FTO在筛选用于治疗肾间质纤维化药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，更具体的说是涉及FTO在筛选用于治疗肾间质纤维化药物中的应用。

背景技术

肾间质纤维化是慢性肾脏疾病的最终表现，与慢性肾病进行性发展密切相关，是最终导致终末期肾衰竭的主要病因。涉及的机制包括有肾小管上皮及间质的损伤、成纤维细胞的增殖、细胞外基质成分增多和(或)降解减少、血管活性物质和细胞因子的参与、炎性细胞的浸润等。近来，慢性肾脏疾病的患病人数逐年上升，而治疗慢性肾脏疾病的花费高，并且如不及时接受治疗，当病情进展最终将发展成为终末期肾病，此时，患者需要通过透析或者肾脏移植才能维持生命，患者的生命质量也严重下降，对个人、家庭、社会甚至是国家方面都造成沉重的负担。因此慢性肾脏疾病的早发现、早治疗应得到重视。肾间质纤维化作为慢性肾脏疾病的共同表现，目前尚无针对肾间质纤维化的有效治疗方法，因此根据肾间质纤维化发病特点，发现新的治疗靶点是临床控制慢性肾脏疾病进展的重要一环。

N6-甲基腺嘌呤(m

因此，提供FTO在筛选用于治疗肾间质纤维化药物中的应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了FTO在筛选用于治疗肾间质纤维化药物中的应用，研究基于FTO作为药物作用靶点治疗肾间质纤维化的作用机制，并提供该药物靶点的肾间质纤维化治疗药物的筛选方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

FTO作为药物作用靶点在筛选用于治疗肾间质纤维化药物中的应用。

进一步，所述药物抑制FTO表达。

所述肾间质纤维化治疗药物可起到以下作用的一项或多项：

(1)抑制FTO表达；

(2)上调m

(3)促进P62、LC3表达水平增加；

(4)促进细胞自噬发生；

(5)抑制胶原纤维形成；

(6)缓解肾间质纤维化。

进一步，FTO抑制剂在制备治疗肾间质纤维化药物中的应用。

进一步，一种筛选肾间质纤维化治疗药物的方法，以FTO作为药物作用靶点，挑选出FTO的抑制剂作为肾间质纤维化治疗候选初筛药物。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了FTO在筛选用于治疗肾间质纤维化药物中的应用，本发明通过一系列体内体外实验，发现肾间质纤维化治疗药物激活细胞自噬信号通路，抑制纤维化形成，缓解肾间质纤维化；通过westernblot、免疫荧光、免疫组化以及dotblot等方法，发现FTO表达水平改变在调控细胞自噬信号通路上发挥重要作用，肾间质肾纤维化治疗药物可以抑制FTO表达；通过上调细胞FTO表达水平发现，肾间质纤维化治疗药物激活自噬信号通路缓解肾间质纤维化的作用被消除。本发明为肾间质纤维化治疗药物提供了新的靶点，为肾间质纤维化治疗药物的筛选提供了新平台。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明给予Cana干预后，IHC染色结果；

图2附图为本发明给予不同剂量Cana处理HK2细胞后，FTO蛋白的Westernblot结果；

图3附图为本发明给予Cana后，m

其中，Ctrl为HK2细胞未给予Cana处理；Cana为HK2细胞给予Cana20μM处理；*表示p<0.05,差异具有统计学意义；

图4附图为本发明给予Cana后，Dotblot结果；

其中，Group1和Group2为重复实验，500ng与250ng为加入mRNA的量；MB为使用亚甲蓝染色，作为内参；

图5附图为本发明UUO组、UUO+Cana组H&E染色结果；

图6附图为本发明UUO组、UUO+Cana组天狼星红染色结果；

图7附图为本发明Cana干预后，纤维化相关蛋白FN与α-SMA表达的Westernblot结果；

图8附图为本发明给予不同剂量Cana后，自噬相关蛋白P62、LC3表达的Westernblot结果；

图9附图为本发明给予不同剂量Cana后，LC3表达的免疫荧光结果；

图10附图为本发明肾小管上皮细胞特异性敲除Atg7小鼠给予Cana干预后，IHC染色结果；

图11附图为本发明肾小管上皮细胞特异性敲除Atg7小鼠给予Cana干预后，H&E染色结果；

图12附图为本发明肾小管上皮细胞特异性敲除Atg7小鼠给予Cana干预后，天狼星红染色结果；

图13附图为本发明HK2细胞进行FTO质粒转染后，给予Cana20μM处理后的免疫荧光结果；

其中，Vector为进行空白载体转染；oeFTO为转染FTO质粒；NC为不给予Cana处理；

图14附图为本发明HK2细胞进行FTO质粒转染后，给予Cana20μM处理后的Westernblot结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1构建小鼠肾间质纤维化模型

