E3泛素连接酶TRIM21在制备预防或治疗新型冠状病毒药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的预防或治疗，具体涉及E3泛素连接酶TRIM21在制备预防或治疗新型冠状病毒(SARS-CoV-2)药物中的应用。

背景技术

先天免疫系统(innate immune system)是宿主抵御包括SARS-CoV-2在内的病原体的第一道防线。先天免疫反应限制病毒的进入、转录、复制和组装，帮助识别和作用于受感染的细胞，协调和加速适应性免疫的发展。细胞表面、内体和胞质模式识别受体(patternrecognition receptors，PRRs)对病原体相关分子模式(pathogen-associated molecularpatterns，PAMPs)做出反应，从而触发炎症反应和程序性细胞死亡，从而限制病毒感染并促进清除。然而，过度的免疫激活会导致全身炎症和严重的疾病。为了应对先天免疫依赖的病毒清除机制，冠状病毒(CoVs)进化出了逃避策略，以限制宿主控制并增强其自身的复制和传播。研究发现IFN-I的及时应答会抑制病毒复制，从而提高自身抗病毒能力，而SARS-CoV-2可以通过不同的机制逃避IFN-I的反应。病毒的先天免疫反应与病毒复制等生命周期有关。冠状病毒核衣壳蛋白(N蛋白)在其组装和复制过程中发挥着关键作用，其功能是将单链RNA病毒基因组包裹起来，形成核糖核蛋白复合体，从而保护病毒RNA不被宿主因子降解，同时N还参与调控病毒RNA的合成。因此，如果能调控病毒N蛋白的翻译或降解，就有可能抑制病毒组装和复制，进而治疗新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染。

发明内容

本发明的目的在于提供E3泛素连接酶TRIM21在制备预防或治疗新型冠状病毒(SARS-CoV-2)药物中的应用。

除特殊说明外，本发明所述份数均为重量份，所述百分比均为质量百分比。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

E3泛素连接酶TRIM21在制备预防或治疗新型冠状病毒(SARS-CoV-2)药物中的应用；所述E3泛素连接酶TRIM21的氨基酸序列如下(SEQ ID NO.1)：

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有益效果

本发明提供E3泛素连接酶TRIM21在预防或治疗新型冠状病毒(SARS-CoV-2)药物中的应用。研究发现，E3泛素连接酶TRIM21在体内外对SARS-CoV-2N蛋白均有降解作用，有开发成为预防或治疗新型冠状病毒(SARS-CoV-2)药物的潜力。

附图说明

图1是腺病毒Ad-N重组质粒构建成功酶切验证图；

图2是WB验证HEK293细胞中N蛋白的表达结果图；

图3是四种细胞系中与N蛋白相互作用的宿主因子图；

图4是N与TRIM21相互作用结果图；

图5是TRIM21对N存在负调控作用结果图；

图6是TRIM21在小鼠体内对N蛋白的降解结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行具体描述，在此指出以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术熟练人员可以根据上述发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。本发明所用原料及试剂均为市售产品。

实施例1

材料和方法：

细胞培养：将50mL胎牛血清(Clark)加入500mL的DMEM培养基(Gibco)中，使其终浓度约为10％左右，再加入5mL双抗(碧云天)，供后续培养使用。人胚胎肾细胞HEK293(ATCC)，将人肺上皮细胞BEAS-2B(中乔新舟)，人肝星状细胞系LX-2(Procell)和人心肌细胞AC16(中乔新舟)中置于上述配置好的完全培养基中，于37℃，5％CO

细胞转染：

根据实验所需，适量细胞接种在合适的培养皿中，并使用Lipo8000转染试剂(碧云天)，在细胞密度在70％-90％左右进行转染。转染8小时后，给细胞换上新鲜的完全培养基,根据实验需要继续培养一定的时间。

