双特异性GD2和B7H2结合分子及使用方法

1.相关申请的交叉引用

本申请要求2020年2月20日提交的美国临时申请号62/979,245的优先权和权益，该申请特此通过引用以其整体并入本文。

2.序列表

本申请包含已通过EFS-Web提交的序列表，并在此通过引用以其整体并入本文。所述ASCⅡ副本，创建于2021年XX月，被命名为XXXXXUS_sequencelisting.txt，且大小为X,XXX,XXX字节。

3.背景

神经节苷脂2(GD2)在许多实体瘤上以及周围神经系统中表达。使用抗GD2单克隆抗体地努妥昔单抗治疗是目前对神经母细胞瘤患者的标准治疗。然而，地努妥昔单抗给被治疗的患者带来极度疼痛，严重限制其疗效。

B7同源物3(B7H3)，也称为分化簇276(CD276)，在许多实体瘤上高表达，但在神经细胞上不表达。B7H3表达与人类患者的不良预后以及体外模型中肿瘤的侵袭和转移潜力有关。

对于表达GD2和B7H3的肿瘤细胞，存在对具有高特异性的癌症治疗的需求。

4.概述

本公开提供了多种抗体构建体、药物组合物和治疗方法。

在第一方面，本发明提供了多特异性抗体构建体，其包含对第一肿瘤细胞表面抗原特异的第一抗原结合位点(ABS)，其中所述第一肿瘤细胞抗原是B7同源物3(B7H3)，并且还包含对第二肿瘤细胞表面抗原特异的第二ABS，其中所述第二肿瘤细胞抗原为双唾液酸神经节苷酯(GD2)。

在一些实施方案中，第一ABS以大于10nM的平衡解离常数(KD)与人B7H3结合，第二ABS以大于10nM的KD与人GD2结合，且该抗体构建体以小于100nM的K

在一些实施方案中，相比表达GD2和B7H3的细胞，抗体构建体表现出与表达GD2但不表达B7H3的细胞的较低结合。

在优选的实施方案中，与相当浓度的地努妥昔单抗相比，抗体构建体与神经细胞的结合更少。

在一些实施方案中，抗体构建体的第一ABS包含第一重链可变区(VH)CDR1、第一VHCDR2、第一VH CDR3、第一轻链可变区(VL)CDR1、第一VL CDR2和第一VL CDR3。在特定的实施方案中，第一ABS包含具有SEQ ID NO:22氨基酸序列的第一VH CDR1、具有SEQ ID NO:27氨基酸序列的第一VH CDR2、具有SEQ ID NO:32氨基酸序列的第一VH CDR3、具有SEQ ID NO:7氨基酸序列的第一VL CDR1、具有SEQ ID NO:12氨基酸序列的第一VL CDR2和具有SEQ IDNO:17氨基酸序列的第一VL CDR3。在优选的实施方案中，第一ABS包含具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的第一重链可变区(VH)和具有SEQ ID NO:1氨基酸序列的第一轻链可变区(VL)。

在一些实施方案中，抗体构建体的第二ABS包含第二重链可变区(VH)CDR1、第二VHCDR2、第二VH CDR3、第二轻链可变区域(VL)CDR1、第二VL CDR2和第二VL CDR3。在特定的实施方案中，第二ABS包含具有SEQ ID NO:57氨基酸序列的第二VH CDR1、具有SEQ ID NO:62氨基酸序列的第二VH CDR2、具有SEQ ID NO:67氨基酸序列的第二VH CDR3、具有SEQ IDNO:42氨基酸序列的第二VL CDR1、具有SEQ ID NO:47氨基酸序列的第二VL CDR2和具有SEQID NO:52氨基酸序列的第二VL CDR3。在优选的实施方案中，第二ABS包含具有SEQ ID NO:4氨基酸序列的第二重链可变区(VH)和具有SEQ ID NO:3氨基酸序列的第二轻链可变区(VL)。

在一些实施方案中，抗体构建体包括第一、第二、第三和第四多肽链，其中：第一多肽链包含结构域A、结构域B、结构域D和结构域E，其中这些结构域从N-端到C-端以A-B-D-E方向排列，其中结构域A包含可变区结构域氨基酸序列，并且其中结构域B、结构域D和结构域E各自包含恒定区结构域氨基酸序列；第二多肽链包含结构域F和结构域G，其中这些结构域从N-端到C-端以F-G方向排列，并且其中结构域F具有可变区结构域氨基酸序列且结构域G包含恒定区结构域氨基酸序列；第三多肽链包含结构域H、结构域I、结构域J和结构域K，其中这些结构域从N-端到C-端以H-I-J-K方向排列，其中结构域H具有可变区结构域氨基酸序列，并且其中结构域I、结构域J和结构域K各自具有恒定区氨基酸序列；第四多肽链包含结构域L和结构域M，其中这些结构域从N-端到C-端以L-M方向排列，并且其中结构域L具有可变区结构域氨基酸序列且结构域M包含恒定区氨基酸序列或其部分；第一多肽和第二多肽通过A结构域和F结构域之间的相互作用以及B结构域和G结构域之间的相互作用结合；第三多肽和第四多肽通过H结构域和L结构域之间的相互作用以及I结构域和M结构域之间的相互作用结合；且第一多肽和第三多肽通过D结构域和J结构域之间的相互作用以及E结构域和K结构域之间的相互作用结合。在一些实施方案中，结构域A是V

在一些实施方案中，结构域B具有带有T366K突变的CH3氨基酸序列和掺入KSC三肽序列(其后是IgG1铰链区的DKTHT基序)的C-端延伸序列；结构域E具有带有S354C和T366W突变的CH3氨基酸序列；结构域G具有带有L351D突变的CH3氨基酸序列和掺入GEC氨基酸二硫化基序的C-端延伸序列；且结构域K具有带有Y349C、T366S、L368A、Y407V突变以及任选的D356E和L358M突变的CH3氨基酸序列。

在一些实施方案中，结构域B具有CH3氨基酸序列和掺入KSC三肽序列(其后是IgG1铰链区的DKTHT基序)的C-端延伸序列；结构域E具有带有S354C和T366W突变的CH3氨基酸序列；结构域G具有CH3氨基酸序列和掺入GEC氨基酸二硫化基序的C-端延伸序列；且结构域K具有带有Y349C、T366S、L368A、Y407V突变以及任选的D356E和L358M突变的CH3氨基酸序列。

在一些实施方案中，结构域B具有带有Y349C突变的CH3氨基酸序列和掺入PGK三肽序列(其后是IgG1铰链区的DKTHT基序)的C-端延伸序列；结构域E具有带有S354C和T366W突变的CH3氨基酸序列；结构域G具有带S354C突变的CH3氨基酸序列和掺入PGK三肽序列的C-端延伸序列；且结构域K具有带有Y349C、T366S、L368A、Y407V突变以及任选的D356E和L358M突变的CH3氨基酸序列。

在一些实施方案中，结构域B具有带有P343V突变的CH3氨基酸序列和掺入PGK三肽序列(其后是IgG1铰链区的DKTHT基序)的C-端延伸序列；结构域E具有带有S354C和T366W突变的CH3氨基酸序列；结构域G具有带S354C突变的CH3氨基酸序列和掺入PGK三肽序列的C-端延伸序列；且结构域K具有带有Y349C、T366S、L368A、Y407V突变以及任选的D356E和L358M突变的CH3氨基酸序列。

在一些实施方案中，第一ABS由结构域A和结构域F形成，且第二ABS由结构域H和结构域L形成。

在一些实施方案中，抗体构建体与治疗剂缀合。

在另一方面，本文公开了药物组合物，其包含有效量的本文所述的多特异性抗体构建体和药学上可接受的载体。

在另一方面，本文公开了治疗人类受试者的增殖性疾病的方法，其包括向人类受试者施用包含有效量的本文所述抗体构建体的药物组合物。在一些实施方案中，增殖性疾病是癌症。在一些实施方案中，癌症是神经母细胞瘤、成胶质细胞瘤、小细胞肺癌或肉瘤。

