细胞增殖免疫荧光检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种细胞增殖免疫荧光检测试剂盒及其应用。

背景技术

细胞增殖是维持生命的基础，是一个非常复杂精密调控的生理过程。根据增殖过程中的核酸，蛋白质及细胞整体变化特征，细胞的增殖周期可以人为分成G1,S,G2和M四个周期。

很多遗传病，感染性疾病以及肿瘤等疾病发生发展都和细胞的增殖周期异常直接相关，因此细胞增殖周期的检测是判断细胞病理机制的重要手段，也是临床和基础生物医学科研中常用的实验方法。

免疫荧光术结合荧光显微镜及自动数据处理系统，可以定性或定量观测不同周期细胞的数量、比例、亚细胞结构及相关蛋白的表达分布等，是生物医学领域最常用的技术手段之一。

目前国内外细胞增殖周期的检测方法主要有两类，第一类是直接用核酸试剂(如PI,DAPI,HOECHST等)染细胞DNA，通过观测不同细胞周期细胞DNA荧光含量不同而对细胞周期进行分析。此方法非常简单，易操作；但是实验结果分析很困难，容易产生诸多误差，尤其是对S和M期细胞的分析很不可靠。目前只适合于结合流式细胞术做一些药物初筛。

第二类是在第一类核酸试剂的基础上，另外用核苷酸类似物(如EdU)标记新合成的DNA，以用于区分S期细胞。由于S期细胞可以被标记信号放大显示，所以此方法可以将细胞分成G1,S和G2M三个周期。此方法可以用于研究一些影响G1/S,S/G2周期的病理过程，但是对G2/M周期却没有办法检测。不仅无法提供细胞增殖周期全部信息，而且对G2/M周期过渡有影响的疾病完全不能检验。因此，亟需建立一种用于有效区分鉴别M和G2期细胞结构的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种细胞增殖免疫荧光检测试剂盒及其应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供磷酸化组蛋白H3作为细胞增殖周期中M期标志物中的应用。

第二方面，本发明提供检测磷酸化组蛋白H3的试剂在制备用于区分细胞增殖周期中M期的检测试剂中的应用。

前述的应用，所述检测磷酸化组蛋白H3的试剂为抗磷酸化组蛋白H3抗体，如抗人p-H3-Alexa Fluro647抗体(Abcam,ab237418)。

第三方面，本发明提供一种细胞增殖免疫荧光检测试剂盒(细胞周期荧光检测试剂盒)，所述试剂盒包含磷酸化组蛋白H3抗体。

进一步地，所述试剂盒还包含新合成DNA标记物、细胞固定剂、破膜剂和总核酸荧光染色剂等中的至少一种。

所述新合成DNA标记物可以是Edu(5-乙炔基-2-脱氧尿苷，为胸腺嘧啶替代物)。

所述细胞固定剂可以是1-4％(优选2％)多聚甲醛。其配置方法如下：将粉剂多聚甲醛溶于双蒸水中，以配制质量比40％母液。加热搅拌并滴加NaOH至粉剂完全溶解，-20℃冻存母液。使用时取母液溶解，用PBS稀释母液至1-4v/v％工作液。

所述破膜剂可以是含0.1-1％(优选0.1％)Triton的PBS。

所述荧光染色剂可以是DAPI。

第四方面，本发明提供所述试剂盒在检测细胞增殖周期M期中的应用(含非疾病诊断和治疗目的)。

第五方面，本发明提供一种检测细胞增殖周期M期的方法(含非疾病诊断和治疗目的)，包括以下步骤：

(1)将细胞置于含1-10μM Edu的细胞完全培养基中培养0.5-4小时；

(2)培养结束后，将细胞用PBS洗涤2-3次后，用2％多聚甲醛室温下固定细胞20分钟后，用洗涤液(含10％FCS的PBS)清洗细胞(去除固定液)；

(3)用破膜剂(含0.1v/v％Triton的PBS)室温下处理细胞20分钟后，用洗涤液清洗细胞(去除破膜剂)；

(4)用Edu标记溶剂(含有1mM CuSO

(5)加入10μg/ml p-H3-Alexa Fluro647重悬细胞，4℃染色细胞30分钟后，用洗涤液清洗细胞(去除多余抗体)；

(6)用PBS将细胞调整到合适浓度，将细胞悬液甩片到载玻片上；

(7)用1μg/ml DAPI室温下染色10分钟后，用PBS洗涤4-5次；

(8)滴加上样缓冲液(90v/v％甘油+10v/v％pH9的PBS)，加上盖玻片，并封片；

(9)将细胞样本在荧光显微镜下观察。

如果实验对象为贴壁细胞，则需要将步骤(6)去除，并在步骤(2)中将细胞直接培养到载玻片上。

所述细胞为哺乳动物体细胞，优选灵长类动物体细胞，更优选人类体细胞。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

