绢毛委陵菜PsSPMS基因及其应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，具体地说，本发明涉及绢毛委陵菜PsSPMS基因及利用该基因提高转基因植物抗重金属镉的应用。

背景技术

重金属镉(Cd)是人体非必需元素，当环境受到镉污染后，镉可在生物体内富集，通过食物链进入人体引起慢性中毒。土壤重金属污染严重制约人类生活和农业生产。重金属污染导致土壤退化、养分流失和农作物产量下降，而且通过地表径流、地下水循环等污染水资源，严重威胁人类生存和生态环境。镉在土壤中的污染具有潜伏性、累积性和不可逆性，并且在土壤中的污染不仅面积大，而且作用时间长。因此，防治、降低重金属镉污染的负面效应以及加强污染土壤的修复，对于改善生态环境和确保农业生产生活的安全性具有重要意义。

绢毛委陵菜(Potentilla sericea)为蔷薇科(Rosaceae)蔷薇亚科(RosoideaeFocke)委陵菜属(Potentilla)的多年生草本植物，主要分布在我国东北地区，耐阴、耐寒、耐旱、耐贫瘠、耐粗放管理，生长在山坡、林缘、草原及砂地。株型较矮小、绿期和花期较长，是固土护坡、保护环境的优良地被植物，具有很高的应用价值，可成为良好的园林绿化资源。当前对绢毛委陵菜的研究多集中在林下地被、药用价值、逆境生理等方面，缺乏分子水平层面上的研究。

多胺(Polyamines，PAs)是一类含有两个至多个氨基的化合物，多胺具有促进组织生长、膜的正常维持、生理抗性等功能。在植物中，大量存在的多胺是腐胺(Putrescine，Put)、亚精胺(Spermidine，Spd)和精胺(Spermin，Spm)。其中Put在亚精胺合酶(Spermidinesynthase，SPDS)和精胺合酶(Spermine synthase，SPMS)的催化下依次连续生成Spd和Spm。Spm在植物抗逆过程中发挥重要作用，比如在Cd胁迫条件下，植物内活性氧积累导致生物膜脂质过氧化，大量实验证明，Spm一方面在酶促系统通过提高超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase，SOD)、过氧化物酶(Peroxidase，POD)、过氧化氢酶(Catalase，CAT)等保护酶的活性，减轻活性氧对生物膜的危害；另一方面在非酶促系统通过提高谷胱甘肽(Glutathione，GSH)和抗坏血酸(Aseorbate peroxidase，APX)抗氧化非酶物质的含量，减少过氧化氢(H

发明内容

本发明的目的是克隆绢毛委陵菜PsSPMS基因及其编码的蛋白质。

本发明的另一目的是提供绢毛委陵菜PsSPMS基因的应用。

为了实现本发明目的，本发明提供了绢毛委陵菜PsSPMS基因，是编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：

(a)由SEQ.NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)SEQ.NO.2所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白。

本发明PsSPMS基因受NaCl、干旱、锌和镉胁迫诱导后启动表达，其中镉胁迫最为明显。

本发明PsSPMS基因的核苷酸序列如SEQ.NO.1所示。本发明采用如下方法克隆得到PsSPMS基因。

(1)以绢毛委陵菜根系为材料提取总RNA，并将提取得到的总RNA反转录为cDNA。在本发明中，绢毛委陵菜总RNA的提取采用植物分子生物学常用的提取细胞总RNA的技术方案即可，本发明的实施例中具体的采用OMEGA公司的总RNA提取试剂盒完成。

(2)在提取得到绢毛委陵菜总RNA后，将所述总RNA反转录合成cDNA。在本发明中，所述的总RNA反转录成cDNA的方法采用植物分子生物学常用的总RNA反转录的技术方案即可，本发明的实施例中具体的采用OMEGA公司的反转录试剂盒完成。