在一些实施方案中，与用抗GD2单克隆抗体治疗相比，施用所述药物组合物导致疼痛减轻。在一些实施方案中，抗GD2单克隆抗体是地努妥昔单抗或hu14.18。

在另一方面，本文公开了选择性靶向受试者中肿瘤细胞的方法，其包括向受试者施用包含有效量的本文所述抗体构建体的药物组合物。

5.附图简要说明

关于以下描述和附图，本发明的这些和其他特征、方面和优点将变得更好理解，其中：

图1是一张幻灯片，其概述了对本文公开的抗体构建体的需求，以及被本文公开的抗体构建体满足的解决该需求的方法。

图2确立了创建本文公开的抗体构建体的目标。

图3A、图3B、图3C和图3D是比较抗GD2抗体与神经母细胞瘤和外周神经细胞(图3B)上的GD2抗原(图3A)的结合和抗GD2 x B7H3SNIPER

图4概述了用于产生本文公开的抗体构建体的项目工作流程。

图5确立了本文公开的抗体构建体所期望的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)标准。

图6提供了两种GD2抗原结合分子的氨基酸序列。

图7概述了GD2结合测定的方案，以评估潜在的GD2结合分子与表达GD2的肿瘤细胞的结合。

图8提供了评估四种抗GD2抗体与表达GD2和B7H3的M21黑色素瘤细胞结合的测定结果。

图9提供了评估四种抗GD2抗体与表达GD2和B7H3的M21和B78黑素瘤细胞结合的测定结果。

图10确定了所评估的B7H3结合分子的数量和仍为本文公开的抗体构建体候选物的B7H3结合分子的数量。

图11概述了B7H3结合测定的方案，以评估潜在的B7H3结合分子与表达B7H3的肿瘤细胞的结合。

图12提供了评估四种抗B7H3抗体与表达GD2和B7H3的M21黑色素瘤细胞和B16细胞结合的测定结果。

图13提供了评估四种抗B7H3抗体和三种抗GD2抗体与B16和B78细胞结合的测定结果。

图14总结了所评估的GD2和B7H3结合分子。

图15提供了评估六种GD2 x B7H3双特异性抗体和抗GD2单克隆抗体地努妥昔单抗与M21黑色素瘤细胞结合的测定结果。

图16提供了评估四种GD2 x B7H3双特异性抗体与B16细胞结合的测定结果。

图17总结了GD2 x B7H3双特异性抗体候选物的结合研究的初步结果。

图18提供了两种GD2抗原结合分子的氨基酸序列。

图19提供了多种候选GD2 x B7H3双特异性抗体的表位鉴定(epitope binning)的结果。

图20总结了候选GD2 x B7H3双特异性抗体的特征和特性。

图21概述了评估多种候选GD2 x B7H3双特异性抗体的结合的研究。

图22确立了在评估候选物GD2 x B7H3双特异性抗体中使用的色谱测定。

图23显示了GD2 x B7H3双特异性抗体候选物I7-01 x GD2-5的结合和色谱测定结果。

图24显示了GD2 x B7H3双特异性抗体候选物I7-01 x GD2-6的结合和色谱测定结果。

图25显示了GD2 x B7H3双特异性抗体候选物I7-09 x GD2-5的结合和色谱测定结果。

图26显示了GD2 x B7H3双特异性抗体候选物I7-09 x GD2-6的结合和色谱测定结果。

图27显示了GD2 x B7H3双特异性抗体候选物I7-10 x GD2-5的结合和色谱测定结果。

图28显示了GD2 x B7H3双特异性抗体候选物I7-10 x GD2-6的结合和色谱测定结果。

图29显示了GD2 x B7H3双特异性抗体候选物I7-19 x GD2-5的结合和色谱测定结果。

图30显示了GD2 x B7H3双特异性抗体候选物I7-19 x GD2-6的结合和色谱测定结果。

图31显示了GD2 x B7H3双特异性抗体候选物I7-20 x GD2-6的结合和色谱测定结果。

图32显示了GD2 x B7H3双特异性抗体候选物I7-33 x Gd2-5的结合和色谱测定结果。

图33显示了GD2 x B7H3双特异性抗体候选物I7-33 x GD2-6的结合和色谱测定结果。

图34显示了GD2 x B7H3双特异性抗体候选物I7-34 x GD2-5的结合和色谱测定结果。

图35显示了GD2 x B7H3双特异性抗体候选物I7-34 x GD2-6的结合和色谱测定结果。

图36显示了GD2 x B7H3双特异性抗体候选物I7-36 x GD2-5的结合和色谱测定结果。

图37显示了GD2 x B7H3双特异性抗体候选物I7-36 x GD2-6的结合和色谱测定结果。

图38鉴定了候选GD2 x B7H3双特异性抗体，通过抗体指导的细胞毒性(ADCC)测定进行验证。

图39总结了对候选GD2 x B7H3双特异性抗体的评价。

图40概述了用于评估候选GD2 x B7H3双特异性抗体疗效的抗体指导的细胞毒性(ADCC)测定的方案。

图41显示了多种候选GD2 x B7H3双特异性抗体的ADCC测定结果。

图42显示了多种候选GD2 x B7H3双特异性抗体的重复ADCC测定结果。

图43是用于评估疼痛的模型系统方案的示意图式概述。

图44显示了评估用抗GD2单克隆抗体地努妥昔单抗治疗后疼痛的试验性研究的结果。

图45总结了评估地努妥昔单抗治疗后疼痛的试验性研究的结果，并鉴定了候选GD2 x B7H3双特异性抗体以供进一步研究。

图46鉴定了GD2 x B7H3 SNIPER

图47鉴定了经修饰的GD2 x B7H3 SNIPER

图48总结了为评估候选GD2 x B7H3双特异性抗体进行的研究。

图49显示了比较各种GD2 x B7H6双特异性抗体候选物和地努妥昔单抗对表达GD2和B7H3(A)、仅GD2(B)或仅B7H4(C)的B78细胞的结合测定结果。(D)中显示了在用放射性标记的GD2×B7H3抗体候选物(I7-33×GD2-2)(上图)或放射性标记的非特异性对照抗体(双体(BBody))治疗后，荷表达GD2和B7H3的B78肿瘤的小鼠的正电子发射断层扫描(PET)图像。评估了放射性标记的I7-33 x GD2-2的生物分布，并与放射性标记的地努妥昔单抗的生物分布进行了比较；结果如(E)所示。

图50概述了为评估抗GD2、抗B7H3(GD2 x B7H3)双特异性SNIPER

图51呈现了本文所述多种二价抗体构建体的的示意性结构，具有相应的惯例命名。

图52A和图52B显示了INV721在表达肿瘤抗原GD2和B7H3的B78细胞中(图52A)和在表达GD2但不表达B7H3的B78细胞中(图52B)的结合测定结果。

图53是一个表格，其显示了肿瘤细胞表面抗原GD2和B7H3在各种儿童癌细胞系中的相对表达。

图54是一个表格，其显示了肿瘤细胞表面抗原GD2和B7H3在各种黑色素瘤细胞系中的相对表达。

图55A、图55B和图55C显示了评估INV721和抗GD2和抗B7H3单克隆抗体在各种儿童神经母细胞瘤细胞系中的内化的研究结果：CHLA20(图55A)、LAN-1(图55B)和NGP(图55C)。抗体内化导致总的红色物体积分强度(integrated intensity)增加。

图56A和图56B显示了用INV721治疗(图56A)或单独用INV721或抗GD2抗体Hu14.18治疗(图56B)的B78肿瘤球体的抗体指导的细胞毒性(ADCC)测定结果。用INV721治疗后，明亮致密信号的分散表明INV721通过ADCC抑制肿瘤生长。

图57A、图57B和图57C显示了评估用INV721和外周血单核细胞(PBMC)、单独INV721或单独PBMC治疗的B78肿瘤细胞的直接抗体介导的凋亡的测定结果。实验在表达GD2和B7H3的B78肿瘤细胞(图57A)、表达GD2但不表达B7H3的B78肿瘤细胞(图57B)和表达B7H3但不表达GD2(图57C)的B78肿瘤细胞中进行。

图58A、图58B和图58C显示了在表达GD2和B7H3的各种黑色素瘤细胞系中比较INV721和抗GD2抗体地努妥昔单抗和Hu14.18的ADCC测定结果：M21(图58A)、Mel7(图58B)和Mel13(图58C)。

图59显示了比较INV-721、抗GD2抗体地努妥昔单抗和GD2-7以及抗B7H4抗体I7-01在表达GD2和B7H3的M21细胞中的细胞毒性作用的ADCC测定结果。

图60是一个卡通图，其图示了被评估放射性标记的INV721和地努妥昔单抗结合的小鼠肿瘤的位置和GD2/B7H3表达状态。

图61显示了荷有差异化GD2和B7H3表达的四种肿瘤并使用放射标记的抗体治疗的小鼠的正电子发射断层扫描(PET)图像：INV721(上图)、非特异性对照(中图)和地努妥昔单抗(下图)。

图62A、图62B、图62C和图62D是显示在具有差异化GD2和B7H3表达：GD2-/B7H3+(图62A)、GD2-/B7H3-(图62B)、GD2+/B7H3-(图62C)和GD2+/B7H3+(图62D)的肿瘤中每克肿瘤每剂量注射的放射性标记抗体的活性比的图。

图63A显示了被评估放射性标记抗体沿其脊柱结合的小鼠的示例性图像。图63B显示了放射性标记抗体INV721和地努妥昔单抗的结合结果，其证明INV721与被治疗小鼠脊柱的结合显著少于地努妥昔单抗。

图64是用于评估INV721在小鼠B78黑色素瘤中的疗效的治疗方案的示意图式概述。

图65显示了荷B78黑色素瘤的小鼠在无治疗(分图1，从左数)、仅用放射疗法治疗(分图2)、用放射疗法和IL-2治疗(分图3)、用放射疗法和INV721治疗(分图4)以及用放射疗法、INV722和IL-2治疗(分图5)后肿瘤生长和抑制的结果。

图66显示了荷B78黑色素瘤的小鼠在无治疗、仅用放射疗法治疗、用放射疗法和IL-2治疗、用放射疗法和INV721(“I7-01/GD2-7”)治疗、用放射疗法和α-岩藻糖基化INV721(“A-Fuco I7-01/GD2-7”)治疗、用放射疗法和地努妥昔单抗(“Din”)治疗、用放射疗法、INV721和IL-2治疗、用放射疗法、α-岩藻糖基化INV721、INV721和IL-2治疗、用放射疗法、地努妥昔单抗和IL-2治疗后肿瘤生长和抑制的结果。

图67显示了荷B78黑色素瘤的小鼠在无治疗、仅用放射疗法治疗、用放射疗法和IL-2治疗、用放射疗法和INV721治疗以及用放射疗法、INV721和IL-2治疗后的总生存期。

6.发明详述

6.1.定义

除非本文另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。

如本文所用，以下术语具有以下赋予它们的含义。

“抗原结合位点”(“ABS”)是指抗体构建体特异性地识别或结合给定抗原或表位的区域。ABS和包含这种ABS的抗体构建体被称为“识别”ABS特异性结合的表位(或更通常地为抗原)，且表位(或者更通常地为，抗原)被称为ABS的“识别特异性”或“结合特异性”。

ABS被表述为以特定的亲和力与其特异性抗原或表位结合。如本文所述，“亲和力”是指一个分子与另一个分子之间的非共价分子间作用力的相互作用强度。亲和力，即相互作用的强度，可以用解离平衡常数(K

如本文所用，“特异性结合”是指ABS与其同源抗原或表位之间的亲和力，其中所述K

在多种多价抗体构建体的实施方案中，多个ABS全部具有相同的识别特异性。这种构建体是“单特异性的”、“多价的”抗体构建体。在其他多价实施方案中，多个ABS的至少两个具有不同的识别特异性。这种抗体构建体是多价的和“多特异性的”。在ABS总共具有两种识别特异性的多价实施方案中，结合分子是“双特异性的”。在ABS总共具有三种识别特异性的多价实施方案中，结合分子是“三特异性的”。

在ABS对存在于同一抗原上的不同表位总共具有多个识别特异性的多价实施方案中，抗体构建体是“多互补位的”。ABS共同识别同一抗原上的两个表位的多价实施方案是“双互补位的”。

在各种多价实施方案中，抗体构建体的多价提高了结合分子对特异性靶标的亲合力。如本文所述，“亲合力”是指两种或更多种分子之间相互作用的总体强度，例如用于特异性靶标的多价结合分子，其中所述亲合力是由多个ABS的亲和力提供的相互作用的累积强度。如上所述，亲合力可通过与测定亲和力所用方法相同的方法测量。在某些实施方案中，结合分子对特异性靶标的亲合力使得该相互作用是特异性结合相互作用，其中两个分子之间的亲合力具有低于10-

如本文所用，“双体(B-body)”是指如图51中所示的抗体构建体，其包括第一多肽链和第二多肽链，其中：(a)第一多肽链包含结构域A、结构域B、结构域D和结构域E，其中这些结构域从N-端到C-端以A-B-D-E方向排列，并且其中结构域A具有VL氨基酸序列，结构域B具有CH3氨基酸序列，结构域D具有CH2氨基酸序列，并且结构域E具有恒定区结构域氨基酸序列；(b)第二多肽链包含结构域F和结构域G，其中所述结构域从N-端到C-端以F-G方向排列，并且其中结构域F具有VH氨基酸序列，并且结构域G具有CH3氨基酸序列；和(c)将第一多肽和第二多肽通过A结构域和F结构域之间的相互作用以及B结构域和G结构域之间相互作用结合以形成抗体构建体。双体在US 2018/0118811和WO2019/204522中有更详细的描述，其公开内容通过引用以其整体并入本文。

本文所述的“正交修饰”或同义的“正交突变(orthogonal mutation)”是抗体结构域的氨基酸序列中的一种或更多种工程改造突变，与在没有正交修饰的情况下第一结构域和第二结构域的结合相比，其改变了具有正交修饰的第一结构域对具有互补正交修饰的第二结构域的结合亲和力。在一些实施方案中，与在没有正交修饰的情况下第一结构域和第二结构域的结合相比，正交修饰降低了具有正交修饰的第一结构域对具有互补正交修饰的第二结构域的结合亲和力。在一些实施方案中，与在没有正交修饰的情况下第一结构域和第二结构域的结合相比，正交修饰不改变具有正交修饰的第一结构域对具有互补正交修饰的第二结构域的结合亲和力。在优选的实施方案中，与在没有正交修饰的情况下第一结构域和第二结构域的结合相比，正交修饰增加了具有正交修饰的第一结构域对具有互补正交修饰的第二结构域的结合亲和力。在某些优选的实施方案中，正交修饰降低了具有正交修饰的结构域对缺乏互补正交修饰的结构域的亲和力。

在特定的实施方案中，正交修饰包括但不限于工程改造二硫键、旋钮入孔突变(knob-in-hole mutation)和电荷对突变，如下文更详细描述的。在特定的实施方案中，正交修饰包括选自但不限于工程改造二硫键、旋钮入孔突变和电荷对突变的正交修饰的组合。

6.2.其他解读惯例

除非另有规定，本文中对“序列”的所有引用指氨基酸序列。所谓“内源序列”或“天然序列”是指任何序列，包括根据上下文规定的来源于生物体、组织或细胞，且未被人工修饰或突变的核酸序列和氨基酸序列。

除非另有规定，抗体恒定区残基编号是根据www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html所述的Eu索引进行的(其被通过引用以其整体并入本文)，并根据其在内源性恒定区序列中的位置标识残基，不管残基在本文所述抗体构建体链中的物理位置。

除非另有规定，对互补决定区(CDR)的所有引用是Kabat定义的CDR。

术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等，当用于多肽链时(例如“第一”多肽链、“第二”多肽链等或多肽“链1”、“链2”等)，在本文中用作形成多聚体分子的特异性多肽链的唯一标识符，并且不意味着抗体构建体内不同多肽链的顺序或数量。

术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等，当用于CH3结构域时，用于指定特定结构域，并不意味着结构域的顺序或数量。

在本公开中，“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“含有(containing)”、“具有(having)”、“包括(includes)”、“包括(including)”及其语法变体具有美国专利法中赋予它们的含义，允许在明确叙述的成分之外存在额外成分。