(1)单侧输尿管结扎(UUO)模型：戊巴比妥钠麻醉小鼠后，将小鼠手脚仰面固定于操作台，以腹中线向右两横指脊柱旁为切口，消毒皮肤后，切开暴露肾脏，在肾下极找到输尿管，钝性分离周围组织后，用手术缝线结扎，随后依次缝合腹膜与皮肤。

(2)研究对象：C57BL/6小鼠，建模方法如下：

构建单侧输尿管结扎(UUO组)以及卡格列净(Cana)干预UUO(UUO+Cana组)两个实验组。其中，UUO组小鼠适应性喂养一周后，行单侧输尿管结扎术，具体步骤见步骤(1)的UUO模型；UUO+Cana组小鼠行UUO手术后给予Cana灌胃(20mg/(kg·d))；两组小鼠均饲养3周后处死收集肾脏组织。

(3)肾脏病理切片制作：

小鼠肾脏组织置于4％多聚甲醛溶液固定1周后，取出组织进行修整并洗去残留在组织中的多聚甲醛，梯度脱水(85％乙醇溶液处理2小时，95％乙醇溶液处理1小时后换新的95％乙醇溶液再处理1小时，无水乙醇溶液处理0.5小时后换新的无水乙醇溶液再处理0.5小时)。脱水后，用二甲苯处理30分钟，换新的二甲苯溶液再处理10分钟使组织透明。组织透明后进行浸蜡处理(每一小时更换一次石蜡，共处理3小时)。随后，将经过透蜡的组织连同熔化的石蜡一起倒入容器内，投入冷水中，使其立刻凝固成蜡块。组织包埋后进行组织切片，而后将其贴在载玻片上，最后放在60℃烘箱中经过5小时干燥后取出待用。

(4)免疫组化(immunohistochemistry，IHC)染色：

石蜡切片常规脱蜡水化：先用二甲苯溶液浸泡10分钟，取出换新的二甲苯再次浸泡10分钟；紧接着用无水乙醇浸泡4分钟，更换新的无水乙醇后再次浸泡4分钟；而后用95％乙醇浸泡4分钟，80％乙醇再次浸泡4分钟；最后用流水冲洗5分钟，阴干，待染色。将切片置于切片架上，放入盛有1×柠檬酸盐缓冲液的容器中，在电磁炉上煮至沸腾，沸腾后再煮8分钟，关闭电磁炉，冷却5分钟；重复此过程(抗原修复)3遍。抗原修复完毕后，将切片置于冰上冷却20分钟；冷却后水洗5分钟；将切片放入盛有1×PBS溶液的染色缸，置于摇床上洗5分钟。擦干切片上的水渍，将3％的H

IHC结果如图1，棕色颗粒代表FTO蛋白表达量，UUO组小鼠肾组织切片中棕色颗粒多，表示FTO蛋白表达水平高，Cana干预组肾组织切片中棕色颗粒显著减少表示FTO表达水平下降。上述结果表明，给予Cana干预后，UUO所致FTO蛋白表达水平上调被抑制，表明Cana可显著抑制FTO表达。