(3)在得到cDNA之后，进行PsSPMS基因PCR扩增，得到目的片段。在本发明中，所述PsSPMS基因PCR扩增的体系优选为25μl体系，包括10×Taq Buffer 2.5μl，2mM dNTPs2.5μl，25mM MgSO

用软件Primer Premier 5.0设计引物扩增PsSPMS。引物序列如下：

上游引物PsSPMS-F：5'-TGTTTCATCTGCGACTGGAG-3'

下游引物PsSPMS-R：5'-CGACCCATTTCAATAATCAGG-3'

(4)在PCR扩增得到目的片段后，将所述目的片段进行测序，得到PsSPMS基因。本发明所述的PCR扩增后优选的对目的片段进行纯化，所述纯化方法采用植物分子生物学常用的DNA纯化技术方案即可，无其它特殊要求；具体的本发明实施例中采用OMEGA公司的纯化DNA试剂盒完成。

(5)纯化完成后，优选将所述纯化后的目的片段连接到

本发明还提供含有所述PsSPMS基因的生物材料，所属生物材料为表达载体、克隆载体、大肠杆菌、农杆菌或转基因细胞系。

本发明还提供所述PsSPMS基因或含有该基因的生物材料在植物抗镉调控中的应用。

本发明所述植物包括但不限于拟南芥、绢毛委陵菜。

本发明还提供所述PsSPMS基因或含有该基因的生物材料在制备转基因植物中的应用。

本发明还提供所述PsSPMS基因或含有该基因的生物材料在植物新品种培育中的应用。

所述新品种培育的目的是为了提高植物的抗镉能力。PsSPMS基因参与绢毛委陵菜镉胁迫应答，镉胁迫诱导该基因的表达。

优选地，将所述PsSPMS基因转入到拟南芥植株中，使PsSPMS基因过表达。更优选地采用农杆菌介导法和花序侵染法将PsSPMS基因转入到拟南芥植株中，获得PsSPMS基因过表达转基因植株。更优选地，将PsSPMS基因构建到植物表达载体PBI121-GFP上，转化农杆菌，然后浸染拟南芥花序，筛选过表达转基因植株。

在本发明的一个具体实施方式中，重组植物表达载体PBI121-PsSPMS-GFP的构建方法如下：

以总RNA反转录得到的cDNA为模板，进行PCR反应程序，在PsSPMS基因的上、下游分别加入XbaI和BamH酶切位点；将PCR扩增产物连接到PBI121-GFP载体，转化大肠杆菌DH-5α感受态细胞，筛选阳性克隆进行测序；提取质粒，经XbaI和BamH双酶切的PsSPMS基因片段与PBI121-GFP连接，转化EHA105感受态细胞，筛选阳性克隆测序，重组植物表达载体PBI121-PsSPMS-GFP构建完成。

过表达转基因拟南芥植株的获得方法如下：

将测序正确的大肠杆菌菌液提取质粒，即将构建完成的重组植物表达载体PBI121-PsSPMS-GFP转化EHA105农杆菌感受态细胞；筛选阳性克隆摇菌，用花序侵染法侵染未处理的拟南芥植株及纯合子种子的筛选；提取拟南芥阳性苗叶片RNA和DNA，将RNA反转录成cDNA，用引物PsSPMS-F和PsSPMS-R分别进行PCR验证cDNA和DNA。

与现有技术相比，本发明具有的优点如下：

本发明提供的绢毛委陵菜抗镉基因PsSPMS是一个全新的精胺合酶基因，具有全新的基因功能性，通过构建绢毛委陵菜植物过表达载体，结合农杆菌介导法进行异源转化模式植物拟南芥，验证PsSPMS基因的抗镉功能对植物镉胁迫响应的影响，为绢毛委陵菜多胺类功能基因的研究提供有力工具，为绢毛委陵菜抗镉分子生物育种提供有价值的候选基因。

