一种生产聚3羟基丁酸乳酸酯的基因工程菌及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体地说，是关于一种生产聚3羟基丁酸乳酸酯的基因工程菌及其应用。

背景技术

目前，常用的塑料大多是由石油和天然气等化石燃料合成的，导致了全球变暖及固体废弃物积累等环境问题，这些问题催促我们开发利用可持续的原料生产生物基聚合物。聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxy alkanoates，PHA)是由微生物产生的一种聚酯，目前因其生物可降解性、光学性能和生物相容性等优良性质引起了研究者的广泛关注。

聚乳酸是一种很有前景的生物质衍生聚合物，因为它可以替代石油基塑料，具有多种理想的性质，如生物降解性、生物相容性和可堆肥性等，且聚乳酸本身无毒。但是传统生化方法生产中的金属催化剂残留会影响其在医学等方面的应用。

目前由于缺乏天然的乳酸聚合酶，无法实现在生物体内一步生产。SeiichiTaguchi等利用底物相似性原则，通过PHA合成酶进行突变，成功地创造了微生物生物合成乳酸基聚酯的体系——聚3羟基丁酸乳酸酯(P(3HB-co-LA))。P(3HB-co-LA)是PHA家族的一员，该聚合物融合了单独的聚乳酸透明但是坚硬、以及聚3羟基丁酸不透明且易碎的特点，根据乳酸含量而表现出不同的弹性和透明度。如图1所示，目前已知的生物合成P(3HB-co-LA)的途径是利用具有乳酸聚合活性的PHA合成酶(phaC)通过3-羟基丁酰辅酶A(3HB-CoA)和乳酰辅酶A(LA-CoA)进行合成(Seiichi Taguchi.et al.A Microbial factoryforlactate-based polyesters using a lactate polymerizing enzyme,PNAS,105(45),Nov.18,2008,17323-17327)。其中，3HB-CoA的合成途径是通过β-酮硫解酶(phaA)和乙酰乙酰辅酶A还原酶(phaB)催化。

需钠弧菌(Vibrio natriegens)是目前在分子生物学和生物技术中被应用的新型宿主平台。其具有多种优势，是十分有前景的代谢工程菌株。它是所有已知微生物中生长速度最快的一种，其倍增时间很短，蛋白质合成活性很高，还具有较高生物量比氧摄取率qO

发明内容

有鉴于现有生物合成P(3HB-co-LA)的途径所存在的缺点和不足，本发明致力于使用需钠弧菌(Vibrio natriegens)这种具有前景的底盘菌，完成聚3羟基丁酸乳酸酯的生产。

为实现上述目的，本发明的第一个方面，提供了一种生产聚3羟基丁酸乳酸酯的基因工程菌，所述基因工程菌是对出发菌株中由丙酮酸合成聚3羟基丁酸乳酸酯的代谢途径进行了改造，其中：

所述代谢途径中，催化乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A的酶由PN96-18050基因编码，该基因PN96-18050来源于需钠弧菌(Vibrio natriegens)；

催化乙酰乙酰辅酶A合成3-羟基丁酰辅酶A的酶由PN96-18045基因编码，该基因PN96-18045来源于需钠弧菌(Vibrio natriegens)；

催化乳酸合成乳酰辅酶A的酶由pct

催化乳酰辅酶A和3-羟基丁酰辅酶A合成PHA的酶由phaCm基因编码，该基因phaCm是来源于荧光假单胞菌2P24(Pseudomonas fluorescens strain 2P24)的phaC基因的突变体，其序列如SEQ ID No.3所示。