实施例2

HK2细胞无血清培养24h后，分四组给予Cana0μM，5μM，10μM，20μM处理后，应用Westernblot实验检测m

WesternBlot：

按照试剂说明书配制凝胶。将配制好的SDS-PAGE胶放入电泳装置内，缓慢倒入电泳液，拔出凝胶里的梳子，将样品和蛋白marker加入凝胶孔内，每孔10μL。将电压调至75V，恒压跑胶，待到出现蛋白marker条带时，将电压调至180V。待样品跑至接近电泳底部时停止电泳。关闭电源，取出凝胶板，自来水冲去多余跑胶液。将PVDF膜提前用甲醇激活15秒，连同转膜所需滤纸、海绵一并放入转膜液中。起胶，将凝胶扣入转膜液中，依次按厚海绵，厚滤纸，凝胶，PPVDF膜，薄滤纸，薄海绵放置，准备转膜。将电压调至75V，转膜2小时。而后将转好的膜取出，依次经甲醇激活，三蒸水漂洗，丽春红染色5分钟后显示蛋白，拍照记录原始数据，按加样方向在膜的右上角切去一小角以示标记。进行一抗4℃孵育过夜，PBST洗4次，每次5分钟。孵育二抗，1小时后，PBST洗4次，每次5分钟。最后，扫膜。

Westernblot结果如图2，给予不同剂量Cana处理HK2细胞后，FTO蛋白表达水平显著下降。

实施例3

HK2细胞无血清培养24h后，给予Cana20μM处理后，进行m

(1)m

小鼠肾HK2细胞总RNA提取：将细胞收集到离心管中，加入500μlTrizon后加入100μl氯仿，剧烈摇晃50次，静置2min后离心(12000rpm，4℃，15min)，将上层无色水相转移至新的离心管中，加入等体积异丙醇后，轻柔上下颠倒混匀后，室温静置20min，离心(12000rpm，4℃，20min)，可见管底的白色沉淀即RNA；将上清弃去后，加入700μl预冷的70％乙醇，上下颠倒混匀后，离心(12000rpm，4℃，5min)，如此重复3次，最后一次将上清弃去后开盖使残余酒精挥发；最后加入RNase-Free水溶解RNA，置于57℃8min后立即置于冰上10min，检测浓度。

应用EpiQuikm

m

(2)Dotblot

在尼龙膜上加入等体积样本mRNA，待膜自然晾干后，置于紫外交联仪中交联30min，随后使用5％脱脂奶粉进行封闭，1h后置于m

Dotblot结果如图4，两次重复实验结果表明给予Cana后，加入250ng或500ngmRNA，细胞中m

实施例4

UUO与UUO+Cana模型构建以及肾脏病理切片制作同实施例1。

(1)苏木精-伊红(Hematoxylin-Eosin，H&E)染色：

将小鼠肾脏石蜡切片脱蜡水化：先用二甲苯溶液浸泡10分钟，取出换新的二甲苯再次浸泡10分钟；紧接着用无水乙醇浸泡4分钟，更换新的无水乙醇后再次浸泡4分钟；而后用95％乙醇浸泡4分钟，80％乙醇再次浸泡4分钟；最后用流水冲洗5分钟，阴干，待染色。

染色：将脱水后已入蒸馏水的切片放入苏木精水溶液中染色5分钟后用自来水冲洗，将切片上残余的水吸干；把切片在酸水及氨水中分化数秒；流水冲洗2小时后放入蒸馏水中片刻；而后放入70％和90％乙醇中脱水各10分钟；放入酒精伊红染色液染色2-3分钟。在95％乙醇、95％乙醇、无水乙醇、无水乙醇分别浸泡5分钟，层级梯度脱水。二甲苯浸泡5分钟，最后获得中性树胶封片。

(2)天狼星红(SiriusRed)染色：

采用SiriusRed/FastGreenCollagen染色液试剂盒。石蜡切片常规脱蜡水化(参见上述苏木精-伊红染色脱蜡水化)。天狼星红染色液滴染1h，随后流水稍微冲洗，去除切片表面染液；而后苏木素染色液染核8-10分钟，流水冲洗10分钟；最后常规脱水透明，中性树胶封固。

UUO组、UUO+Cana组H&E染色结果见图5，箭头所指处代表炎性细胞浸润，肾小管上皮细胞萎缩，管腔扩张；天狼星红染色结果见图6，箭头所指处代表胶原纤维蓄积，给予Cana干预后，UUO所致肾间质胶原纤维形成减少，提示Cana干预可以改善UUO所致肾间质纤维化。