本文提供的范围应理解为该范围内所有值的简写，包括所述的终点。例如，将1-50的范围理解为包括由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、35、36、37、38、40、41、42、43、44、45、46、48、49和50组成的组中的任何数字、数字组合或子范围。

除非特别说明或从上下文明显的，如本文所用术语“或”应理解为包括在内。除非特别说明或从上下文明显的，如本文所用，术语“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“所述/该(the)”应理解为单数或复数。

除非特别说明或另从上下文中明显的，如本文所用术语“约”应理解为在该领域的正常公差范围内，例如在平均值的2个标准偏差内。约可理解为在规定值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％以内。除非另有规定，“约”指在规定值的10％以内。

6.3.抗体构建体

本文公开了选择性结合肿瘤细胞表面抗原B7同源物3(B7H3)，也称为分化簇276(CD276)和双唾液酸神经节苷酯(GD2)的多特异性抗体构建体。优选地，多特异性抗体构建体选择性地与表达B7H3和GD2的肿瘤细胞结合。

在一些实施方案中，多特异性抗体构建体包括对第一肿瘤细胞表面抗原特异的第一抗原结合位点(ABS)和对第二肿瘤细胞表面抗原特异的第二抗原结合位点(ABS)。在一些实施方案中，第一ABS表现出对第一肿瘤细胞表面抗原的低结合亲和力。在一些实施方案中，第二ABS表现出对第二肿瘤细胞表面抗原的低结合亲和力。在一些实施方案中，第一ABS和第二ABS都分别表现出对第一肿瘤细胞表面抗原和第二肿瘤细胞表面抗原的低结合亲和力。低结合亲和力是指以高于10nM、高于20nM、优选高于50nM、更优选高于100nM、还更优选高于200nM的平衡解离常数(K

在一些实施方案中，第一ABS以高于10nM、高于20nM、优选高于50nM、更优选高于100nM、还更优选高于200nM的K

在一些实施方案中，第二ABS以高于10nM、高于20nM、优选高于50nM、更优选高于100nM、还更优选高于200nM的K

在一些实施方案中，第一ABS和第二ABS未表现出与任何其他抗原的可觉察到的结合亲和力。在一些实施方案中，第一ABS和第二ABS表现出的对非靶抗原的K

在特定的实施方案中，第一ABS以约5-200nM之间、优选约10-100nM之间、更优选约20-60nM之间或甚至更优选约20-40nM之间的K

在特定的实施方案中，第二ABS以约50-500nM之间、优选约100-400nM之间、更优选约100-300nM之间或甚至更优选约150-250nM之间的K

在一些实施方案中，多特异性抗体构建体以高亲合力与表达B7H3和GD2的靶肿瘤细胞结合。在一些实施方案中，多特异性抗体构建体以小于约500nM、小于约400nM、小于约300nM、小于约200nM、小于约100nM、小于约90nM、小于约80nM、小于约70nM、小于约60nM、优选小于约50nM、更优选小于约25nM或者甚至更优选小于约10nM的K

多特异性抗体构建体可以以比其ABS对第一肿瘤细胞表面抗原和第二肿瘤细胞表面抗原的各结合亲和力更高的亲合力特异性地结合靶肿瘤细胞。例如，多特异性抗体构建体对第一肿瘤细胞表面抗原或第二肿瘤细胞表面抗原表现出的K

在一些实施方案中，第一ABS以大于100nM的K

在一些实施方案中，第一ABS以大于100nM的K

在一些实施方案中，第一ABS以大于100nM的K

在一些实施方案中，多特异性抗体构建体特异性地结合靶肿瘤细胞的亲合力以比结合任何非靶细胞大。例如，多特异性抗体构建体可以以比其对非靶细胞的亲合力大至少0.1X、0.2X、0.3X、0.4X、0.5X、0.6X、0.7X、0.8X、0.9X、1X、2X、3X、4X、5X、6X、7X、8X、9X、10X、11X、12X、13X、14X、15X、16X、17X、18X、19X、20X、21X、22X、23X、24X、25X、26X、27X、28X、29X、30X、31X、32X、33X、34X、35X、36X、37X、38X、39X、40X、41X、42X、43X、44X、45X、46X、47X、48X、49X、50X、51X、52X、53X、54X、55X、56X、57X、58X、59X、60X、61X、62X、63X、64X、65X、66X、67X、68X、69X、70X、71X，72X、73X、74X、75X、76X、77X、78X、79X、80X、81X、82X、83X、84X、85X、86X、87X、88X、89X、90X、91X、92X、93X、94X、95X、96X、97X、98X、99X、100X、110X、120X、130X、140X、150X、160X、170X、180X、190X、200X、210X、220X、230X、240X、250X、260X、270X、280X、290X、300X、310X、320X、330X、340X、350X、360X、370X、380X、390X、400X、410X、420X、430X、440X、450X、460X、470X、480X、490X、500X、750X或1000X的亲合力与靶肿瘤细胞结合。

多特异性抗体构建体可以选择性地与靶肿瘤细胞结合，而不是非靶细胞。本领域技术人员可以使用本领域已知的任何方法评估与靶肿瘤细胞而不是非靶细胞的选择性结合。用于评估选择性结合的示例性方法包括将在非饱和测定条件下用多特异性抗体构建体可检测地标记的靶肿瘤细胞的百分比与在相同测定条件下用多特异性抗体构建体可检测地标记的非靶细胞的百分比进行比较。例如，多特异性抗体构建体结合的靶肿瘤细胞百分比/结合的非靶细胞百分比的比率可用作选择性结合靶肿瘤细胞的指示。在一些实施方案中，在非饱和测定条件下可检测结合超过70％的靶肿瘤细胞的多特异性抗体构建体在相同测定条件下结合少于30％、少于25％、少于20％或少于15％的非靶细胞。在一些实施方案中，在非饱和测定条件下可检测地结合超过80％的靶肿瘤细胞的多特异性抗体构建体在相同测定条件下结合少于20％的非靶细胞。在一些实施方案中，在非饱和测定条件下可检测地结合超过90％的靶肿瘤细胞的多特异性抗体构建体在相同测定条件下结合少于10％的非靶细胞。在一些实施方案中，在非饱和测定条件下结合的靶肿瘤细胞/结合的非靶细胞的比率大于1.5、大于2、大于3、大于4、大于5、大于6、大于7、大于8、大于9、大于10、大于11、大于12、大于13、大于14、大于15、大于16、大于17、大于18、大于19、大于20、大于21、大于22、大于23、大于24、大于25、大于26、大于27、大于28、大于29、大于30、大于31、大于32、大于33、大于34、大于35、大于36、大于37、大于38、大于39、大于40、大于41、大于42、大于43、大于44、大于45、大于46、大于47、大于48、大于49、大于50、大于51、大于52、大于53、大于54、大于55、大于56、大于57、大于58、大于59、大于60、大于61、大于62、大于63、大于64、大于65、大于66、大于67、大于68、大于69、大于70、大于71、大于72、大于73、大于74、大于75、大于76、大于77、大于78、大于79、大于80、大于81、大于82、大于83、大于84、大于85、大于86、大于87、大于88、大于89、大于90、大于91、大于92、大于93、大于94、大于95、大于96、大于97、大于98、大于99、大于100、大于110、大于120、大于130、大于140、大于150、大于160、大于170、大于180、大于190、大于200、大于210、大于220、大于230、大于240、大于250、大于260、大于270、大于280、大于290、大于300、大于310、大于320、大于330、大于340、大于350、大于360、大于370、大于380、大于390、大于400、大于410、大于420、大于430、大于440、大于450、大于460、大于470、大于480、大于490或大于500。

基于B7H3和GD2的共表达，将靶肿瘤细胞与非靶细胞区分开来。因此，靶肿瘤细胞对B7H3和GD2呈双阳性。非靶细胞包括但不限于表达B7H3但不表达GD2的细胞和表达GD2但不表达B7H3的细胞。

6.3.1.可变结构域

在典型的实施方案中，本文所述的抗体构建体的每个ABS包含V

在特定的实施方案中，参考图51，包含V

a)第一多肽链

第二多肽链

V

或

b)第一多肽链

第二多肽链

V

在各种实施方案中，参考图51，抗体构建体还包括第三多肽链和第四多肽链，其中：

(a)第三多肽链包含结构域H、结构域I、结构域J和结构域K，其中所述结构域从N-端到C-端以H-I-J-K方向排列，且其中结构域H具有可变区结构域氨基酸序列，结构域I具有恒定区结构域氨基酸序列，结构域J具有CH2氨基酸序列，和结构域K具有恒定区结构域氨基酸序列；

(b)第四多肽链包含结构域L和结构域M，其中所述结构域从N-端到C-端以L-M方向排列，且其中结构域L具有可变区结构域氨基酸序列，且结构域M具有恒定区结构域氨基酸序列；

(c)第三多肽和第四多肽通过H结构域和L结构域之间的相互作用(形成第二抗原结合位点(ABS))以及I结构域和M结构域之间的相互作用结合；和

(d)第一多肽和第三多肽通过D结构域和J结构域之间的相互作用以及E结构域和K结构域之间的相互作用结合。

在特定的实施方案中，结构域H是V

在特定的实施方案中，结构域A具有VL抗体结构域序列，且结构域F具有VH抗体结构域序列。在一些实施方案中，结构域A具有VH抗体结构域序列，且结构域F具有VL抗体结构域序列。

在一些实施方案中，抗体构建体包含天然抗体结构，其中结构域A和结构域H包含VH氨基酸序列，结构域F和结构域L包含VL氨基酸序列，结构域B和结构域I包含CH1，结构域G和结构域M包含CL，结构域D和结构域J包含CH2，和结构域E和结构域K包含CH3。

在一些实施方案中，抗体构建体是双体

在一些实施方案中，抗体构建体是CrossMab

在一些实施方案中，抗体构建体是具有美国专利号8,871,912和WO2016/087650中所述的一般结构的抗体。在一些实施方案中，抗体构建体是一种结构域交换的抗体，其包含由VL-CH3组成的轻链(LC)，和包含VH-CH3-CH2-CH3的重链(HC)，其中LC的VL-CH3与HC的VH-CH3进行二聚，从而形成包含CH3LC/CH3HC结构域对的结构域交换的LC/HC二聚体。

在一些实施方案中，抗体构建体如在WO 2017/011342中所述。在一些实施方案中，抗体构建体如在WO 2006/093794中所述。

6.3.1.1.1 VH结构域

在多种实施方案中，VH结构域具有的氨基酸序列为哺乳动物序列，包括人类序列、人源化序列、合成序列或人类、非人类哺乳动物和/或合成序列的组合。在多种实施方案中，VH氨基酸序列是天然存在序列的突变序列。

6.3.1.1.2 VL结构域

在多种实施方案中，VL结构域具有的氨基酸序列为哺乳动物序列，包括人类序列、人源化序列、合成序列或人类、非人类哺乳动物和/或合成序列的组合。在多种实施方案中，VL氨基酸序列是天然存在序列的突变序列。

在某些实施方案中，VL氨基酸序列是λ轻链可变域序列。在某些实施方案中，VL氨基酸序列是κ轻链可变域序列。

6.3.1.1.3互补决定区

本文所述的抗体构建体的VH和VL结构域包含称为“互补决定区”(CDR)的高度可变序列，通常三个CDR(CDR1、CD2和CDR3)。在多种实施方案中，CDR是哺乳动物序列，包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、兔、骆驼、驴、山羊和人类序列。在优选的实施方案中，CDR是人类序列。在多种实施方案中，CDR是天然存在序列。在多种实施方案中，CDR是经突变以改变抗原结合位点对特定抗原或表位的结合亲和力的天然存在序列。在某些实施方案中，通过亲和力成熟和体细胞高频突变，天然存在CDR在宿主体内已经发生突变。在某些实施方案中，通过包括但不限于PCR诱变和化学诱变的方法，CDR在体外已经发生突变。在各种实施方案中，CDR是合成序列，其包括但不限于从随机序列CDR库和合理设计的CDR库获得的CDR。

6.3.1.1.4框架区与CDR移植

本文所述的抗体构建体的VH和VL结构域包含“框架区”(FR)序列。FR通常是保守的序列区域(其充当散布的CDR的支架)，通常以FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4排列(从N-端到C-端)。在多种实施方案中，FR是哺乳动物序列，其包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、兔、犬、猫、骆驼、驴、山羊和人类序列。在优选的实施方案中，FR是人类序列。在多种实施方案中，FR是天然存在序列。在多种实施方案中，FR是合成序列，其包括但不限于合理设计的序列。