根据本发明的优选实施例，所述基因PN96-18050的序列如SEQ ID No.1所示。

根据本发明的优选实施例，所述基因PN96-18045的序列如SEQ ID No.2所示。

根据本发明，所述基因工程菌的出发菌株为需钠弧菌，所述催化乳酸合成乳酰辅酶A的酶由pct

根据本发明，所述基因工程菌的出发菌株为大肠杆菌，所述催化乳酸合成乳酰辅酶A的酶，由pct

本发明的第二个方面，提供了上述的基因工程菌用于发酵生产聚3羟基丁酸乳酸酯的应用。

本发明的第三个方面，提供了一种聚3羟基丁酸乳酸酯的生产方法，所述方法是通过发酵上述的基因工程菌而实现。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明通过构建利用葡萄糖生产P(3HB-co-LA)的代谢途径得到了两种基因工程菌，其中的需钠弧菌基因工程菌SXY01发酵生产聚3羟基丁酸乳酸酯，在20g/L葡萄糖的条件下，P(3HB-co-LA)产量可以占到占细胞干重的21.43％，乳酸组分达13.18％；大肠杆菌基因工程菌SXY-Eco发酵生产聚3羟基丁酸乳酸酯，在10g/L葡萄糖的条件下，P(3HB-co-LA)产量可以占到细胞干重的47.52％，乳酸组分达9.40％。

2、本发明在生产聚3羟基丁酸乳酸酯的途径中使用了两种前人未使用过的酶催化乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A，以及催化乙酰乙酰辅酶A合成3-羟基丁酰辅酶A，最终成功生产聚3羟基丁酸乳酸酯，其分别由PN96-18050基因和PN96-18045编码,均来源于需钠弧菌(Vibrio natriegens)，且这两种酶也均可在大肠杆菌中成功催化乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A，以及催化乙酰乙酰辅酶A合成3-羟基丁酰辅酶A，达到生产聚3羟基丁酸乳酸酯的效果。

3、需钠弧菌作为近年来颇受关注的宿主菌，其具有生长迅速，底物摄取速率高，无毒等优点，具有成为新一代工业宿主菌的潜力，在需钠弧菌中成功实现聚3羟基丁酸乳酸酯的生产具有较强的工业前景。

附图说明

图1显示了现有已知的大肠杆菌利用葡萄糖生产P(3HB-co-LA)的代谢途径；图中，phaA为β-酮硫解酶，phaB为乙酰乙酰辅酶A还原酶，pct

图2显示了本发明构建的需钠弧菌和大肠杆菌工程菌株利用葡萄糖生产P(3HB-co-LA)的代谢途径；图中PN96-18050是乙酰乙酰辅酶A还原酶，PN96-18045是乙酰CoA酰基转移酶，pct

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中所用到的质粒和菌株的说明：

注：pTrc99a和pBAD均为成熟的商业化质粒，将质粒中的启动子替换为trc启动子，以及将PN96-18045、PN96-18050、phaCm、以及pct基因(pct

其中：催化乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A的酶(乙酰CoA酰基转移酶)由PN96-18050基因编码，该基因PN96-18050来源于需钠弧菌(Vibrio natriegens)；进一步的，其序列如SEQ ID No.1所示。

催化乙酰乙酰辅酶A合成3-羟基丁酰辅酶A的酶(乙酰乙酰辅酶A还原酶)由PN96-18045基因编码，该基因PN96-18045来源于需钠弧菌(Vibrio natriegens)；进一步的，其序列如SEQ ID No.2所示。

催化乳酸合成乳酰辅酶A的酶(丙酰辅酶A转移酶)，由pct

催化乳酰辅酶A和3-羟基丁酰辅酶A合成PHA的酶(PHA合成酶)，由phaCm基因编码，该基因phaCm是来源于荧光假单胞菌2P24(Pseudomonas fluorescens strain 2P24)的phaC基因的突变体，该基因phaCm的序列如SEQ ID No.3所示。

以下实施例中所使用的基因片段cat-sacB为人工合成片段，其序列如SEQ IDNo.6所示；其中，cat为奇霉素抗性基因片段，sacB为分泌型果聚糖蔗糖酶的基因。

以下实施例中所使用的试剂和培养基的说明：

异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)：称取11.91g IPTG溶于100mL ddH

BHI培养基(液体，g/L)：37g脑心浸出液(Brain Heart Infusion)。

BHIV

感受态制备溶液：称取23.27g蔗糖，0.122g K

氯霉素(Cm)：34g/L母液，溶解于无水乙醇。

氨苄青霉素(Amp)：100g/L母液，溶解于ddH

奇霉素(Spe)：50g/L母液，溶解于ddH

抗生素在配置完成后需经过0.22μm孔径微孔滤膜过滤后才可使用，各抗生素最终的使用浓度为氨苄青霉素(100μg/mL)，奇霉素(200μg/mL)，氯霉素(基因组筛选时为5μg/mL，质粒筛选时为12.5μg/mL)。