(3)WesternBlot：

按照试剂说明书(8％SDS-PAGE凝胶超快速配制试剂盒，碧云天，P0688)配制凝胶。将配制好的SDS-PAGE胶放入电泳装置内，缓慢倒入电泳液，拔出凝胶里的梳子，将样品(待测样本，即收集各实验组的组织或细胞制作成蛋白样品)和蛋白marker加入凝胶孔内，每孔10μL。将电压调至75V，恒压跑胶，待到出现蛋白marker条带时，将电压调至180V。待样品跑至接近电泳底部时停止电泳。关闭电源，取出凝胶板，自来水冲去多余跑胶液。将PVDF膜提前用甲醇激活15秒，连同转膜所需滤纸、海绵一并放入转膜液中。起胶，将凝胶扣入转膜液中，依次按厚海绵，厚滤纸，凝胶，PPVDF膜，薄滤纸，薄海绵放置，准备转膜。将电压调至75V，转膜2小时。而后将转好的膜取出，依次经甲醇激活，三蒸水漂洗，丽春红染色5分钟后显示蛋白，拍照记录原始数据，按加样方向在膜的右上角切去一小角以示标记。进行一抗4℃孵育过夜，PBST洗4次，每次5分钟。孵育二抗，1小时后，PBST洗4次，每次5分钟。最后，扫膜。

Westernblot结果见图7，结果显示Cana干预后，纤维化相关蛋白FN与α-SMA表达水平显著下调。进一步确认Cana干预可以显著抑制肾间质纤维化形成过程。

实施例5

HK2细胞无血清培养24h后，分四组给予Cana0μM、5μM、10μM、20μM处理后，Westernblot以及免疫荧光检测自噬相关蛋白P62、LC3表达水平。

Westernblot结果见图8，给予Cana处理后，细胞自噬相关标志蛋白P62与LC3表达水平增加。

细胞免疫荧光实验：

分别将各管细胞取少量至1.5mL的EP管中，4℃离心后，用离心前等体积的4％多聚甲醛室温重悬45分钟，各取5μL滴在粘附载玻片上，用枪头涂布开大概和8mm边长盖玻片差不多大小区域；室温干燥后(至微发白，不可干透)，组化笔在细胞外围画圈，滴加PBS润湿洗涤；擦去多余液体，用羊血清工作液封闭2h；PBS洗涤5分钟3次；擦去多余液体，滴加一抗4℃孵育过夜；PBS洗5分钟3次；滴加二抗(1:500，5％BSA稀释)，室温或37℃孵育1h；PBS洗5分钟3次；Hoechst封片剂封片，荧光显微镜观察。免疫荧光结果如图9，当Cana剂量达到10μM及以上时，红色颗粒显著增加，表示LC3表达水平增加，自噬小体形成，激活细胞自噬。

实施例6

肾小管上皮细胞特异性敲除Atg7小鼠给予Cana干预肾间质纤维化模型构建：

Cana+UUO模型构建同实施例1，收集肾脏组织进行免疫组化、H&E以及天狼星红染色实验。

肾组织切片染色结果如图10-12所示，IHC结果见图10，野生型小鼠给予cana干预后，自噬标志蛋白LC3表达水平显著增加，而敲除小鼠肾小管上皮细胞Atg7基因后，cana干预上调自噬标志蛋白LC3表达水平的作用消失，表明自噬被有效抑制；图11中箭头所指代表管腔扩张，图12中箭头所指代表胶原纤维蓄积，肾组织H&E染色和天狼星红染色结果显示i)Cana干预缓解UUO所致小鼠肾小管上皮细胞萎缩、管腔扩张变形以及纤维化程度；ii)肾小管上皮细胞特异性敲除Atg7小鼠给予Cana干预后，Cana缓解肾脏损伤以及纤维化作用被减弱或消除。以上结果显示，Cana通过自噬途径缓解UUO所致肾间质纤维化。

实施例7

HK2细胞无血清培养24h后，进行空白质粒(5’-flag-pCDNA3.0，上海钦诚生物科技有限公司)或FTO质粒转染(转染FTO质粒上调细胞中FTO表达水平，即过表达FTO)，随后给予Cana20μM处理，进行Westernblot与免疫荧光实验。