在多种实施方案中，FR和CDR都来自相同的天然存在的可变域序列。在多种实施方案中，FR和CDR来自不同的可变域序列，其中所述CDR被移植到FR支架上，该CDR提供对特定抗原的特异性。在某些实施方案中，移植的CDR均来源于相同的天然存在的可变域序列。在某些实施方案中，移植的CDR来源于不同的可变域序列。在某些实施方案中，移植的CDR是合成序列，其包括但不限于从随机序列CDR库和合理设计的CDR库获得的CDR。在某些实施方案中，移植的CDR和FR来自相同的物种。在某些实施方案中，移植的CDR和FR来自不同的物种。在优选的移植的CDR实施方案中，抗体是“人源化”的，其中所述移植的CDR是非人类哺乳动物序列(包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、兔、骆驼、驴和山羊序列)，而所述FR是人类序列。人源化抗体在美国专利号6,407,213中进行了更详细的讨论，其全部内容通过引用以其整体并入本文以获得其所有教导。在各种实施方案中，用来自一个物种的FR的部分或特定序列去替换另一个物种的FR的部分或特定序列。

6.3.2 CH1和CL结构域

在多种实施方案中，抗体构建体的第一多肽链和第二多肽链中的至少一个还包含免疫球蛋白CH1结构域。在各种实施方案中，抗体构建体的第一多肽链和第二多肽链中的至少一个还包含免疫球蛋白CL结构域。

在各种实施方案中，第一多肽还包含CH1结构域且第二多肽还包含CL结构域。在各种实施方案中，第二多肽还包含CH1结构域且第一多肽还包含CL结构域。

在各种实施方案中，CH1序列是内源序列。在多种实施方案中，CH1序列是哺乳动物序列，其包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、兔、骆驼、驴、山羊和人类序列。在优选的实施方案中，CH1序列是人类序列。在某些实施方案中，CH1序列来自IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgM同型。在优选的实施方案中，CH1序列来自IgG1同型。在优选的实施方案中，CH1序列是UniProt登录号P01857的氨基酸1-98。

本文所述的抗体构建体的CL结构域是抗体轻链恒定域。在某些实施方案中，CL结构域具有的序列为内源序列。在多种实施方案中，CL序列是哺乳动物序列，其包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、兔、犬、猫、骆驼、驴、山羊和人类序列。在优选的实施方案中，CL序列是人类序列。

在某些实施方案中，CL氨基酸序列是λ轻链恒定域序列。在特定的实施方案中，CL氨基酸序列是人λ轻链恒定域序列。在优选的实施方案中，λ轻链序列是UniProt登录号P0CG04。

在某些实施方案中，CL氨基酸序列是κ轻链恒定域序列。在优选的实施方案中，CL氨基酸序列是人κ轻链恒定域序列。在优选的实施方案中，κ轻链序列是UniProt登录号P01834。

在某些实施方案中，CH1序列和CL序列都是内源序列。

CH1结构域折叠通常是IgG分泌中的限速步骤(Feige等人，Mol Cell.2009Jun 12；34(5):569-79；通过引用以其整体并入本文)。因此，基于含CH1的多肽链的限速成分纯化本文所述的抗体构建体可提供从不完整链纯化完整复合物的方法，例如，从仅具有一种或更多种不含CH1的链的复合物中纯化具有限制性CH1结构域的复合物。

尽管CH1限制表达在某些方面可能是有益的，如所讨论的，CH1有可能限制完整抗体构建体的整体表达。因此，在某些实施方案中，调整包含CH1序列的多肽链的表达以提高抗体构建体形成完整复合物的效率。在说明性实例中，可以增加被构建为表达包含CH1序列的多肽链的质粒载体相对于被构建为表达其他多肽链的质粒载体的以的比率。在另一个说明性实例中，当与包含CL序列的多肽链相比时，包含CH1序列的多肽链可以是两条多肽链中的较小者。在另一个具体实施方案中，包含CH1序列的多肽链的表达可通过控制具有CH1序列的多肽链来调整。例如，工程改造抗体构建体使得CH1结构域存在于两结构域多肽链(例如，本文所述的第四多肽链)中，而不是CH1序列在四结构域多肽链(例如，本文所述的第三多肽链)中的天然位置，可用于控制包含CH1序列的多肽链的表达。然而，在其他方面，含有CH1的链的相对表达水平与其他链相比过高可能导致具有CH1链，而没有其他链的每一种的不完整复合物。因此，在某些实施方案中，对包含CH1序列的多肽链的表达进行调整，以既减少不含CH1链的不完全复合物形成，又减少含有CH1链但不含完整复合物中存在的其他链的不完全复合物形成。

在某些实施方案中，CH1序列和CL序列分别在内源性CH1和CL序列中包含相应的正交修饰，如下文更详细地讨论的。优选地，CH1序列中的正交突变不消除CH1结构域和用于纯化的CH1特异性结合试剂之间的特异性结合相互作用。

6.3.2.1 CH1和CL正交修饰

在某些实施方案中，CH1序列和CL序列还包括内源性CH1和CL序列的相应正交修饰。CH1/CL正交修饰可通过CH1结构域中被修饰的残基与CL结构域中相应的被修饰或未修饰的残基之间的相互作用影响CH1/CL结构域配对。

在特定的实施方案中，正交修饰可以与降低免疫原性的氨基酸取代例如同种异型突变结合。

在其他实施方案中，CH1/CL对的一条序列包含至少一种修饰，而CH1/CL对的另一条序列在各自正交的氨基酸位置不包含修饰。

CH1和CL序列，无论是内源序列还是修饰的序列，也可以是其部分，使得具有CH1序列或其部分的结构域可以与具有CH1序列或其部分的结构域结合。此外，本文所述的具有CH1序列的一部分的抗体构建体可被CH1结合试剂结合。

6.3.2.1.1示例性CH1/CL正交修饰：工程改造的二硫键

CH1/CL正交修饰的一些实施方案包含在CH1和CL中工程改造的半胱氨酸之间构建二硫键。这种工程改造的二硫键可以稳定包含修饰的CH1的多肽和包含相应修饰的CL的多肽之间的相互作用。

仅作为示例，包含工程改造的二硫键的正交CH1/CL修饰可以包含在位置128、129、138、141、168或171(按EU索引编号)处具有工程改造的半胱氨酸的CH1结构域。这种包含工程改造的二硫键的正交CH1/CL修饰可以包含在位置128、118、119、164、162或210(按EU索引编号)处具有工程改造的半胱氨酸的CL结构域(仅作为实例)。

例如，CH1/CL正交修饰可以选自在CH1序列的位置138和CL序列的位置116处、在CH1序列的位置128和CL序列的位置119处或在CH1序列的位置129和CL序列的位置210处的工程改造的半胱氨酸，如在美国专利号8,053,562和美国专利号9,527,927中所编号的和更详细讨论的，每篇均通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，CH1/CL正交修饰包含在CH1序列的位置141和CL序列的位置118(按EU索引编号)处的工程改造的半胱氨酸。

在一些实施方案中，CH1/CL正交修饰包含在CH1序列的位置168和CL序列的位置164(按EU索引编号)处的工程改造的半胱氨酸。在一些实施方案中，CH1/CL正交修饰包含在CH1序列的位置128和CL序列的位置118(按EU索引编号)处的工程改造的半胱氨酸。在一些实施方案中，CH1/CL正交修饰包含在CH1序列的位置171和CL序列的位置162(按EU索引编号)处的工程改造的半胱氨酸。在一些实施方案中，CL序列是CL-λ序列。在优选的实施方案中，CL序列是CL-κ序列。在一些实施方案中，工程改造的半胱氨酸是在CH1序列的位置128和CL-κ序列的位置118处(按EU索引编号)。

下表1提供了在CH1和CL之间包含工程改造的二硫键的示例性CH1/CL正交修饰，根据EU索引编号。

在一系列优选的实施方案中，提供非内源性(工程改造的)半胱氨酸氨基酸的突变是CL序列中的F118C突变与CH1序列中的相应A141C，或CL序列中的F118C突变与CH1序列中的相应L128C，CL序列中的T164C突变与CH1序列中的相应H168C突变，或CL序列中的S162C突变与CH1序列中的相应P171C突变，按Eu索引编号。

6.3.1.1.2 CH1/CL正交修饰：工程改造的电荷对突变

在多种实施方案中，CL序列和CH1序列中的正交修饰是电荷对突变。

在具体实施方案中，电荷对突变是CL序列中的F118S、F118A或F118V突变与CH1序列中相应的A141L，或CL序列中的T129R突变与CH1序列中的相应K147D，按Eu索引所编号，并在Bonisch等人(Protein Engineering,Design&Selection,2017,pp.1-12)中更详细描述，该文献被通过引用并入本文以获得其所有教导。

在一些情况下，CH1/CL电荷对突变是CL序列中的N138K突变与CH1序列中相应的G166D，或CL序列中的N138D突变与CH1序列中相应的G166K，如Eu索引所编号。在一些实施方案中，电荷对突变是CH1序列中的P127E突变与相应CL序列中的相应E123K突变。在一些实施方案中，电荷对突变是CH1序列中的P127K突变与相应CL序列中的相应E123(未突变)。

下表2提供了示例性CH1/CL正交电荷对修饰。

6.3.2.1.3 CH1/CL正交修饰的组合

在某些实施方案中，单个CH1/CL对的CH1和CL结构域分别在内源性CH1和CL序列中包含两种或更多种分别正交的修饰。例如，CH1和CL序列可以在内源性CH1和CL序列中包含第一正交修饰和第二正交修饰。内源性CH1和CL序列中的两种或更多种分别正交的修饰可以选自本文所述的任何CH1/CL正交修饰。

在一些实施方案中，第一正交修饰是正交电荷对突变，而第二正交修饰是正交工程改造的二硫键。在一些实施方案中，第一正交修饰是如表2中所述的正交电荷对突变，并且其他正交修饰包含工程改造的二硫键，所述工程改造的二硫键选自在CH1序列的位置138和CL序列的位置116处、在CH1序列的位置128和CL序列的位置119处，或在CH1序列的位置129和CL序列的位置210处的工程改造的半胱氨酸，如在美国专利号8,053,562和美国专利号9,527,927中所编号和更详细讨论的，每篇均通过引用以其整体并入本文。

在一些实施方案中，第一正交修饰是如表2中所述的正交电荷对突变，并且其他的正交修饰包含如表1中所述的工程改造的二硫键。在一些实施方案中，第一正交修饰包含CH1序列中的L128C突变和CL序列中的F118C突变，而第二正交修饰包含同一CH1序列中残基166的修饰和同一CL序列中残基138的修饰。

在一些实施方案中，第一正交修饰包含CH1序列中的L128C突变和CL序列中的F118C突变，而第二正交修饰包含CH1序列中的G166D突变和CL序列中的N138K突变。在一些实施方案中，第一正交修饰包含CH1序列中的L128C突变和CL序列中的F118C突变，而第二正交修饰包含CH1序列中的G166K突变和CL序列中的N138D突变。

6.3.3 CH2结构域

在多种实施方案中，抗体构建体的第一多肽链和第二多肽链中的至少一个还包含CH2结构域。在多种实施方案中，第一多肽和第二多肽都包含CH2结构域。

在一些实施方案中，抗体构建体具有多于一组配对的CH2结构域。在这些实施方案的多个中，第一组配对的CH2结构域具有来自第一同种型的CH2氨基酸序列和来自另一同种型的一组或更多组直系同源的CH2氨基酸序列。如本文所述，直系同源的CH2氨基酸序列能够与来自共有同种型的CH2氨基酸序列相互作用，但不与抗体构建体中存在的来自另一同种型的CH2氨基酸序列明显相互作用。

在特定的实施方案中，第一组CH2氨基酸序列与抗体构建体中的其他非CH2结构域来自相同的同种型。在具体的实施方案中，第一组具有来自IgG同种型的CH2氨基酸序列，而一个或更多直系同源组具有来自IgM或IgE同种型的CH2氨基酸序列。