蛋白提取：

1.从孵箱中取出培养皿后弃去培养基，无菌PBS洗去残存的培养基3次；

2.加入适量体积的蛋白裂解液(RIPA和PMSF按100：1混匀)，冰上裂15mins，裂解完全的细胞移入1.5mL EP管中，12000g 4℃15mins；

3.收集上清，移入新的1.5mL EP管中；

4.测浓度：10μL待测样品中加入200μL BCA液，37℃孵育30mins，562nm测量吸光度并计算样品浓度。

免疫沉淀(Immunoprecipitation)：

1.抗原样品制备：移去培养基，10cm细胞培养皿用1mL 1×PBS(pH 7.4)洗涤3次；用细胞刮棒刮脱细胞，收集至1.5mL EP管内，在10cm细胞培养皿中加入1mL细胞裂解缓冲液，同时加入蛋白酶抑制剂，混匀后置于冰上处理10

mins，离心(4℃,14000g,10mins)，收集上清液，置于冰上备用(或置于-20℃

长期保存)；

2.抗原抗体反应：1mg步骤1准备的蛋白样品里加入1μL抗体，置于翻转混合仪4℃旋转孵育过夜；

3.磁珠预处理：将磁珠充分混悬，取30μL磁珠，置于1.5mL EP管中，加500

μL结合/洗涤缓冲液，充分混悬,置于磁力架，磁性分离，弃上清，重复以上洗涤步骤3次；

4.磁珠与抗原-抗体复合物结合：加入步骤2中的抗原抗体复合物，充分混悬，置于翻转混合仪孵育(4℃，4hours)，磁性分离，弃上清。

5.洗涤：使用500μL结合/洗涤缓冲液充分重悬磁珠，磁性分离，弃上清，重复洗涤4次，最后一次移入新的1.5mL EP管中；

6.抗原洗脱：分离磁珠，弃上清，向磁珠中加入30μL 1×SDS-PAGE LoadingBuffer混合均匀，95℃加热5mins。分离磁珠，收集上清，进行SDS-PAGE检测。

免疫印迹实验(Western blotting)：

第一天

1.配置12％蛋白电泳凝胶，上样20μg；

2.配置1x电泳液，恒压90V，电泳30mins,恒压150V，电泳1h；

3.裁剪适当大小的PVDF膜(提前甲醇活化30s),配置1x电转液，水浴式转膜；

4.恒流300mA1h 30mins；

5.配置5％脱脂牛奶用于封闭电转完的PVDF膜，室温孵育2h；

6.弃去封闭液，并用配置好的灭菌1x TBST洗去残留的脱脂牛奶；

7.孵育一抗，稀释比例1：1000，4℃摇床过夜。

第二天

8.回收一抗，1x TBST洗去残留的一抗，每次10mins，洗3次；

9.孵育二抗，稀释比例1：4000，室温，摇床1h；

10.弃去二抗，1x TBST洗去残留的二抗，每次10mins，洗3次；

11.使用ECL液在凝胶成像仪上曝光。

总RNA提取：

1.6孔培养皿从培养箱中取出后立即用无菌PBS清洗3次后加入1mL TRIzol试剂；

2.将细胞转移到1.5mL无RNA酶EP管中。置冰上，静置5分钟；

3.每管加入200μL氯仿，充分混合后冰上静置10分钟；

4.在4℃下13000rpm离心15分钟；期间，取一新EP管，加入500μL异丙醇，冰上预冷；

5.离心后，将上层水相(约500μL)转移到该新的EP管中；

6.冰上静置，酒精沉淀10mins；

7.离心，13000rpm，10mins；

8.去除上清液，用1mL新鲜配置的75％乙醇洗涤RNA沉淀一次；

9.12000rpm离心5mins；

10.去掉上清，风干RNA沉淀5-10mins；

11.将RNA溶解在30μL DEPC水中；

12.进行分光光度分析以确定样品浓度和纯度。

具体操作与结果：

①构建过表达N蛋白的腺病毒

基于新冠病毒的基因序列，通过密码子优化后合成新冠病毒N基因，构建相应的真核细胞表达质粒，并将N基因克隆至腺病毒系统穿梭载体(pAdTrack)上。新冠病毒N蛋白的氨基酸序列如下(SEQ ID NO.2)：

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将携带目的基因片段的穿梭质粒线性化后转入BJ5183-AD-1感受态中进行同源重组，挑取重组子进行酶切鉴定，挑选酶切鉴定正确的重组质粒，进行下一步的包装(图1)。将筛选到的重组质粒运用脂质体法转染到293A细胞中，经过扩增和纯化，完成表达N蛋白的重组腺病毒的制备并在HEK293细胞中通过免疫印迹实验验证了其N蛋白的表达(图2)。

②筛选N相互作用的宿主蛋白

将重组腺病毒分别感染人胚肾细胞HEK293、人支气管上皮样细胞BEAS-2B、人肝星型细胞LX-2和人心肌细胞AC-16四种细胞系，利用N单抗检测N蛋白的表达水平。细胞裂解后利用N单抗进行俘获，利用Protein A/G磁珠进行蛋白-抗体复合物的富集，然后进行SDS-PAGE电泳，切胶后利用质谱高通量检测筛选与病毒N蛋白质相互作用的宿主蛋白质。