附图说明

图1为实施例1中PsSPMS基因在非生物胁迫下表达模式分析；其中，A、B、C、D分别是NaCl、甘露醇、ZnSO

图2为实施例2中PsSPMS基因克隆PCR产物电泳图；其中，泳道1、2为PsSPMS PCR产物，M为DNA Marker。

图3为实施例3中PsSPMS酶切产物电泳图；其中，泳道3为PBI121-PsSPMS-GFP酶切产物，M为DNA Marker。

图4为构建本发明植物重组表达载体PBI121-PsSPMS-GFP的流程图。

图5为实施例5中转PsSPMS基因和野生型拟南芥在镉胁迫下的表型差异；其中，A、B、C、D为镉胁迫处理0、7、14、21d时野生型和转基因拟南芥株系生长状态。

图6为实施例5中转PsSPMS基因和野生型拟南芥在镉胁迫下H

图7为实施例5中转PsSPMS基因和野生型拟南芥在镉胁迫下SOD、POD、CAT活性和脯氨酸含量差异。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Mamiatis等分子克隆实验操作方法(T.Mamiatis,E.F.Fritsch,J.Sambrook,J.Engel,Molecular cloning–A laboratory manual,1982)，或按照试剂盒制造公司说明书建议的条件。

实施例1检测非生物胁迫下PsSPMS基因的表达水平

选取健康无病虫害、生长状态一致的绢毛委陵菜根、茎、叶为植物材料，用200mM·L

上游引物β-Actin-qPCR-F：5'-GCGACAATGGAACTGGAATGG-3'

下游引物β-Actin-qPCR-R：5'-GACAATTTCCCGTTCAGCAGTG-3'

上游引物PsSPMS-qPCR-F：5'-GGAAGACGCAGGAAGAGGTT-3'

下游引物PsSPMS-qPCR-R：5'-TGTGCGAGACTGGGATTCTG-3'

qPCR 20μl反应体系：2×TSINGKE Master qPCR Mix-SYBR Green I+UDG 10μl，10μM上、下游引物各0.8μl，cDNA模板1μl，ddH

qPCR反应程序：50℃预变性2min；95℃变性2min；95℃再变性15s；55℃退火30s；72℃延伸30s，40个循环；4℃保存。

qPCR分析结果表明，绢毛委陵菜根、茎、叶中的PsSPMS基因表达量在不同处理下均出现了显著上调(图1)

实施例2绢毛委陵菜PsSPMS基因的克隆

以生长状态一致、株高10cm的绢毛委陵菜植株根系为植物材料，100μM·L

上游引物PsSPMS-F：5'-TGTTTCATCTGCGACTGGAG-3'

下游引物PsSPMS-R：5'-CGACCCATTTCAATAATCAGG-3'

25μl PCR反应体系：10×Taq Buffer 2.5μl，2mM dNTPs 2.5μl，25mM MgSO

PCR反应程序：94℃预变性2min；94℃变性15s；63℃退火30s；68℃延伸1min，35个循环；72℃1min；4℃保存。

取4μl回收产物与1μl

实施例3植物表达载体PBI121-PsSPMS-GFP的构建

东北林业大学园林学院实验室保存的PBI121-GPF过表达空载质粒的载体图谱信息和PsSPMS基因的核苷酸序列信息，确定PsSPMS ORF的5’端酶切位点选择XbaI(TCTAGA)，3’端酶切位点选择BamHI(GGATCC)。设计在PsSPMS ORF两端添加有相应酶切位点和保护碱基的特异性引物PsSPMS-XbaI、PsSPMS-BamHI。产物连接到PBI121-GPF载体上，转化大肠杆菌感受态DH-5α，进行序列测定后提取质粒，经XbaI和BamHI双酶切的PsSPMS基因片段与经同样酶进行双酶切得到的PBI121-GPF载体连接，转化DH-5α后测序。

上游引物PsSPMS-XbaI-F：5'-GCTCTAGAATGGGGGAAGACG-3'