在某些实施方案中，一组或更多组CH2氨基酸序列是内源性CH2序列。在其他实施方案中，一组或更多组CH2氨基酸序列是具有一种或更多种突变的内源性CH2序列。在特定的实施方案中，一种或更多种突变是正交旋钮入孔突变、正交电荷对突变或正交疏水性突变。可用于本文所述抗体构建体的直系同源CH2氨基酸序列在国际PCT申请WO2017/011342和WO2017/106462中有更详细的描述，其通过引用以其整体并入本文。

在特定的实施方案中，所有组的CH2氨基酸序列来自相同的物种。在优选的实施方案中，所有组的CH2氨基酸序列是人CH2氨基酸序列。在其他实施方案中，CH2氨基酸序列组来自不同的物种。

6.3.4 CH3结构域

本文所述抗体构建体的CH3结构域具有来源于天然位于抗体重链C-端的结构域的氨基酸序列，上文所述突变被工程改造到氨基酸序列中。

在多种实施方案中，CH3序列是哺乳动物序列，包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、兔、犬、猫、骆驼、驴、山羊和人类序列。在优选的实施方案中，CH3序列是人类序列。在某些实施方案中，CH3序列来自IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgM、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4同种型。在具体实施方案中，CH3序列来自IgG同种型。在优选的实施方案中，CH3序列来自IgG1同种型。在一些实施方案中，CH3序列来自IgA同种型。

在某些实施方案中，CH3序列是来自IgE或IgM同型的CH4序列。

在某些实施方案中，CH3序列是内源序列。在特定实施方案中，CH3序列是UniProt登录号P01857的氨基酸224-330。在多种实施方案中，CH3序列是内源性CH3序列的片段。在特定实施方案中，CH3序列具有缺乏N-端氨基酸G224和Q225的内源性CH3序列。在特定实施方案中，CH3序列具有缺乏C-端氨基酸P328、G329和K330的内源性CH3序列。在特定实施方案中，CH3序列具有缺乏N-端氨基酸G224和Q225以及C-端氨基酸P328、G329和K330的内源性CH3序列。

在某些实施方案中，如在Stickler等人(Genes Immun.2011Apr；12(3):213–221)中更详细描述的，通过将一种同种型的特定氨基酸替换为另一同种型的特定氨基酸替换(本文中称为同种异型突变)，将CH3序列工程改造为降低免疫原性，该文献被通过引用并入本文以获得其所有教导。在特定的实施方案中，G1m1同种异型的特定氨基酸被替换。在优选的实施方案中，在CH3序列中产生了同种异型突变D356E和L358M。

在一些实施方案中，在第一或第二CH3结构域中没有其他的工程改造突变。在一些实施方案中，CH3序列是内源序列，其具有除上述以外的如下所述的一种或更多种工程改造突变。

6.3.5 CH3结构域中的其他工程改造正交突变

在一些实施方案中，在第一和/或第二CH3结构域中工程改造了至少一种额外的正交突变。

6.3.5.1旋钮入孔

在多种实施方案中，第一和第二CH3结构域还包含正交旋钮入孔(“K-I-H”)突变。

如本文所用，旋钮入孔突变是改变第一结构域表面的空间特征的突变，使得相对于结合没有互补空间突变的结构域，第一结构域将优先结合具有所述互补空间突变的第二结构域。旋钮入孔突变在美国专利号5,821,333和美国专利号8,216,805中有更详细的描述，其每篇通过引用以其整体并入本文。

在一些实施方案中，至少一种额外的工程改造突变是第一CH3结构域中的旋钮突变和第二CH3结构域中的孔突变。在一些实施方案中，在第一CH3结构域中有孔突变而在第二CH3结构域中有旋钮突变。

在某些实施方案中，旋钮突变是T366W或T366Y。

在某些实施方案中，孔突变选自T366S、L368A、F405T、Y407V或Y407T。在具体的实施方案中，孔突变是F405T。

在某些实施方案中，旋钮入孔突变是第一CH3结构域中的T366W突变与第二CH3结构域中Y407A突变。在某些实施方案中，旋钮入孔突变是第二CH13结构域中的T366W突变和第一CH3结构域中的Y407A突变。

在某些实施方案中，旋钮入孔突变是第一CH3结构域中的T366Y突变和第二结构域中的Y407T突变。在某些实施方案中，旋钮入孔突变是第二CH3结构域中的T366Y突变和第一结构域中的Y407T突变。

在某些实施方案中，旋钮入孔突变是第一CH3结构域中的T394W和第二CH3结构域中的F405A。在某些实施方案中，旋钮入孔突变是第二CH3结构域中的T394W突变和第一CH3结构域中的F405A。

在某些实施方案中，旋钮入孔突变是第一CH3结构域中的T366Y突变和F405A和第二CH3结构域中的T394W突变和Y407T突变。在某些实施方案中，旋钮入孔突变是第二CH3结构域中的T366Y突变和F405A和第一CH3结构域中的T394W突变和Y407T突变。

6.3.5.2工程改造的电荷对

在多种实施方案中，第一和第二CH3结构域还包含正交电荷对突变。

如本文所用，电荷对突变是影响结构域表面中氨基酸电荷的突变，使得相对于结合没有互补电荷对突变的结构域，该结构域将优先结合具有所述互补电荷对突变的第二结构域。在某些实施方案中，电荷对突变改善了特定结构域之间的正交结合。电荷对突变在美国专利号8,592,562、9,248,182和9,358,286中有更详细的描述，其每一篇通过引用以其整体并入本文。

在某些实施方案中，电荷对突变是第一CH3结构域中的T366K突变与第二CH3结构域中L351D突变。在某些实施方案中，电荷对突变是第二CH13结构域中的T366K突变与第一CH3结构域中的L351D突变。

6.3.6.特异性二价抗体构建体

在多种实施方案中，抗体构建体具有图51所示的结构。

6.3.6.1结构域A

参照图51，在本文所述的抗体构建体的多种实施方案中，结构域A具有可变区结构域氨基酸序列。在优选的实施方案中，结构域A具有VL抗体结构域序列，而结构域F具有VH抗体结构域序列。在一些实施方案中，结构域A具有VH抗体结构域序列，而结构域F具有VL抗体结构域序列。

在本文所述的抗体构建体中，将结构域A的C-端连接到结构域B的N-端。在某些实施方案中，结构域A具有VL氨基酸序列，其在结构域A和结构域B之间的连接处的C-端被突变。

6.3.6.2结构域B

参照图51，在本文所述抗体构建体的多种实施方案中，结构域B具有恒定区结构域序列。

在一些实施方案中，结构域B具有CH3序列。

在某些实施方案中，结构域B具有包含“旋钮入孔”(“KIH”)正交突变的CH3序列。

在某些实施方案中，结构域B具有CH3序列和S354C或Y349C突变，S354C或Y349C与CH3结构域含有的正交突变形成工程改造的二硫键。

在某些实施方案中，结构域B具有第一CH3结构域序列，其中第一CH3结构域的Y349被半胱氨酸(C)取代(Y349C)，其中根据Eu索引对位置进行编号。

在某些实施方案中，结构域B具有第二CH3结构域序列，其中第二CH3结构域的S354被半胱氨酸(C)取代(S354C)，而第二CH3结构域的E357被疏水性或芳香族氨基酸取代，其中根据Eu索引对位置进行编号。在特定的实施方案中，第二CH3结构域具有E357W突变。

在某些实施方案中，结构域B具有含以下突变变化的人IgG1 CH3序列：P343V；Y349C；和三肽插入445P、446G、447K。在其他优选的实施方案中，结构域B具有含以下突变变化的人IgG1 CH3序列：T366K；和三肽插入445K、446S、447C。又在其他优选的实施方案中，结构域B具有含以下突变变化的人IgG1 CH3序列：Y349C和三肽插入445P、446G、447K。

在某些实施方案中，结构域B具有人IgG1 CH3序列，其中K447C突变被整合到原本内源性的CH3序列中。

在一些实施方案中，恒定区序列是直系同源CH2序列。在一些实施方案中，结构域B具有来自IgE的CH2序列。在一些实施方案中，结构域B具有来自IgM的CH2序列。

在一些实施方案中，例如其中结合分子的价是三或大于三，恒定区序列是CH1或CL序列。在一些实施方案中，结构域B具有CH1序列。在一些实施方案中，恒定区序列是CL序列。在一些实施方案中，CH1或CL序列包含本文所述的一种或更多种CH1或CL正交修饰。

在本文所述的抗体构建体中，将结构域B的N-端连接到结构域A的C-端。在某些实施方案中，结构域B具有CH3氨基酸序列，其在结构域A和结构域B之间的连接处的N-端被突变。

在本文所述的抗体构建体中，将结构域B的C-端连接到结构域D的N-端。在某些实施方案中，结构域B具有CH3氨基酸序列，其C-端在结构域B和结构域D之间的连接处被延伸。

在一些实施方案中，结构域B包含人IgA CH3序列。在某些实施方案中，IgA CH3序列包含CH3接头序列。

6.3.6.3结构域D

参照图51，在本文描述的抗体构建体的多种实施方案中，结构域D具有恒定区氨基酸序列。

在优选系列的实施方案中，结构域D具有CH2氨基酸序列。在某些实施方案中，CH2序列是内源序列。在特定的实施方案中，序列是UniProt登录号P01857的氨基酸111-223。在优选的实施方案中，CH2序列具有将N-端可变域-恒定域片段连接到CH2结构域的N-端铰链区肽。在一些实施方案中，CH2序列包含一种或更多种调节效应子功能的突变。在某些实施方案中，CH2序列包含一种或更多种降低效应子功能的突变。在一些实施方案中，CH2序列包含一种或更多种调节FcRN结合的突变。在某些实施方案中，CH2序列包含一种或更多种降低FcRN结合的突变。

在本文所述的抗体构建体中，将结构域D的N-端连接到结构域B的C-端。在某些实施方案中，结构域B具有CH3氨基酸序列，其C-端在结构域D和结构域B之间的连接处被延伸。

6.3.6.4结构域E

参照图51，在本文所述的抗体构建体的多种实施方案中，结构域E具有恒定区结构域氨基酸序列。

在某些实施方案中，恒定区序列是CH3序列。

在某些实施方案中，结构域E具有包含“旋钮入孔”(“KIH”)正交突变的CH3序列。

在某些实施方案中，结构域E具有CH3序列和S354C或Y349C突变，S354C或Y349C与CH3结构域含有的正交突变形成工程改造的二硫键。

在某些实施方案中，结构域E具有第一CH3结构域序列，其中第一CH3结构域的Y349被半胱氨酸(C)取代(Y349C)。

在某些实施方案中，结构域E具有第二CH3结构域序列，其中第二CH3结构域的S354被半胱氨酸(C)取代(S354C)，且第二CH3结构域的E357被疏水性或芳香族氨基酸取代，其中根据Eu索引对位置进行编号。在特定的实施方案中，第二CH3结构域具有E357W突变。

在某些实施方案中，恒定区结构域序列是CH1序列。在特定的实施方案中，结构域E的CH1氨基酸序列是结合分子中唯一的CH1氨基酸序列。在某些实施方案中，将CH1结构域的N-端连接到CH2结构域的C-端。

在某些实施方案中，恒定区序列是CL序列。在某些实施方案中，将CL结构域的N-端连接到CH2结构域的C-端。

6.3.6.5结构域F

参照图51，在本文所述的抗体构建体的多种实施方案中，结构域F具有可变区结构域氨基酸序列。在一个优选的实施方案中，结构域F具有VH抗体结构域序列。在一些实施方案中，结构域F具有VL抗体结构域序列。

6.3.6.6结构域G

参照图51，在本文所述的抗体构建体的各种实施方案中，结构域G具有恒定区氨基酸序列。

在一些实施方案中，结构域G具有CH3氨基酸序列。

在某些实施方案中，结构域G具有含以下突变变化的人IgG1 CH3序列：S354C；和三肽插入445P、446G、447K。在一些实施方案中，结构域G具有含以下突变变化的人IgG1 CH3序列：S354C；和445P、446G、447K三肽插入。在一些优选的实施方案中，结构域G具有含以下变化的人IgG1 CH3序列：L351D，和445G、446E、447C的三肽插入。

