骨修复支架植入腱骨交界损伤处(如图10)。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本领域的普通技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明的保护范围，凡采用等同替换等方式所获得的技术方案，均落于本发明的保护范围内。

本发明未涉及部分均与现有技术相同或可采用现有技术加以实现。