马铃薯“克新13号”的遗传转化方法

技术领域

本发明属于遗传转化技术领域，涉及马铃薯“克新13号”的遗传转化方法。

背景技术

马铃薯(Solanum tuberosum L.)又称土豆，属于茄科茄属四倍体一年完成发芽、生长开花结果的生草本植物。马铃薯具备丰富的营养、较强的适应力、产量高等优点。“克新13号”马铃薯是由米拉(Mira)品种为基础材料，经过连续两代的自交从而选育出来的品种，原系谱号为S9-9-(12)。该品种马铃薯属于中晚熟品种，出苗至成熟大致97d。特点为块茎大并且整齐，大、中薯占比77％左右。具有抗马铃薯卷叶病毒病、中抗晚疫病、抗重花叶病毒田间过敏等优良抗病性。且鲜薯具备丰富的维生素C、淀粉以及还原糖。但是其抗虫害能力不明显，且随着实验年限增加，烟草花叶病毒有逐渐加重的趋势。马铃薯生长期间受多种病毒影响，会导致其种质退化、产量降低。并且马铃薯是无性繁殖植物，转基因植株的无性后代无法分离基因，使得无法稳定获取优良品种。使用传统杂交的方式获取优良品种，周期长，操作复杂。因此以基因改良、探索创造新品种为战略目的的基因工程技术就显得尤为重要。

发明内容

本发明所解决的技术问题是提供马铃薯“克新13号”的遗传转化方法，对以农杆菌为介导的马铃薯遗传转化技术进行优化，对农杆菌污染的问题进行解决，并建立稳定高效抗褐化的马铃薯“克新13号”遗传转化体系，获得基因改良的新品种。

本发明将通过以下技术方案解决上述问题：

本发明提供马铃薯“克新13号”的遗传转化方法，包括以下步骤：

(1)取马铃薯“克新13号”外植体移接至预培养培养基上进行预培养；所述预培养培养基以MS基本培养基为基础，其中包含1.9-2.1mg·L

(2)活化根癌农杆菌EHA105，用MS重悬液稀释菌液浓度到OD

(3)将步骤(2)共培养后的外植体移接至愈伤组织诱导培养基中进行诱导培养形成愈伤组织，所述诱导培养基以MS基本培养基为基础，其中包含1.9-2.1mg·L

(4)将步骤(3)形成愈伤组织的外植体移接至分化培养基中进行愈伤组织的分化培养形成不定芽，所述分化培养基以MS基本培养基为基础，其中包含1.9-2.1mg·L

进一步的，步骤(1)中，所述外植体为茎段。

进一步的，步骤(1)中，所述外植体为微型薯片。

进一步的，步骤(1)中，所述外植体是经过充分灭菌消毒后的外植体，所述灭菌消毒的步骤包括用75wt％乙醇溶液洗涤浸泡30s后，再使用8wt％或10wt％NaClO溶液浸泡外植体消毒7或8min，灭菌水洗涤2或3次。

进一步的，步骤(1)中，预培养培养条件包括光照1500-2500Lx，温度22-26℃；优选为光照2000Lx，温度24℃。

进一步的，步骤(1)中，预培养培养时间为1-3天；优选为2天。

进一步的，步骤(2)中，菌液浓度OD

进一步的，步骤(2)中，侵染时间为6-10min；优选为7min。

进一步的，步骤(2)中，共培养培养条件包括黑暗条件，温度22-26℃；优选为24℃。

进一步的，步骤(2)中，共培养培养时间为2-4天；优选为3天。

进一步的，步骤(3)中，诱导培养条件包括光照1500-2500Lx，温度22-26℃；优选为光照2000Lx，温度24℃。

进一步的，步骤(3)中，诱导培养时间为15-20天；优选为20天。

进一步的，步骤(4)中，分化培养条件包括光照1500-2500Lx，温度22-26℃；优选为光照2000Lx，温度24℃。

进一步的，步骤(4)中，分化培养时间为15-20天；优选为20天。

进一步的，还包括：待步骤(4)中所述的不定芽分化出苗，再移接至生根培养基中诱导生根；所述生根培养基以MS基本培养基为基础，其中包含0.9-1.1mg·L

本发明的有益效果在于：本发明通过在共培养前进行预培养，有利于调整外植体的生长状态，使得后续利于农杆菌的侵染，使得细胞处于易整合外源DNA的状态，同时也有利于防止外植体的褐化现象；在共培养培养基上铺加一层高温灭菌的滤纸，避免外植体与培养基直接接触，减缓外植体对营养的获取，从而减缓农杆菌的过度繁殖；通过合理设置农杆菌浓度有效的降低了农杆菌污染的风险，同时获得到了转化培养的幼小植株，并建立稳定高效抗褐化的马铃薯“克新13号”遗传转化体系，获得基因改良的新品种。