在某些实施方案中，结构域G具有包含“旋钮入孔”(“KIH”)正交突变的CH3序列。

在某些实施方案中，结构域G具有CH3序列和S354C或Y349C突变，S354C或Y349C与CH3结构域含有的正交突变形成工程改造的二硫键。

在一些实施方案中，结构域G具有人IgA CH3序列。

在一些实施方案中，结构域G具有CL序列。

在一些实施方案中，结构域G具有来自IgE的CH2序列。在一些实施方案中，结构域G具有来自IgM的CH2序列。

在特定的实施方案中，例如其中结合分子的价是三或大于三，恒定区序列是CH1或CL序列。在一些实施方案中，其中结构域B是CL序列，结构域G是CH1序列。在一些实施方案中，CH1或Cl序列包含本文所述的一种或更多种CH1或CL正交修饰。

在一些实施方案中，将结构域G的C-端连接到结构域D的N-端。在某些实施方案中，结构域G具有CH3氨基酸序列，其C-端在结构域G和结构域D之间的连接处被延伸。

6.3.6.7结构域H

参照图51，在本文所述的抗体构建体的多种实施方案中，结构域H具有可变区结构域氨基酸序列。在优选的实施方案中，结构域H具有VL抗体结构域序列。在一些实施方案中，结构域H具有VH抗体结构域序列。

6.3.6.8结构域I

参照图51，在本文所述的抗体构建体的多种实施方案中，结构域I具有恒定区结构域氨基酸序列。

在结合分子的一系列优选实施方案中，结构域I具有CL氨基酸序列。在另一系列选实施方案中，结构域I具有CH1氨基酸序列。

6.3.6.9结构域J

参照图51，在本文所述的抗体构建体的多种实施方案中，结构域J具有CH2氨基酸序列。在优选的实施方案中，CH2氨基酸序列具有连接结构域J和结构域I的N-端铰链区。在一些实施方案中，CH2序列包含一种或更多种调节效应子功能的突变。在某些实施方案中，CH2序列包含一种或更多种降低效应子功能的突变。在一些实施方案中，CH2序列包含一种或更多种调节FcRN结合的突变。在某些实施方案中，CH2序列包含一种或更多种降低FcRN结合的突变。

将结构域J的C-端连接至结构域K的N-端。在特定的实施方案中，将结构域J连接至具有CH1氨基酸序列或CL氨基酸序列的结构域K的N-端。

6.3.6.10结构域K

参照图51，在本文所述的抗体构建体的多种实施方案中，结构域K具有恒定区结构域氨基酸序列。

在一些实施方案中，结构域K具有CH3序列。

在某些实施方案中，结构域K具有包含“旋钮入孔”(“KIH”)正交突变的CH3序列。

在某些实施方案中，结构域K具有CH3序列和S354C或Y349C突变，S354C或Y349C与CH3结构域含有的正交突变形成工程改造的二硫键。

在某些实施方案中，结构域K具有第一CH3结构域序列，其中第一CH3结构域的Y349被半胱氨酸(C)取代(Y349C)。

在某些实施方案中，结构域K具有第二CH3结构域序列，其中第二CH3结构域的S354被半胱氨酸(C)取代(S354C)，且第二CH3结构域的E357被疏水性或芳香族氨基酸取代，其中根据Eu索引对位置进行编号。在特定的实施方案中，第二CH3结构域具有E357W突变。

在一些实施方案中，将旋钮入孔正交突变与同种异型突变结合。在某些实施方案中，旋钮突变是T366W或T366Y。在某些实施方案中，孔突变选自T366S、L368A、F405T、Y407V或Y407T。在具体的实施方案中，孔突变是F405T。

在某些实施方案中，恒定区结构域序列是CH1序列。在特定的实施方案中，结构域K的CH1氨基酸序列是结合分子中唯一的CH1氨基酸序列。在某些实施方案中，将CH1结构域的N-端连接到CH2结构域的C-端。在某些实施方案中，恒定区序列是CL序列。在某些实施方案中，将CL结构域的N-端连接到CH2结构域的C-端。

6.3.6.11结构域L

参照图51，在本文所述的抗体构建体的各种实施方案中，结构域L具有可变区结构域氨基酸序列。在优选的实施方案中，结构域L具有VH抗体结构域序列。在一些实施方案中，结构域L具有VL抗体结构域序列。

6.3.6.12结构域M

参照图51，在本文所述的抗体构建体的各种实施方案中，结构域M具有恒定区结构域氨基酸序列。在一系列优选的实施方案中，结构域I具有CH1氨基酸序列，而结构域M具有CL氨基酸序列。在另一系列优选的实施方案中，结构域I具有CL氨基酸序列，而结构域M具有CH1氨基酸序列。

6.3.6.13结构域A&F的配对

在图51所示的抗体构建体中，将结构域“A”VL或VH氨基酸序列和同源结构域“F”VH或VL氨基酸序列结合并形成抗原结合位点(ABS)。A:F抗原结合位点(ABS)能够特异性结合抗原的表位。

在各种多价实施方案中，由结构域A和结构域F(A:F)形成的ABS在序列上与结合分子内的一种或更多种其它ABS相同，并且因此具有与结合分子内的一种或更多种其它序列相同的ABS相同的识别特异性。

在各种多价实施方案中，A:F ABS在序列上与结合分子中的一种或更多种其他ABS不相同。在某些实施方案中，A:F ABS具有与结合分子中一种或更多种其他序列不相同的ABS不同的识别特异性。在特定的实施方案中，A:F ABS识别与结合分子中至少一种其他序列不相同的ABS识别的抗原不同的抗原。在特定的实施方案中，A:F ABS识别抗原的不同表位，该抗原也被结合分子中至少一种其他序列不相同的ABS识别。在这些实施方案中，由结构域A和结构域F形成的ABS识别抗原的表位，其中结合分子内的一种或更多种其它ABS识别相同的抗原但不识别相同的表位。

6.3.6.14结构域B&G的配对

在图51所示的抗体构建体中，将结构域“B”恒定区氨基酸序列和结构域“G”恒定区氨基酸序列结合。

在一些实施方案中，结构域B和结构域G具有CH3氨基酸序列。

在某些实施方案中，结构域B是第一CH3结构域，且结构域G是第二CH3结构域，其中第一CH3结构域的Y349被半胱氨酸(C)取代(Y349C)，第二CH3结构域的S354被半胱氨酸(C)取代(S354C)，且第二CH3结构域的E357被疏水性或芳香族氨基酸取代，其中根据Eu索引对位置进行编号。

在某些实施方案中，结构域B是第二CH3结构域，而结构域G是第一CH3结构域，其中第一CH3结构域的Y349被半胱氨酸(C)取代(Y349C)，第二CH3结构域的S354被半胱氨酸(C)取代(S354C)，且第二CH3结构域的E357被疏水性或芳香族氨基酸取代，其中根据Eu索引对位置进行编号。

在多种实施方案中，B结构域和G结构域的氨基酸序列是相同的。在这些实施方案的某些中，所述序列是内源性CH3序列。该序列可以是来自人IgG1的CH3序列。该序列可以是来自人IgA的序列。

在多种实施方案中，B结构域和G结构域的氨基酸序列是不同的，且分别在内源性CH3序列中包含相应的正交修饰，其中B结构域与G结构域相互作用，并且其中B结构域和G结构域都不与缺乏正交修饰的CH3结构域明显相互作用。

在特定的实施方案中，期望减少含有CH3序列的结构域B或结构域G与也含有CH3序列的结构域E和结构域K的不期望的结合。在这种情况下，在结构域B和/或结构域G中使用来自人IgA的CH3序列(IgA-CH3)可以通过减少这种不期望的结合来改善抗体装配和稳定性。在结合分子的一些实施方案中，其中结构域E和结构域K包含IgG-CH3序列，结构域B和结构域G包含IgA-CH3序列。

6.3.6.15结构域E&K的配对

在某些实施方案中，结构域E是第一CH3结构域，而结构域K是第二CH3结构域，其中第一CH3结构域的Y349被半胱氨酸(C)取代(Y349C)，第二CH3结构域的S354被半胱氨酸(C)取代(S354C)，且第二CH3结构域的E357被疏水性或芳香族氨基酸取代，其中根据Eu索引对位置进行编号。

在某些实施方案中，结构域E是第二CH3结构域，且结构域K是第一CH3结构域，其中第一CH3结构域的Y349被半胱氨酸(C)取代(Y349C)，第二CH3结构域的S354被半胱氨酸(C)取代(S354C)，且第二CH3结构域的E357被疏水性或芳香族氨基酸取代，其中根据Eu索引对位置进行编号。

在某些实施方案中，不同序列分别在内源性CH3序列中包含相应的正交修饰，其中E结构域与K结构域相互作用，并且其中E结构域和K结构域都不与缺乏正交修饰的CH3结构域明显相互作用。在某些实施方案中，正交修饰包括但不限于工程改造的二硫键、旋钮入孔突变和电荷对突变。在特定的实施方案中，正交修饰包括选自但不限于工程改造的二硫键、旋钮入孔突变和电荷对突变的正交修饰的组合。

在特定的实施方案中，正交修饰可以与降低免疫原性的氨基酸取代结合，例如同种异型突变。

在各种实施方案中，E结构域和K结构域的氨基酸序列是相同的。

6.3.6.16结构域H&L的配对

在各种实施方案中，结构域H具有VL序列，而结构域L具有VH序列，且使结构域“H”的VL氨基酸序列和结构域“L”的VH氨基酸序列结合并形成抗原结合位点(ABS)。H:L抗原结合位点(ABS)能够特异性结合抗原的表位。

在优选的实施方案中，结构域H具有VL氨基酸序列，结构域I具有CL氨基酸序列，结构域L具有VH氨基酸序列，和结构域M具有CH1氨基酸序列。

在多种实施方案中，H结构域和L结构域的氨基酸序列分别包含内源序列中的相应正交修饰，其中H结构域与L结构域相互作用，并且其中H结构域和L结构域都不与缺乏正交修饰的结构域明显相互作用。在一系列实施方案中，H结构域中的正交突变在VL序列中，和L结构域中的正交突变是在VH序列中。在具体的实施方案中，正交突变是在VH/VL界面的电荷对突变。在优选的实施方案中，VH/VL界面处的电荷对突变是在VH中的Q39E与在VL中相应的Q38K，或在VH中的Q39K与在VL中相应的Q38E，如在Igawa等人(Protein Eng.Des.Sel.,2010,vol.23,667-677)中更详细描述的，其被通过引用以其整体并入本文。

在某些实施方案中，A结构域和F结构域之间的相互作用形成对第一抗原特异的第一抗原结合位点，且H结构域和L结构域之间的相互作用形成对第二抗原特异的第二抗原结合位点。在某些实施方案中，A结构域和F结构域之间的相互作用形成对第一抗原特异的第一抗原结合位点，且H结构域和L结构域之间的相互作用形成对第一抗原特异的第二抗原结合位点。

6.3.6.17结构域I&M的配对

在各种实施方案中，结构域I具有CL序列，而结构域M具有CH1序列。

在各种实施方案中，I结构域和M结构域的氨基酸序列分别在内源序列中包含相应的正交修饰，其中I结构域与M结构域相互作用，并且其中I结构域和M结构域都不与缺乏正交修饰的结构域明显相互作用。在一系列实施方案中，I结构域中的正交突变在CL序列中，而M结构域中的正交突变在CH1序列中。

6.3.6.18结构域连接点

6.3.6.18.1连接VL结构域和CH3结构域的连接点

在多种实施方案中，在VL结构域的C-端和CH3结构域的N-端之间形成连接点的氨基酸序列是工程改造序列。

在某些实施方案中，在VL结构域的C-端缺失或添加一个或更多个氨基酸。在特定的实施方案中，在VL结构域的C-端缺失A111。在某些实施方案中，在CH3结构域的N-端缺失或添加一个或更多个氨基酸。在特定的实施方案中，在CH3结构域的N-端缺失P343。在特定的实施方案中，在CH3结构域的N-端缺失P343和R344。在某些实施方案中，在VL结构域的C-端和CH3结构域的N-端缺失或添加一个或更多个氨基酸。在特定的实施方案中，在VL结构域的C-端缺失A111，且在CH3结构域的N-端缺失P343。在优选的实施方案中，在VL结构域的C-端缺失A111和V110。在另一优选的实施方案中，VL结构域的C-端缺失A111和V110，且CH3结构域的N-端具有P343V突变。