以下实施例中所使用的需钠弧菌为V.natriegens ATCC 14048；大肠杆菌MG1655为成熟的商业化菌株。

以下实施例的PCR扩增所使用的引物序列如下：

UP-F：CATCCACTTGGTGCCTCTGGCAACC；

UP-R：AGTCTTACTCCTATATTCGGAAAAAAC；

UP-R2：ATGCGGAAGGAAACATAACCATTTAAGGAGTCTTACTCCTATATTCGGAAAAAAC；

DOWN-F：CCTTAAATGGTTATGTTTCCTTCCG；

DOWN-R：CACTATCGATACGCCAGAGAAATTC。

实施例1、构建需钠弧菌生产P(3HB-co-LA)的代谢途径

本实施例需构建的需钠弧菌生产P(3HB-co-LA)的代谢途径如图2所示，具体如下：

第一轮同源重组：将cat-sacB片段整合到基因组上的特定位点，挑取在LB3+200μg/mL Spec+5μg/mL Cm的培养基上正常生长的菌落进行PCR验证，获得cat-sacB正确的整合菌株。

第二轮同源重组：sacB编码分泌型果聚糖蔗糖酶，该酶催化蔗糖生成果聚糖，果聚糖在细胞周质大量积累会对细胞产生毒性，造成细胞死亡。第一轮同源重组所得菌株带有反向筛选标记基因sacB，对蔗糖敏感。在反向筛选压力存在条件下，用含有目的序列的同源重组片段替换cat-sacB片段，从而达到基因敲除、插入或替换的目的。

以下详细描述。

1.1、phaC基因的敲除

1.1.1、phaC基因上下游同源臂的扩增

按照表1的反应体系，使用表2的反应程序，通过PCR扩增获得phaC基因上下游同源臂约600bp的片段。

表1：PCR反应体系

表2：PCR反应程序

其中：扩增下文所述“donor 1”中的phaC基因的上游同源臂所使用的引物对为：UP-F和UP-R，下游同源臂的引物对为DOWN-F和DOWN-R；扩增下文所述“donor 2”中的phaC基因的上游同源臂所使用的引物对为：UP-F和UP-R2，下游同源臂的引物对为DOWN-F和DOWN-R，上述所用DNA模板均为需钠弧菌(V.natriegens)ATCC 14048基因组基因。

1.1.2、获得同源重组片段

将上述1.1.1扩增获得的phaC基因上、下游同源臂与cat-sacB基因片段按“上游同源臂-cat-sacB-下游同源臂”的形式连接，得到的片段命名为donor 1。

将扩增获得的phaC基因上下游同源臂相连接，得到的片段命名为donor 2。

连接方法均采用融合PCR，使用上游片段的上引物UP-F和下游片段的下引物DOWN-R，按照1.1.1中PCR体系和PCR程序进行连接。

1.1.3、质粒pTargetF-tfox电转化需钠弧菌

通过电转将质粒pTargetF-tfox转化入需钠弧菌(V.natriegens)ATCC 14048中，得到含有质粒的转化子。电转方法如下：

(1)将电转感受态细胞从冰箱中取出，冰上化冻，加入100～200ng的质粒pTargetF-tfox，混匀后转移入预冷的1mm电击杯中冰浴3min；

(2)在900V、25μF、200Ω的条件下电击转化，立刻加入600μL LB3培养基混匀，置于37℃摇床中，220rpm复苏1.5h；

(3)复苏后的培养基，6500rpm离心5min，去除上清至剩余100μL时，将菌液重悬，均匀涂布于抗性平板中，37℃过夜培养，挑选平板上的单菌落进行验证，获得含有质粒pTarget-tfox的转化子。

1.1.4、phaC基因敲除

将验证含有质粒pTarget-tfox的V.natriegens转化子接种于含有200μg/mL Spe的3mL LB3培养基中，添加IPTG(终浓度为0.1mM)，于30℃、220rpm过夜培养；