附图说明

图1：农杆菌载体图谱。

图2：A为对比例2诱导愈伤组织分化照片；B为实施例1诱导愈伤组织分化照片。

图3：实施例1生根培养结果。

图4：马铃薯愈伤PCR产物结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式以及附图，对本发明做进一步说明，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了一种马铃薯“克新13号”的遗传转化方法，包括以下步骤：

(1)取马铃薯“克新13号”外植体移接至预培养培养基上进行预培养；所述预培养培养基以MS基本培养基为基础，其中包含1.9-2.1mg·L

(2)活化根癌农杆菌EHA105，用MS重悬液稀释菌液浓度到OD

(3)将步骤(2)共培养后的外植体移接至愈伤组织诱导培养基中进行诱导培养形成愈伤组织，所述诱导培养基以MS基本培养基为基础，其中包含1.9-2.1mg·L

(4)将步骤(3)形成愈伤组织的外植体移接至分化培养基中进行愈伤组织的分化培养形成不定芽，所述分化培养基以MS基本培养基为基础，其中包含1.9-2.1mg·L

其中，本发明所述的根癌农杆菌EHA105植物表达载体为pCAMBIA1300，其中包含有卡那霉素抗性基因作为抗性筛选的标记基因和Cas9p，如图1所示，卡那霉素抗性基因由发明人构建并插入根癌农杆菌EHA105，构建及插入方法为本领域常见的方法，卡那霉素基因用于转化植株的抗性筛选，便于标记转化植株。

在本发明的一个优选实施方式中，步骤(1)中，所述外植体为茎段。

在本发明的一个优选实施方式中，步骤(1)中，所述外植体为微型薯片。

在本发明的一个优选实施方式中，步骤(1)中，所述外植体是经过充分灭菌消毒后的外植体。消毒主要是为了在不伤害外植体的前提条件下，对附着在外植体表面的微生物给杀死。

在本发明的一个优选实施方式中，步骤(1)中，所述外植体是用75wt％乙醇溶液洗涤浸泡30s后，再使用8wt％或10wt％NaClO溶液浸泡外植体消毒7或8min，灭菌水洗涤2或3次后的外植体。

在本发明的一个优选实施方式中，步骤(1)中，预培养培养基中6-BA的浓度为1.9mg·L

在本发明的一个优选实施方式中，步骤(1)中，预培养培养基中2,4-D的浓度为0.5mg·L

在本发明的一个优选实施方式中，步骤(1)中，预培养培养基中KT的浓度为0.3mg·L

在本发明的一个优选实施方式中，步骤(1)中，预培养培养基以MS基本培养基为基础，其中包含2mg·L

在本发明的一个优选实施方式中，步骤(1)中，预培养培养基的pH为5.8、5.9或6.0。

在本发明的一个优选实施方式中，步骤(1)中，预培养培养条件为光照强度1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400或2500Lx，温度22、23、24、25或26℃。