6.3.6.18.2连接VH结构域和CH3结构域的连接点

在各种实施方案中，在VH结构域的C-端和CH3结构域的N-端之间形成连接点的氨基酸序列是工程改造的序列。

在某些实施方案中，在VH结构域的C-端缺失或添加一个或更多个氨基酸。在特定的实施方案中，在VH结构域的C-端缺失K117和G118。在某些实施方案中，在CH3结构域的N-端缺失或添加一个或更多个氨基酸。在特定的实施方案中，在CH3结构域的N-端缺失P343。在特定的实施方案中，在CH3结构域的N-端缺失P343和R344。在特定的实施方案中，在CH3结构域的N-端缺失P343、R344和E345。在某些实施方案中，在VH结构域的C-端和CH3结构域的N-端缺失或添加一个或更多个氨基酸。在优选的实施方案中，在VH结构域的C-端缺失T116、K117和G118。

6.3.6.18.3连接CH3 C-端和CH2 N-端的连接点(铰链)

在本文描述的抗体构建体的一些实施方案中，CH2结构域的N-端具有“铰链”区氨基酸序列。如本文所用，铰链区是连接抗体的N-端可变域-恒定域区段与抗体的CH2结构域的抗体重链序列。此外，铰链区以及在重链(例如，第一多肽链和第三多肽链)之间形成二硫键的氨基酸序列基序通常提供N-端可变域-恒定域区段和CH2结构域之间的柔性。

在多种实施方案中，CH3氨基酸序列的C-端在CH3结构域的C-端和CH2结构域的N-端之间的连接点处被延伸。在某些实施方案中，CH3氨基酸序列的C-端在CH3结构域的C-端和铰链区之间的连接点处被延伸，其继而又被连接到CH2结构域的N-端。在优选的实施方案中，通过插入CH3氨基酸延伸序列(“CH3接头序列”或“CH3接头”)来延伸CH3氨基酸序列。在一些实施方案中，CH3氨基酸延伸序列之后是IgG1铰链区的DKTHT基序。在一些实施方案中，CH3氨基酸延伸序列长度为3个至10个氨基酸。在一些实施方案中，CH3氨基酸延伸序列长度为3至8个氨基酸。在一些实施方案中，CH3氨基酸延伸序列长度为3至6个氨基酸。

在一些实施方案中，CH3氨基酸延伸序列是PGK三肽。在一些实施方案中，CH3氨基酸延伸序列是AGC三肽。在一些实施方案中，CH3氨基酸延伸序列是GEC三肽。在一些实施方案中，CH3氨基酸延伸序列是AGKC。在一些实施方案中，CH3氨基酸延伸序列是PGKC。在一些实施方案中，CH3氨基酸延伸序列是AGKGC。在一些实施方案中，CH3氨基酸延伸序列是AGKGSC。

在特定的实施方案中，CH3结构域C-端的延伸序列掺入了可以与另一个CH3结构域的正交C-端延伸序列形成二硫键的氨基酸序列。在优选的实施方案中，CH3结构域C-端的延伸序列掺入了KSC三肽序列(其后是IgG1铰链区的DKTHT基序)，其与掺入了κ轻链GEC基序的另一个CH3结构域的正交C-端延伸序列形成二硫键。

在结合分子的一些实施方案中，其中结构域B和结构域G包含CH3氨基酸序列，结构域B包含第一CH3接头序列，且结构域G包含第二CH3接头序列。在一些实施方案中，通过在第一和第二CH3接头序列的半胱氨酸残基之间形成二硫键，使第一CH3接头序列与第二CH3接头序列结合。在一些实施方案中，第一CH3接头和第二CH3接头是相同的。在一些实施方案中，第一CH3接头和第二CH3接头是不相同的。在一些实施方案中，第一CH3接头和第二CH3接头的长度相差1个至6个氨基酸。在一些实施方案中，第一CH3接头和第二CH3接头的长度相差1个至3个氨基酸。

在优选的实施方案中，第一CH3接头是AGC而第二CH3接头是AGKGSC。在一些实施方案中，第一CH3接头是AGKGC而第二CH3接头是AGC。在一些实施方案中，第一CH3接头是AGKGSC而第二CH3接头是AGC。在一些实施方案中，第一CH3接头是AGKC而第二CH3接头是AGC。

6.3.6.18.4连接CL C-端和CH2 N-端的连接点(铰链)

在多种实施方案中，将CL氨基酸序列通过其C-端连接到铰链区，铰链区继而被连接到CH2结构域的N-端。

6.3.6.18.5连接CH2 C-端和恒定区结构域的连接点

在多种实施方案中，将CH2氨基酸序列通过其C-端连接到恒定区结构域的N-端。在优选的实施方案中，将CH2序列通过其内源序列连接到CH3序列。在其他实施方案中，将CH2序列连接到CH1序列或CL序列。讨论将CH2序列连接到CH1或CL序列的实例在美国专利号8,242,247中进行了更详细的描述，该专利被通过引用以其整体并入本文。

6.3.6.19二价双特异性双体“BC1”

参照图51，在一系列实施方案中，抗体构建体具有第一、第二、第三和第四多肽链，其中(a)第一多肽链包含结构域A、结构域B、结构域D和结构域E，其中这些结构域从N-端到C-端以A-B-D-E方向排列，且结构域A具有第一VL氨基酸序列，结构域B具有带有T366K突变的人IgG1CH3氨基酸序列和掺入KSC三肽序列(其后是IgG1铰链区的DKTHT基序)的C-端延伸序列，结构域D具有人IgG1 CH2氨基酸序列，且结构域E具有带有S354C和T366W突变的人IgG1 CH3氨基酸；(b)第二多肽链具有结构域F和结构域G，其中所述结构域从N-端到C-端以F-G方向排列，并且其中结构域F具有第一VH氨基酸序列，而结构域G具有带有L351D突变的人IgG1 CH3氨基酸序列和掺入GEC氨基酸二硫基序的C-端延伸序列；(c)第三多肽链具有结构域H、结构域I、结构域J和结构域K，其中所述结构域从N-端到C-端以H-I-J-K方向排列，且其中结构域H具有第二VL氨基酸序列，结构域I具有人CLκ氨基酸序列，结构域J具有人IgG1CH2氨基酸序列，且结构域K具有带有Y349C、D356E、L358M、T366S、L368A和Y407V突变的人IgG1 CH3氨基酸序列；(d)第四多肽链具有结构域L和结构域M，其中这些结构域从N-端到C-端以L-M方向排列，并且其中结构域L具有第二VH氨基酸序列且结构域M具有人IgG1 CH1氨基酸序列；(e)第一多肽和第二多肽通过A结构域和F结构域之间的相互作用以及B结构域和G结构域之间的相互作用结合；(f)第三多肽和第四多肽通过H结构域和L结构域之间的相互作用以及I结构域和M结构域之间的相互作用结合；(g)第一多肽和第三多肽通过D结构域和J结构域之间的相互作用以及E结构域和K结构域之间的相互作用结合；(h)结构域A和结构域F形成对第一抗原特异的第一抗原结合位点；且(i)结构域H和结构域L形成对第二抗原特异的第二抗原结合位点。

本文所述的正交突变可被进一步工程改造到该构建体的E:K配对结构域中。

6.3.6.20二价双特异性双体“BC6”

参照图51，在一系列实施方案中，结合分子具有第一、第二、第三和第四多肽链，其中(a)第一多肽链包含结构域A、结构域B、结构域D和结构域E，其中这些结构域从N-端到C-端以A-B-D-E方向排列，且结构域A具有第一VL氨基酸序列，结构域B具有人IgG1 CH3氨基酸序列，其C-末端延伸序列掺入了KSC三肽序列，其后是IgG1铰链区的DKTHT基序，结构域D具有人IgG1 CH2氨基酸序列，且结构域E具有带有S354C和T366W突变的人IgG1 CH3氨基酸；(b)第二多肽链具有结构域F和结构域G，其中这些结构域从N-端到C-端以F-G方向排列，并且其中结构域F具有第一VH氨基酸序列，而结构域G具有带有掺入GEC氨基酸二硫基序的C-端延伸序列的人IgG1 CH3氨基酸序列；(c)第三多肽链具有结构域H、结构域I、结构域J和结构域K，其中这些结构域从N-端到C-端以H-I-J-K方向排列，且其中结构域H具有第二VL氨基酸序列，结构域I具有人CLκ氨基酸序列，结构域J具有人IgG1 CH2氨基酸序列，且结构域K具有带有Y349C、D356E、L358M、T366S、L368A和Y407V突变的人IgG1 CH3氨基酸序列；(d)第四多肽链具有结构域L和结构域M，其中所述结构域从N-端到C-端以L-M方向排列，并且其中结构域L具有第二VH氨基酸序列而结构域M具有人IgG1 CH1氨基酸序列；(e)第一多肽和第二多肽通过A结构域和F结构域之间的相互作用以及B结构域和G结构域之间的相互作用结合；(f)第三多肽和第四多肽通过H结构域和L结构域之间的相互作用以及I结构域和M结构域之间的相互作用结合；(g)第一多肽和第三多肽通过D结构域和J结构域之间的相互作用以及E结构域和K结构域之间的相互作用结合；(h)结构域A和结构域F形成对第一抗原特异的第一抗原结合位点；且(i)结构域H和结构域L形成对第二抗原特异的第二抗原结合位点。

本文所述的正交突变可被进一步工程改造到E:K配对结构域中。

6.3.6.21二价双特异性双体““双特异性2

参照图51，在一系列实施方案中，结合分子具有第一、第二、第三和第四多肽链，其中(a)第一多肽链包含结构域A、结构域B、结构域D和结构域E，其中这些结构域从N-端到C-端以A-B-D-E方向排列，且结构域A具有第一VL氨基酸序列，结构域B具有带有Y349C突变的人IgG1CH3氨基酸序列和掺入PGK三肽序列(其后是IgG1铰链区的DKTHT基序)的C-端延伸序列，结构域D具有人IgG1 CH2氨基酸序列，且结构域E具有带有S354C和T366W突变的人IgG1CH3氨基酸；(b)第二多肽链具有结构域F和结构域G，其中所述结构域从N-端到C-端以F-G方向排列，并且其中结构域F具有第一VH氨基酸序列，且结构域G具有带有S354C突变的人IgG1CH3氨基酸序列和掺入PGK三肽序列的C-端延伸序列；(c)第三多肽链具有结构域H、结构域I、结构域J和结构域K，其中这些结构域从N-端到C-端以H-I-J-K方向排列，且其中结构域H具有第二VL氨基酸序列，结构域I具有人CLκ氨基酸序列，结构域J具有人IgG1 CH2氨基酸序列，且结构域K具有带有Y349C、D356E、L358M、T366S、L368A和Y407V的人IgG1 CH3氨基酸序列；(d)第四多肽链具有结构域L和结构域M，其中这些结构域从N-端到C-端以L-M方向排列，并且其中结构域L具有第二VH氨基酸序列且结构域M具有人IgG1CH1氨基酸序列；(e)第一多肽和第二多肽通过A结构域和F结构域之间的相互作用以及B结构域和G结构域之间的相互作用结合；(f)第三多肽和第四多肽通过H结构域和L结构域之间的相互作用以及I结构域和M结构域之间的相互作用结合；(g)第一多肽和第三多肽通过D结构域和J结构域之间的相互作用以及E结构域和K结构域之间的相互作用结合；(h)结构域A和结构域F形成对第一抗原特异的第一抗原结合位点；且(i)结构域H和结构域L形成对第二抗原特异的第二抗原结合位点。

本文所述的正交突变可被进一步工程改造到B:G配对结构域或E:K配对结构域中。

6.3.6.22二价双特异性双体“BC44”