③数据分析

分析发现四组细胞质谱鉴定的相互作用蛋白质中，有三个基因(TRIM21、LSG1和VCP)同时存在(图3)，TRIM21是一种E3泛素连接酶，它与泛素蛋白酶体系统相关，因此后续主要聚焦在TRIM21靶向新型冠状病毒N蛋白相关研究。

④N蛋白与TRIM21之间存在相互作用

N蛋白和TRIM21的结构域分别在图4A中简单展示。首先通过免疫印迹实验验证N蛋白和TRIM21之间的相互作用。将编码N-Myc蛋白的质粒转染到HEK293细胞中，发现N-Myc与内源TRIM21相互作用(图4B)。为了寻找TRIM21与N蛋白的相互作用区域，在体外构建了带有Flag标签的TRIM21质粒，以及它的截短体：RING&B-box(氨基酸残基1-129)、SMC(氨基酸残基122-270)和SPRY(氨基酸残基287-465)。将它们与表达N蛋白的质粒共转染到HEK293细胞中。结果发现，N蛋白与全长TRIM21(WT)和SPRY(图4C)相互作用。SPRY结构域通常作为蛋白质相互作用的平台，并显示出显著的蛋白质结合特异性。将截短体NTD(氨基酸残基1-176)、LKR(氨基酸残基173-256)和CTD(氨基酸残基253-419)构建到pEGFP-N1载体上，并将它们与Flag标记的TRIM21质粒在HEK293细胞中共转染，只观察到CTD与TRIM21(图4D)相互作用。为了进一步验证TRIM21和N蛋白各自的相互作用区域，将编码Flag标记的SPRY的质粒与编码GFP标记的CTD的质粒在HEK293中共转染，观察到SPRY与CTD(图4E)相互作用，这进一步强调了TRIM21通过SPRY结构域与N的CTD结构域相互作用。综上所述，这些观察结果最终表明N蛋白与TRIM21密切相互作用，它们的相互作用结构域分别是CTD和SPRY。

RING&B-box氨基酸序列(SEQ ID NO.3):

SMC氨基酸序列(SEQ ID NO.4)：

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SPRY氨基酸序列(SEQ ID NO.5):

NTD氨基酸序列(SEQ ID NO.6)：

LKR氨基酸序列(SEQ ID NO.7)：

CTD氨基酸序列(SEQ ID NO.8):

⑤TRIM21对N存在负调控作用

发明人在HEK293、BEAS-2B、AC-16和LX-2细胞系中进行了以下实验：在这四种细胞中共转染相同量的表达N蛋白的质粒和递增量的表达Flag-TRIM21的质粒。发明人发现TRIM21过表达以剂量依赖的方式降低N蛋白水平(图5A-图5D)。为了进一步验证TRIM21对N蛋白的抑制作用，发明人首先试图通过4种针对TRIM21的特异性小干扰RNA(siRNAs)下调HEK293细胞中内源性TRIM21的表达。在这4种特异性siRNAs中，siTRIM21①和siTRIM21②对TRIM21基因表达的抑制作用显著，抑制率达50％以上(图5E)。与蛋白质印迹实验的结果一致，发明人通过qRT-PCR发现这两个siRNA(在随后的实验中选择使用)能够有效地抑制HEK293细胞中TRIM21 mRNA的水平(图5F)。当N蛋白与siTRIM21①和siTRIM21②共转染HEK293细胞时，抑制TRIM21显著增强了N蛋白的表达(图5G)。通过TRIM21的过表达挽救，发明人发现HEK293细胞中N蛋白的表达再次下降(图5H)。

敲低TRIM21的siRNA序列和评估TRIM21 mRNA表达水平的引物序列

⑥TRIM21在小鼠体内对N蛋白也有降解作用

将表达TRIM21和N蛋白的基因成功整合到靶向肺的AAV病毒中，通过尾静脉注射一定滴度的AAVs到BALB/c小鼠体内，注射后2周取小鼠肺组织进行免疫印迹实验。结果显示，TRIM21在小鼠体内也有降解N蛋白的作用(图6)。这些观察结果表明，TRIM21在体内外对SARS-CoV-2N蛋白均有降解作用。