为了突破传统细胞增殖周期检测技术的局限，本发明提供一种新型的细胞周期荧光检测试剂盒。本发明在现有核酸荧光标记方法的基础上，通过引入M期细胞特殊标记(磷酸化组蛋白H3)以有效区分G2和M期细胞。通过甄选优化实验基础条件，使基础核酸标记物，新合成核酸标记物，以及M期细胞特殊标记能够兼容，从而完成对四个细胞周期的全面检测。进一步结合免疫荧光细胞术定性或定量观测不同细胞增殖周期细胞的亚细胞结构，从而能够准确反映出细胞增殖周期的全部信息。本发明提供的细胞周期检测方法具有操作简单、高效、敏感，试剂廉价易得等优点，可以对细胞样本进行定性，定量和定位检测，应用前景广阔。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中利用细胞周期荧光检测试剂盒对K562细胞增殖周期的检测结果。

图2为本发明较佳实施例中染色后的细胞用流式细胞术检测验证结果。

图3为本发明较佳实施例中固定剂破膜剂筛选优化实验结果；其中，A：2％多聚甲醛及saponin(皂素)；B：2％多聚甲醛及含0.1v/v％Triton的PBS；C：低温乙醇；D：商用试剂盒(ThermoFisher Scientific，货号A10266)。

图4为本发明较佳实施例中p-H3-Alexa Fluro647抗体优选实验结果；其中，A：pS28-H3-Histone-APC(Miltenyi,130-126-509)；B：pS28-H3-Histone-Alexa Fluro647(BD,558609)；C：pS10-H3-Histone-Alexa Fluro647(Abcam,ab5176)；D：pS28-H3-Histone-Alexa Fluro647(Abcam,ab237418)。

图5为本发明较佳实施例中不同来源Edu优选实验结果；其中，A：Invitrogen,A10266；B：Aladdin,E131265；C：RHAWN,R014330；D：MCE,HY118411。

具体实施方式

本发明旨在提供M期细胞特异性标记蛋白用于区分G2和M期细胞，以全面检测四个不同细胞增殖周期细胞的亚细胞结构。另外，通过选择适合新合成DNA和基础DNA标记物，用于标记不同细胞周期的核酸；进一步地，筛选最佳细胞固定剂，破膜剂，荧光染色剂等试剂，并使它们都能和标记蛋白等兼容。

本发明采用如下技术方案：

发明人通过大量研究发现磷酸化组蛋白H3只在M期细胞中表达，而其他细胞周期均不表达，由此可以成为一个优良的M期标记物。通过蛋白序列分析，筛选到若干个候选抗体。结合流式细胞术和免疫荧光术，确定最佳抗体，并制备得到特异性荧光抗体，用于检测磷酸化组蛋白H3的表达情况。其次，选择敏感特异的Edu作为核酸类似物以标记新合成DNA，并用对应荧光标记物标记；选择DAPI标记DNA，该试剂适应性广，在多种试剂环境下都可以标记核酸。最后，在众多常用的固定剂-破膜剂-荧光染色剂组合中，成功筛选出最佳的试剂组合，能兼容本实验中所使用到的所有试剂，使得四个周期的亚细胞结构都可以在荧光显微镜下定性、定量和定位观测到。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数。

以下实施例中使用的试剂及仪器：

抗人p-H3-Alexa Fluro647抗体购自Abcam(货号ab237418)

azide-Alexa Fluro488购自ThermoFisher Scientific(货号A10266)。K562细胞购自ATCC(CCL-243)。

FCS购自Gibco(16000044)。

流式细胞仪购自BD FACSAria(BD,643181)。

激光共聚焦显微镜为Leica TCS SP5。

实施例1免疫荧光法检测细胞周期(区分M和G2期细胞)