在本发明的一个优选实施方式中，步骤(1)中，预培养培养条件为光照强度2000Lx，温度24℃。

在本发明的一个优选实施方式中，步骤(1)中，预培养培养时间为1、2或3天。

在本发明的一个优选实施方式中，步骤(1)中，预培养培养时间为2天。

在本发明的一个优选实施方式中，步骤(2)中，活化根癌农杆菌EHA105的步骤如下：将农杆菌接种到加有50mg·L

在本发明的一个优选实施方式中，步骤(2)中，菌液浓度OD

在本发明的一个优选实施方式中，步骤(2)中，菌液浓度OD

在本发明的一个优选实施方式中，步骤(2)中，侵染时间为6、7、8、9或10min。

在本发明的一个优选实施方式中，步骤(2)中，侵染时间为7min。

在本发明的一个优选实施方式中，步骤(2)中，共培养培养基中6-BA的浓度为1.9mg·L

在本发明的一个优选实施方式中，步骤(2)中，共培养培养基中2,4-D的浓度为0.5mg·L

在本发明的一个优选实施方式中，步骤(2)中，共培养培养基中KT的浓度为0.3mg·L

在本发明的一个优选实施方式中，步骤(2)中，共培养培养基中AS的浓度为19mg·L

在本发明的一个优选实施方式中，步骤(2)中，共培养培养基以MS基本培养基为基础，其中包含2mg·L

在本发明的一个优选实施方式中，步骤(2)中，共培养培养基的pH为5.8、5.9或6.0。

在本发明的一个优选实施方式中，步骤(2)中，共培养培养条件为黑暗条件，温度22、23、24、25或26℃。

在本发明的一个优选实施方式中，步骤(2)中，共培养培养条件为黑暗条件，温度24℃。

在本发明的一个优选实施方式中，步骤(2)中，共培养培养时间为2、3或4天。

在本发明的一个优选实施方式中，步骤(2)中，共培养培养时间为3天。

在本发明的一个优选实施方式中，步骤(3)中，诱导培养基中6-BA的浓度为1.9mg·L

在本发明的一个优选实施方式中，步骤(3)中，诱导培养基中2,4-D的浓度为0.5mg·L

在本发明的一个优选实施方式中，步骤(3)中，诱导培养基中KT的浓度为0.3mg·L

在本发明的一个优选实施方式中，步骤(3)中，诱导培养基中Kan的浓度为40mg·L

在本发明的一个优选实施方式中，步骤(3)中，诱导培养基中Tim的浓度为190mg·L

在本发明的一个优选实施方式中，步骤(3)中，诱导培养基以MS基本培养基为基础，步骤(3)中，其中包含2mg·L

在本发明的一个优选实施方式中，步骤(3)中，诱导培养基的pH为5.8、5.9或6.0。

在本发明的一个优选实施方式中，步骤(3)中，诱导培养条件为光照强度1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400或2500Lx，温度22、23、24、25或26℃。

在本发明的一个优选实施方式中，步骤(3)中，诱导培养条件为光照强度2000Lx，温度24℃。

在本发明的一个优选实施方式中，步骤(3)中，诱导培养时间为15、16、17、18、19或20天。

在本发明的一个优选实施方式中，步骤(3)中，诱导培养时间为20天。

在本发明的一个优选实施方式中，步骤(4)中，分化培养基中6-BA的浓度为1.9mg·L

在本发明的一个优选实施方式中，步骤(4)中，分化培养基中KT的浓度为2.0mg·L

在本发明的一个优选实施方式中，步骤(4)中，分化培养基中GA3的浓度为0.4mg·L

在本发明的一个优选实施方式中，步骤(4)中，分化培养基中肌醇的浓度为0.1g·L

在本发明的一个优选实施方式中，步骤(4)中，分化培养基中Kan的浓度为40mg·L

在本发明的一个优选实施方式中，步骤(4)中，分化培养基中Tim的浓度为190mg·L

在本发明的一个优选实施方式中，步骤(3)中，分化培养基以MS基本培养基为基础，步骤(3)中，2mg·L

在本发明的一个优选实施方式中，步骤(4)中，分化培养基的pH为5.8、5.9或6.0。

在本发明的一个优选实施方式中，步骤(4)中，分化培养条件为光照强度1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400或2500Lx，温度22、23、24、25或26℃。

在本发明的一个优选实施方式中，步骤(4)中，分化培养条件为光照强度2000Lx，温度24℃。

在本发明的一个优选实施方式中，步骤(4)中，分化培养时间为15、16、17、18、19或20天。

在本发明的一个优选实施方式中，步骤(4)中，分化培养时间为20天。

在本发明的一个优选实施方式中，还包括，待步骤(4)中所述的不定芽分化出苗，移接至生根培养基中诱导生根，所述生根培养基以MS基本培养基为基础，其中包含1mg·L-1α-萘乙酸(以下简称NAA)、50mg·L

下面将结合实施例及对比例对此作进一步说明。

需提前说明的是，具体实施方式中所选用的外植体均采自苗龄为4周的“克新13号”马铃薯茁壮苗。

上述外植体的获取方法为：

(1)茎段：用灭菌后的剪刀，剪取不含有生长点的0.5-1.5cm的茎段，平铺在愈伤组织诱导培养基中。

(2)叶片：剪取叶片，截去叶柄，并用灭菌后的手术刀垂直于叶脉并划开2～4个划口，将叶面朝下放置在愈伤组织诱导培养基中。

(3)微型薯片：将微型薯用灭菌的手术刀，切去两头，将微型薯外皮切去，避免薯皮上的生长点影响后续试验结果，然后将微型薯切成2-4mm厚的薯片。

将上述外植体均用75wt％乙醇溶液洗涤浸泡30s后，再使用8wt％NaClO溶液浸泡外植体消毒7min，灭菌水洗涤3次，使用高温灭菌的滤纸吸干水分。

实施例1：

本实施例提供了一种马铃薯“克新13号”的遗传转化方法，包括以下步骤：

(1)取马铃薯“克新13号”外植体移接至预培养培养基上培养；培养条件为光照强度2000Lx，温度24℃，培养时间为2天；所述预培养培养基以MS基本培养基为基础，其中包含2mg·L

(2)活化根癌农杆菌EHA105，用MS重悬液稀释菌液浓度到OD

(3)将步骤(2)共培养后的外植体均移接至愈伤组织诱导培养基中进行诱导培养形成愈伤组织，培养条件为光照强度2000Lx，温度24℃，培养时间为20天；所述诱导培养基以MS基本培养基为基础，其中包含2mg·L