(1)取3.5μL菌液，与350μL海盐溶液(28g/L)混合，加入100～200ng donor 1，转移至1.5mL EP管中，添加IPTG(终浓度为0.1mM),30℃培养4-6h；

(2)往EP管中加入1mL LB3培养基，于30℃摇床、220rpm复苏2h，6500rpm离心去上清，然后涂布于抗性平板上(200μg/mL Spe+5μg/mL Cm)，过夜培养待平板上出现单菌落；

(3)挑选单菌落进行PCR验证，挑选阳性克隆，后续使用基因测序确认donor 1是否正确插入目标位置；

(4)将正确插入donor 1且仍含有质粒pTarget-tfox的V.natriegens转化子接种于含有200μg/mL Spe的3mL液体LB3培养基中，添加IPTG(终浓度为0.1mM)，于30℃、220rpm过夜培养；

(5)取3.5μL菌液，与350μL海盐溶液(28g/L)混合，加入100～200ng donor 2，转移至1.5mL EP管中，添加IPTG(终浓度为0.1mM)，于30℃培养箱中静置4-6h；

(6)往EP管中加入1mL LB3培养基，30℃摇床，220rpm复苏2h，6500rpm离心去上清，接入50mL含有200μg/mL的LBS液体培养基，30℃，220rpm过夜培养。

(7)将摇瓶中菌液于含有200μg/mL的LBS平板上划线，待平板上出现单菌落，经过基因测序后，挑选基因组正确编辑的转化子，接种于3mL LB3培养基中，于37℃、220rpm培养12h；吸取50μL上述菌液于5mL LB3无抗液体培养基中，37℃、220rpm再次培养12h。

(8)将步骤(7)所得的菌液于LB3平板进行划线，于37℃培养8h以上；

(9)挑选平板上长出的单菌落分别在LB3无抗性平板上和LB3奇霉素抗性平板上进行划线，无法在抗性平板上生长而能够在无抗平板上生长的菌落为消除抗性后的菌落，即成功敲除了phaC且不带pTarget-tfox质粒的工程菌株。

1.2、电转化pTrc99a-180和pBAD-Ptrc-pct

成功获得敲除了phaC且不带pTarget-tfox质粒的需钠弧菌后，按照上述1.1中的方法，再次制备感受态细胞并使用电转化方式电转质粒pTrc99a-180，经验证后，再次制备感受态细胞，电转化质粒pBAD-Ptrc-pct

其中，酶基因pct

最终，在含有氯霉素和氨苄青霉素的LB3平板上长出的菌落即为克隆有pTrc99a180和pBAD-Ptrc-pct

构建完成后，获得的需钠弧菌基因工程菌SXY01保存于甘油中(50％v/v)备用。

实施例2、构建大肠弧菌生产P(3HB-co-LA)的代谢途径

2.1、钙转大肠杆菌MG1655

将pTrc99a-180质粒和pBAD-Ptrc-pct

取两种质粒各5μL加入制备的MG1655 100μL钙转感受态中，冰上放置8min以上；42℃热激活90s，冰上放置2min以上；加入900μL液体LB培养基，37℃振荡培养1h；5500rpm离心5min，去除900μL上清，剩余100μL重悬菌体；在含有氯霉素和氨苄青霉素抗性的平板上涂板；最后37℃培养8-12h。挑取单菌落在含有氨苄青霉素和氯霉素的3mLLB试管中培养12h，长出的菌落即为克隆有pTrc99a180和pBAD-Ptrc-pct

构建完成后，保存于甘油中(25％v/v)备用。

实施例3、P(3HB-co-LA)的需钠弧菌生产菌株摇瓶发酵

3.1、摇瓶发酵

取实施例1获得的保存在甘油管中的需钠弧菌基因工程菌SXY01，接种于装有3mLLB液体培养基的试管中培养过夜，培养条件为37℃，220rpm。培养12h后，转入摇瓶发酵培养基中，接种量为2％(v/v)，添加诱导剂IPTG至终浓度为0.1mM。摇瓶的培养条件为30℃，220rpm。