FTO质粒构建：

(1)引物设计：通过NCBI网站查询目的基因-FTO的CDS序列(SEQ IDNO.1)，根据基因序列以及表达载体的类型确定双酶切位点(NotI、XbaI)，设计引物。

gcggtggcgaaggcggctttagtggcagcatgaagcgcaccccgactgccgaggaacgagagcgcgaagctaagaaactgaggcttcttgaagagcttgaagacacttggctcccttatctgacccccaaagatgatgaattctatcagcagtggcagctgaaatatcctaaactaattctccgagaagccagcagtgtatctgaggagctccataaagaggttcaagaagcctttctcacactgcacaagcatggctgcttatttcgggacctggttaggatccaaggcaaagatctgctcactccggtatctcgcatcctcattggtaatccaggctgcacctacaagtacctgaacaccaggctctttacggtcccctggccagtgaaagggtctaatataaaacacaccgaggctgaaatagccgctgcttgtgagaccttcctcaagctcaatgactacctgcagatagaaaccatccaggctttggaagaacttgctgccaaagagaaggctaatgaggatgctgtgccattgtgtatgtctgcagatttccccagggttgggatgggttcatcctacaacggacaagatgaagtggacattaagagcagagcagcatacaacgtaactttgctgaatttcatggatcctcagaaaatgccatacctgaaagaggaaccttattttggcatggggaaaatggcagtgagctggcatcatgatgaaaatctggtggacaggtcagcggtggcagtgtacagttatagctgtgaaggccctgaagaggaaagtgaggatgactctcatctcgaaggcagggatcctgatatttggcatgttggttttaagatctcatgggacatagagacacctggtttggcgataccccttcaccaaggagactgctatttcatgcttgatgatctcaatgccacccaccaacactgtgttttggccggttcacaacctcggtttagttccacccaccgagtggcagagtgctcaacaggaaccttggattatattttacaacgctgtcagttggctctgcagaatgtctgtgacgatgtggacaatgatgatgtctctttgaaatcctttgagcctgcagttttgaaacaaggagaagaaattcataatgaggtcgagtttgagtggctgaggcagttttggtttcaaggcaatcgatacagaaagtgcactgactggtggtgtcaacccatggctcaactggaagcactgtggaagaagatggagggtgtgacaaatgctgtgcttcatgaagttaaaagagaggggctccccgtggaacaaaggaatgaaatcttgactgccatccttgcctcgctcactgcacgccagaacctgaggagagaatggcatgccaggtgccagtcacgaattgcccgaacattacctgctgatcagaagccagaatgtcggccatactgggaaaaggatgatgcttcgatgcctctgccgtttgacctcacagacatcgtttcagaactcagaggtcagcttctggaagcaaaaccctagaaggagcacaag；SEQ ID NO.1。

其中，引物序列如下：

h-FTOprimerF

h-FTOprimerR

(2)PCR扩增：引物合成后，配置成浓度为10μM溶液后，按照说明书(HiScriptIIQSelectRTSuperMixforqPCR，南京诺唯赞，R232-01)加入模板DNA(从HK2细胞中提取)以及试剂盒中相应试剂，进行扩增获得目的基因片段，进行水平凝胶电泳后回收纯化目的基因片段；

扩增体系：2Xsupermix10μl，TamplateDNA2μl，h-FTOprimerF

扩增程序：94℃5min，94℃20Sec，50℃20Sec，35cycles；72℃1min；72℃5min。

(3)目的基因片段与载体限制性酶切：将5’-flag-pCDNA3.0以及经纯化后的目的片段根据需要加入到相应的限制性核酸内切酶中，经过酶切后获得相同的粘性末端；

(4)连接转化：上一步骤获得的酶切后的目的基因片段以及载体中，加入T4连接酶，置于室温中连接过夜；第二天取连接产物与大肠杆菌混匀后置于37℃孵育2小时，然后吸取部分菌液均匀涂布于固体平板中，置于37摄氏度恒温培养箱中培养过夜；24小时后挑取5个单菌落进行酶切验证。

免疫荧光结果见图13，过表达FTO后，Cana所致细胞P62表达水平上调被抑制；Westernblot结果如图14，给予Cana后，自噬相关蛋白P62与LC3I/II表达水平显著增加，过表达FTO后，P62与LC3I/II表达水平与对照组无差异。以上结果表明，Cana通过抑制FTO表达上调m6ARNA甲基化水平，增强基因稳定性，促进P62与LC3表达，促进自噬发生，缓解肾间质纤维化。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。