下游引物PsSPMS-BamHI-R：5'-GGATCCGGGACGAGCCATTT-3'

(1)以植物中间载体Blunt-PsSPMS质粒为模板进行PCR扩增体系

20μl反应体系：Blunt-PsSPMS质粒1μl，10μM上、下游引物各0.4μl，2×T5 SuperPCR Mix酶10μl，ddH

PCR程序：94℃预变性2min；94℃变性10s；55℃退火15s；72℃延伸15s，35个循环；72℃5min；4℃保存。

(2)扩增产物回收、连接、测序及提质粒

回收产物

(3)植物表达载体PBI121-PsSPMS-GFP构建

用XbaI和BamHI酶进行双酶切，得到含有特异性酶切位点的PsSPMS片段以PBI121片段。

PsSPMS酶切50μl体系：含有酶切位点的Blunt-PsSPMS质粒10μl，10×FlyCutBuffer5μl，XbaI酶2.5μl，BamHI酶2.5μl，ddH

PBI121-GFP酶切50μl体系：PBI121表达载体10μl，10×FlyCut Buffer 5μl，XbaI酶2.5μl，BamHI酶2.5μl，ddH

双酶切PCR反应程序为65℃反应20min。反应结束后加入5μl0×DNA loadingBuffer使双酶切反应产物稀释十倍。经过琼脂糖凝胶电泳后回收正确条带，-20℃保存。

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将连接产物转化大肠感受态细胞DH-5α，测序和进行酶切验证(图3)，植物重组表达载体构建成功。植物重组载体重组流程见图4。

实施例4植物表达载体PBI121-PsSPMS-GFP转化拟南芥

(1)转化EHA105农杆菌

首先将实施例3中获得的重组载体PBI121-PsSPMS-GFP转化农杆感受态细胞EHA105。将5μl PBI121-PsSPMS-GFP质粒与100μl熔融状态的EHA105在冰上均匀混合，手法轻柔的经冰浴5min、液氮5min、27℃水浴3min、冰浴5min完成农杆菌转化。向其中加入700μl无菌的液体LB培养基，28℃、200rpm孵育3h，5000rpm聚集菌体，剩余100μl液体，轻弹混匀后均匀涂在含50mg·L

(2)侵染拟南芥花序

将拟南芥播种培养至株高10cm左右、生长状态一致、有较多花序时作为侵染植物材料。上述获得的农杆菌菌液经摇菌后OD600达到0.8-1.0μg·mL

(3)筛选纯合子拟南芥

在无菌台里将拟南芥T0代种子按照1遍无菌水10s、1遍75％酒精30s、3遍无菌水10s、1遍2％次氯酸钠8min、5遍无菌水10s的顺序进行消毒。将种子均匀点播于筛选培养基上(含50mg·L

(4)阳性转基因植株的PCR鉴定

提取阳性转基因拟南芥的叶片RNA和DNA，将RNA反转录成cDNA，用PsSPMS-F和PsSPMS-R进行PCR验证。结果显示阳性转基因植株中均含有PsSPMS基因，说明PsSPMS成功转入拟南芥中。

实施例5转PsSPMS基因拟南芥抗镉性分析

将野生型和转基因拟南芥株系OE-1、OE-5、OE-6组培苗移入土壤中栽培，生长14d时，选取生长状态良好、长势一致的拟南芥植株作为实验材料。

重金属镉胁迫处理：每隔3d浇灌一次50ml 100μmol·L

处理0、7、14、21d拍照记录植株生长状态。处理14d对叶片进行三次生物学重复取样进行抗镉生理指标测定。使用苏州格锐思生物科技有限公司试剂盒(H

虽然，上文所述已将PsSPMS基因及其应用作了一般性说明及具体的实验操作方案，但在本发明基础上，可以对之进行一些修改或改进，这对于本领域的技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明主要技术路线的基础上进行的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。