1、1-10μM Edu(购自Aladdin,E131265)培养K562细胞；将1-10mM Edu工作溶液按1:1000体积比加入细胞完全培养基(含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基，购自ThermoFisher，货号11875093)中，根据细胞增殖速度培养0.5-4小时。

2、收获细胞；低温PBS洗涤2-3次后，用2％多聚甲醛室温下重悬固定细胞20分钟后，用洗涤液(PBS+10v/v％FCS)洗涤去除固定液

3、用破膜剂(PBS+0.1v/v％Triton)室温下处理细胞20分钟后，用洗涤液洗涤去除破膜剂。

4、用Edu标记溶剂混合物(100mM Tris中混合1mM CuSO4,0.1μM azide-alexaFluro 488和100mM抗坏血酸溶液)重悬细胞，室温下处理细胞20分钟后，用洗涤液洗涤细胞去除多余试剂。

5、加入10μg/ml p-H3-Alexa Fluro647重悬细胞，4℃染色细胞30分钟后，用洗涤液充分洗涤去除多余抗体。

6、用PBS将细胞调整到0.1×10

7、用1μg/ml DAPI室温下染色10分钟后，用PBS充分洗涤4-5次。

8、滴加上样缓冲液(90v/v％甘油+10v/v％pH9的PBS)，加上盖玻片，并封片。

9、将细胞样本在荧光显微镜下观察。

上述实验方法是以悬浮细胞为例。如果实验对象是贴壁细胞，可以先将细胞培养于载玻片上，然后转移到培养皿中。基本过程类似，可以省掉细胞甩片的过程。

利用细胞周期荧光检测试剂盒对K562细胞增殖周期的检测结果见图1。其中，左上图显示DAPI染色所有细胞的DNA。染色后的荧光强度在不同细胞周期细胞间有不同；右上图显示Edu染色新合成DNA，这类阳性染色细胞代表S期细胞；左下图显示磷酸化组蛋白H3抗体染色细胞，这类细胞都是M期细胞，其染色体具有特征性。

染色后的细胞用流式细胞术检测验证结果见图2。其中，左上图为散点图，显示所有细胞的大小和胞内状况；右上图显示单个细胞分布图；左下图DAPI和Edu-AF488染色后将细胞区分为G1,S和G2/M三个增殖周期；右下图显示p-H3-Alexa Fluro647可以将G2/M期细胞区分开来，抗体阳性细胞为M期细胞。证明了图1中的染色效率敏感特异性。

实施例2固定剂破膜剂筛选优化实验

实验过程与实施例1基本相同，仅改变步骤2和3中的固定剂及破膜剂组合：A：2％多聚甲醛及saponin(皂素)；B：2％多聚甲醛及含0.1v/v％Triton的PBS；C：低温乙醇；D：商用试剂盒(ThermoFisher Scientific，货号A10266)。实验结果见图3。A-D结果分别来自上述四种组合。图中P3显示G2/M期细胞。其中B组合得到的结果与现有的商用两试剂组合类似，为优选出的应用试剂。

实施例3p-H3-Alexa Fluro647抗体优选实验

实验过程与实施例1基本相同，仅改变步骤5中的抗体，选用不同来源的p-H3-Alexa Fluro647抗体以比较选择最佳染色的抗体A：pS28-H3-Histone-APC(Miltenyi,130-126-509)；B：pS28-H3-Histone-Alexa Fluro647(BD,558609)；C：pS10-H3-Histone-AlexaFluro647(Abcam,ab5176)；D：pS28-H3-Histone-Alexa Fluro647(Abcam,ab237418)。验证结果用流式细胞术直方图见图4。A-D结果分别来自上述四种抗体染色结果。图中P4显示抗体染色的M期细胞。其中D组合得到的结果明显优于其他三组，为优选出的应用试剂。

实施例4不同来源Edu优选实验

实验过程与实施例1基本相同，仅改变步骤1中的Edu，选用不同来源的Edu以比较选择最佳染色结果。A：Invitrogen,A10266；B：Aladdin,E131265；C：RHAWN,R014330；D：MCE,HY118411。验证结果用流式细胞散点图见图5。A-D结果分别来自上述四种试剂。尽管四个实验组中的Edu都能很好地嵌入S期细胞中，且其阳性细胞比例基本相同。考虑到产品纯度，价格及供货地点等因素，最终优选Aladdin生产的Edu。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。