参照图51，在一系列实施方案中，结合分子具有第一、第二、第三和第四多肽链，其中(a)第一多肽链包含结构域A、结构域B、结构域D和结构域E，其中这些结构域从N-端到C-端以A-B-D-E方向排列，且结构域A具有第一VL氨基酸序列，结构域B具有带有Y349C突变、P343V突变的人IgG1 CH3氨基酸序列和掺入PGK三肽序列(其后是IgG1铰链区的DKTHT基序)的C-端延伸序列，结构域D具有人IgG1 CH2氨基酸序列，且结构域E具有带有S354C突变和T366W突变的人IgG1 CH3氨基酸；(b)第二多肽链具有结构域F和结构域G，其中这些结构域从N-端到C-端以F-G方向排列，并且其中结构域F具有第一VH氨基酸序列，且结构域G具有带有S354C突变的人IgG1 CH3氨基酸序列和掺入PGK三肽序列的C-端延伸序列；(c)第三多肽链具有结构域H、结构域I、结构域J和结构域K，其中这些结构域从N-端到C-端以H-I-J-K方向排列，且其中结构域H具有第二VL氨基酸序列，结构域I具有人CLκ氨基酸序列，结构域J具有人IgG1 CH2氨基酸序列，且结构域K具有带有Y349C、T366S、L368A和Y407V的人IgG1 CH3氨基酸序列；(d)第四多肽链具有结构域L和结构域M，其中这些结构域从N-端到C-端以L-M方向排列，并且其中结构域L具有第二VH氨基酸序列且结构域M具有人IgG1氨基酸序列；(e)第一多肽和第二多肽通过A结构域和F结构域之间的相互作用以及B结构域和G结构域之间的相互作用结合；(f)第三多肽和第四多肽通过H结构域和L结构域之间的相互作用以及I结构域和M结构域之间的相互作用结合；且(g)第一多肽和第三多肽通过D结构域和J结构域之间的相互作用以及E结构域和K结构域之间的相互作用结合；(h)结构域A和结构域F形成对第一抗原特异的第一抗原结合位点；且(i)结构域H和结构域L形成对第二抗原特异的第二抗原结合位点。

本文所述的正交突变可被进一步工程改造到B:G配对结构域或E:K配对结构域中。

6.4.抗原特异性

6.4.1.B7H3

本文公开的抗体构建体具有对B7同源物3(B7H3)，也称为分化簇276(CD276)特异的抗原结合位点(ABS)。

在一些实施方案中，B7H3是靶肿瘤细胞上的细胞表面抗原。在一些实施方案中，靶肿瘤细胞是神经母细胞瘤、黑色素瘤、肉瘤或小细胞肺癌。

在优选实施方案中，本文公开的抗体构建体包含特异性结合B7H3的第一ABS。

6.4.2.GD2

本文公开的抗体构建体具有对双唾液酸神经节苷脂(GD2)特异的抗原结合位点(ABS)。

在一些实施方案中，GD2是靶肿瘤细胞上的细胞表面抗原。在一些实施方案中，靶肿瘤细胞是神经母细胞瘤、黑色素瘤、肉瘤或小细胞肺癌。

在优选的实施方案中，本文公开的抗体构建体包含特异性结合GD2的第二ABS。

6.5.实施例

下面是用于实施本发明的具体实施方案的实施例。提供实施例仅用于说明目的，并不旨在以任何方式限制本发明的范围。已努力确保所用数字(如数量、温度等)的准确性，但当然应该允许某些实验误差和偏差。

除非另有指示，本发明的实践将采用本领域技术内的蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的常规方法。这些技术在文献中得到充分解释。

6.5.1.实施例1–INV721抗体

我们构建了一种新的二价双特异性抗体，称为“INV721”，其对第一肿瘤细胞表面抗原B7同源物3(B7H3)和第二肿瘤细胞细胞表面抗原双唾液酸神经节苷脂(GD2)是特异的。B7H3特异性抗原结合位点(ABS)包含SEQ ID NO:2的重链可变区(VH))序列和SEQ ID NO:1的轻链可变区序列。GD2特异性抗原结合位点(ABS)包含SEQ ID NO:4的VH序列和SEQ IDNO:3的VL序列。

更详细地，根据图51的结构域和多肽链参考标记，INV721的结构是：

第一多肽链：

结构域A＝VL(B7H3结合区)(SEQ ID NO:1)

结构域B＝CH3

结构域D＝CH2

结构域E＝CH3

第二多肽链：

结构域F＝VH(B7H3结合区)(SEQ ID NO:2)

结构域G＝CH3

第三多肽链：

结构域H＝VL(GD2结合区)(SEQ ID NO:3)

结构域I＝CL(κ)

结构域J＝CH2

结构域K＝CH3

第四多肽链：

结构域L＝VH(GD2结合区)(SEQ ID NO:4)

结构域M＝CH1。

A结构域和F结构域结合以形成B7H3特异性抗原结合位点(A:F)。H结构域和L结构域结合以形成GD2特异性抗原结合位点(H:L)。

参照图51，INV721的B7H3结合臂包含第一多肽链和第二多肽链。B7H3结合臂为I7-01。

参照图51，INV721的GD2结合臂包含第三多肽链和第四多肽链。在一些优选实施方案中，GD2结合臂是GD2-5。在一些优选实施方案中，GD2结合臂是GD2-7。

使用哺乳动物表达可以很容易地高水平表达浓度大于100μg/mL的INV721。我们发现可以使用标准抗体纯化方法纯化二价双特异性INV721蛋白。

6.5.2.实施例2–INV721在癌细胞中的体外结合

将表达B7H3和GD2的B78黑色素瘤细胞与(1)INV721、(2)包含B7H3特异性ABS和非特异性ABS的抗体构建体、或(3)包含GD2特异性ABS和非特异性ABS的抗体构建体一起孵育。孵育后，洗涤细胞并与抗人IgG二抗一起孵育，并通过流式细胞术分析。

图52A所示结果表明观察到了INV721与B78肿瘤细胞的强结合。对于仅包含B7H3或GD2特异性ABS的抗体，观察到对B78肿瘤细胞的结合亲和力较低。相比之下，单价抗B7H3抗体以高于单价抗GD2抗体的亲和力但低于INV721的亲和力与B78肿瘤细胞结合。

如上所述，将表达GD2但不表达B7H3的B78黑色素瘤细胞与(1)、(2)和(3)一起孵育。图52B所示结果证明极少的INV72与表达GD2但不表达B7H3的肿瘤细胞结合。

评估了其他人黑色素瘤和儿童癌细胞系(包括来源于神经母细胞瘤和肉瘤肿瘤的细胞系)的GD2和B7H3表达，并检测了INV721结合。图53和图54中报告的结果显示，无论GD2表达如何，当与1μg INV721/100万细胞一起孵育时，INV721与所有被评估具有高B7H3表达的癌细胞系结合。

6.5.3.实施例3-与抗B7H3和抗GD2单克隆抗体相比INV721的内化

通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖的细胞毒性(CDC)介导肿瘤细胞死亡的治疗性抗体的疗效可能会因抗体内化到细胞而降低。因此，我们评估了INV721和治疗性抗GD2抗体地努妥昔单抗和hu14.18的细胞内化。

在高表达GD2的不同神经母细胞瘤细胞系中评估了INV721的内化，并将其与抗GD2单克隆抗体地努妥昔单抗、hu14.18和GD2-5(包含INV721的GD2结合臂)的内化进行比较。还在LAN-1细胞中与抗B7H3单克隆抗体I7-01(包含INV721的B7H3结合臂)比较了INV721的内化。

图55A-55C中的结果显示，与抗GD2单克隆抗体地努妥昔单抗和hu14.18相比，INV721(“I7-01/GD2-5/7”)的内化最小。此外，在CHLA20、LAN-1和NGP神经母细胞瘤细胞系中观察到抗GD2抗体GD2-5的内化非常少。在表达GD2和B7H3二者的LAN-1细胞中，未观察到抗B7H3抗体I7-01的内化。

6.5.4.实施例4–体外评估INV721治疗后肿瘤的生长

在有或无INV721的情况下，对B78黑色素瘤细胞进行了抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)测定，以评估INV721治疗后的肿瘤生长。简言之，将表达核定位序列的B78黑色素瘤细胞铺板于圆底平板中，所述细胞被mKate2标记并转导了GD2和/或B7H3，并使其形成肿瘤球体。将健康献血者的外周血单核细胞(PBMC)和抗体(hu14.18、INV721、利妥昔单抗作为阴性对照，或单独培养基)加入肿瘤球体中。使用IncuCyte细胞成像系统对治疗的肿瘤球体成像。包括星形孢菌素作为阳性对照。在无PBMC的情况下孵育肿瘤球体，以检测抗体介导的直接凋亡。

图56A和图56B显示了ADCC测定的结果。在图56A中，与仅使用PBMC(左栏，“培养基”)相比，使用INV721和PBMC(右栏)治疗后的明亮致密信号的散布表明，INV721通过ADCC抑制肿瘤生长。在使用INV721或抗GD2单克隆抗体Hu14.18治疗的肿瘤球体中的ADCC测定结果显示，与hu14.18相比，INV721的疗效更高(图56B)。

图57A-57C显示了抗体介导的直接凋亡的结果。表达B7H3的细胞在与INV721和PBMC一起孵育后随时间推移而被杀死(图57A和图57C)。高表达GD2但不表达B7H3的细胞与INV721和PBMC一起孵育后未被杀死(图57B)。

6.5.5.实施例5–比较INV721与抗B7H3和抗GD2单克隆抗体的体外评估

如实施例4所述进行ADCC测定以评估INV721和抗GD2单克隆抗体地努妥昔单抗和hu14.18在表达B7H3和GD2的各种黑色素瘤癌细胞系中的疗效。图58A所示结果表明，在M21细胞中，INV721具有高于地努妥昔单抗或Hu14.18的疗效。图58B-C所示结果表明，在Mel7(图58B)和Mel13(图58C)细胞中，INV721至少与地努妥昔单抗和Hu14.18一样有效。

进一步进行ADCC测定以评估INV721、抗GD2单克隆抗体地努妥昔单抗和GD2-7和抗B7H3抗体I7-01在表达B7H3和GD2二者的M21细胞中的疗效。图59所示结果表明，INV721和GD2-7在杀伤上比地努妥昔单抗更有效。I7-01几乎和INV721一样有效。

6.5.6.实施例6–INV721结合的体内评估

为了评估INV721在体内的结合，使用锆放射性标记的(

图61中的结果显示，在GD2/B7H3双阳性肿瘤(上图，每只小鼠的右下)和高表达B7H3但GD2阴性的肿瘤(上图，每只小鼠的左上)中，INV721的摄取最高。在高水平表达GD2但不表达B7H3的肿瘤中观察到INV721的最低摄取(上图，每只小鼠的左下)。相反，在表达GD2但不表达B7H3的肿瘤中观察到了地努妥昔单抗的高摄取(下图，每只小鼠的左下)。

图62A-62D中的图表显示每剂量每克肿瘤注射的

为了评估与脊柱结合并因此可能导致疼痛毒性的抗体量，对于被治疗的动物，单独测量脊柱区域(图63A)每剂量每克肿瘤注射

6.5.7.实施例7–INV721疗效的体内评估

为了评估INV721的体内疗效，用放射疗法治疗荷表达GD2和B7H3的B78黑色素瘤的小鼠，接着用INV721和/或IL-2治疗，并监测肿瘤生长和生存期。简言之，荷表达B7H3和GD2的75mm

序列

8.等效方案和通过引用并入

本文引用的所有参考文献均通过引用并入，就如同每个单独出版物、数据库条目(例如，Genbank序列或GeneID条目)、专利申请或专利为了所有目的被具体和单独地通过引用以其整体并入一样。依据37 C.F.R.§1.57(b)(1)，申请人旨在将该通过引用并入的声明与每一个单独出版物、数据库条目(如Genbank序列或GeneID条目)、专利申请或专利相关(其中每一个都应依照37C.F.R.§1.57(b)(2)进行明确鉴定)，即使此类引用并不直接跟着通过引用并入的专用声明。在说明书中包括通过引用并入的专用声明(如有)，不以任何方式削弱通过引用并入的该一般声明。本文对参考文献的引用并不旨在承认该参考文献是相关的现有技术，其也不构成对这些出版物或文件的内容或日期的任何承认。

虽然已经参照优选实施方案和各种替代实施方案具体显示和描述了本发明，但是相关领域的技术人员应理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可对其在形式和细节上进行各种改变。