(4)将步骤(3)形成愈伤组织的外植体均移接至分化培养基中进行愈伤组织的分化培养形成不定芽，培养条件为光照强度2000Lx，温度24℃，培养时间为20天；所述分化培养基以MS基本培养基为基础，其中包含2mg·L

其中，根癌农杆菌EHA105植物表达载体为pCAMBIA1300，包含有卡那霉素抗性基因为抗性筛选的标记基因和Cas9p，如图1所示。

实施例2：

本实施例提供了一种马铃薯“克新13号”的遗传转化方法，与实施例1的区别在于：步骤(3)中，诱导培养基中2,4-D的含量为1.0mg·L

对比例1：

本对比例与实施例1的区别在于：所述外植体为叶片。

对比例2：

本对比例与实施例1的区别在于：所述外植体为微型薯片且不包含步骤(1)中的预培养步骤。

对比例3：

本对比例与实施例1的区别在于：步骤(4)中分化培养基中不含有肌醇。

实施例1-2与对比例1-2遗传转化愈伤组织诱导结果如表1所示，其中诱导率为步骤(3)成功诱导出遗传转化愈伤组织的移接量与步骤(3)总移接量的比值。

表1：实施例1-2与对比例1遗传转化愈伤组织诱导结果

上述结果表明，愈伤组织的诱导率和诱导质量跟激素配比有关，同时不同的外植体材料也具有影响。培养基相同的条件下，茎段愈伤率在90％以上，且愈伤组织致密生长旺盛，是最佳的外植体材料。微型薯片愈伤率为100％，愈伤组织致密生长状况良好，但是由于微型薯表面生长点原因，会影响试验，使用时需要仔细处理好材料，叶片愈伤率较低，因为叶片本身相比于茎段较为脆弱，经过多次处理会造成之后叶片的枯萎死亡，因此叶片在实际操作中难度较大。

实施例1与对比例3遗传转化愈伤组织分化结果如表2所示，其中分化率为步骤(4)成功分化出不定芽的移接量与步骤(4)总移接量的比值。

表2：实施例1与对比例3愈伤组织分化结果

上述结果表明，在含有肌醇的培养基中分化的愈伤组织，外植体生长状况良好，大多数外植体呈绿色，少部分外植体呈淡黄色，且有出苗和出幼小苗，出苗率在36.36％，如图2B所示。在不含有肌醇的分化培养基中，外植体大多数呈黄色，且出苗率低，如图2A所示。说明在培养基中加入一定的量的肌醇，能够改善并提高诱导愈伤组织分化不定芽的出苗率，缩短培育周期。

将实施例1诱导分化出不定芽的外植体，剪取不定芽，形态学下端向下插入生根培养基上进行生根培养。所述生根培养基以MS基本培养基为基础，其中包含1mg·L-1α-萘乙酸(以下简称NAA)、50mg·L

提取的实施例1转化植株DNA、实施例1转化愈伤组织DNA和未转化马铃薯“克新13号“愈伤组织DNA，进行Kan抗性基因鉴定，提取DNA的方法为本领域常用的方法，未转化愈伤组织的获取方法为本领域常规的方法。把含植物表达载体的农杆菌为阳性对照，未转化试管苗DNA为阴性对照。利用NPTIIF和NPTIIR和质粒Cas9448F和Cas9448R这两对引物对其进行PCR扩增。

NPTIIF：5’-GTCAAGACCGACCTGTCCGGTG-3’

NPTIIR：5’-TCCACCATGATATTCGGCAAGC-3’

Cas9448 F：5’-CTACTCCGTCCTCGTGGTCG-3’

Cas9448 R：5’-CTTGTCGAGGTTAGCGTCAG-3’

PCR的反应程序条件为：预变性94℃5min，变性94℃30s，退火56℃30s，延伸72℃30s，30个循环，复性72℃10min。PCR反应体系(25μL)为：DNA模板1μL，PCRMix 12.5μL，引物F(N/C)1μL，引物R(N/C)1μL，ddH

进行转化植株分子鉴定，获得的PCR扩增电泳条带符合实验前的预估结果，与阳性对照一致在500bp附近出现明亮条带即目的条带，阴性对照则无目的条带，如图4所示(其中左侧引物为NPTII，右侧引物为Cas9448，M为DL2000DNAMarker，“+”表示含阳性质粒的农杆菌液，“-”未转基因阴性对照苗；1-4为转化愈伤组织，5-8为转化植株)，结果表明，成功获得具有Kan抗性基因转化植株。

可以理解的是，以上具体实施例均为本发明的进一步说明，并不用于限定本发明的保护范围，对本领域技术人员来说，在没有创造性劳动的条件下所获得的所有其它润饰和修改，都属于本发明的保护范围。