M9培养基的组成为(g/L)：15.1g Na

摇瓶发酵培养基的组成是：于M9培养基中额外添加5g/L的酵母提取物、15g/L的NaCl、100μL/L的微量元素母液、12.5μg/mL的氯霉素、100μg/mL氨苄青霉素和20g/L的葡萄糖。

微量元素母液每升含有FeSO

3.2、P(3HB-co-LA)的萃取和分析方法：

3.2.1、冻干样品的制备

取发酵结束后的菌液20mL，8000rpm离心10min后去上清。用40mL的去离子水洗涤菌体两次后，用1.5mL的去离子水重悬。用液氮速冻后，真空冷冻干燥两天。

3.2.2、酯化液的配置

取170mL甲醇，加入1g/L的苯甲酸后缓慢加入30mL 98wt％的浓硫酸(边加边用玻璃棒搅拌)。

3.2.3、聚合物的萃取

取约15mg步骤3.2.1得到的冻干的样品，置于酯化管中，加入1.5mL分析纯的氯仿和1.5mL步骤3.2.2配置的酯化液。

将3-羟基丁酸钠标品配成100g/L的水溶液，分别取45、75、105、135、165、195μL置于酯化管中，用与样品同样的方法处理，对应终浓度为3、5、7、9、11、13g/L。

将D-乳酸钠标品配成25g/L的水溶液，分别取30、60、90、120、150μL置于酯化管中，用与样品同样的方法处理，对应终浓度为0.5、1、1.5、2、2.5g/L。

样品和标品均需在金属浴中100℃恒温酯化4h。酯化结束后，冰浴降温。加入750mL去离子水，旋涡震荡2min。低速离心使得水相和有机相分离，取氯仿层(下层)进行GC分析。

3.2.4、GC分析

通过GC-2014气相色谱仪(日本岛津)测定细胞中聚合物的单体组成。

色谱柱为rx-5，毛细管柱，长30m，内径0.25mm。检测器为火焰离子化检测器。使用高纯氮气为载气，氢气为燃气，空气为助燃气。使用AOC-20S型自动化进样器，乙醇作为清洗剂。

GC分析程序为：开始时于54℃停留4min，再以5℃/min的速度升温至80℃，随后以10℃/min的速度升温至125℃，再以30℃/min的速度升温至180℃，最后以20℃/min的速度升温至220℃并维持5min。

生物量的测定采用分光光度计法测定600nm下的吸光值。

以葡萄糖为碳源摇瓶发酵，结果如以下表3所示。

表3：基因工程菌SXY01的P(3HB-co-LA)产量及LA组分含量

由表3的结果可知，使用本发明的需钠弧菌基因工程菌SXY01发酵生产聚3羟基丁酸乳酸酯，在20g/L葡萄糖的条件下，P(3HB-co-LA)产量可以占到占细胞干重的21.43％，乳酸组分达13.18％。

实施例4、P(3HB-co-LA)的大肠杆菌生产菌株摇瓶发酵

本实施例选取实施例2获得的大肠杆菌基因工程菌SXY-Eco进行P(3HB-co-LA)的摇瓶发酵，摇瓶发酵培养基的组成是：于M9培养基中额外添加2g/L的酵母提取物、100μL/L的微量元素母液、34μg/mL的氯霉素、100μg/mL氨苄青霉素和10g/L的葡萄糖。

发酵方法以及萃取和分析方法均与实施例3相同，结果如以下表4所示。

表4：基因工程菌SXY-Eco的P(3HB-co-LA)产量及LA组分含量

由表4的结果可知，使用本发明的大肠杆菌基因工程菌SXY-Eco发酵生产聚3羟基丁酸乳酸酯，在10g/L葡萄糖的条件下，P(3HB-co-LA)产量可以占到细胞干重的47.52％，乳酸组分达9.40％，质粒pTrc99a180在大肠杆菌MG1655中也具有较好的聚3羟基丁酸乳酸酯生产效果。

序列表信息:

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软件版本:2.3.0

生成日期:2023-09-26

基本信息:

当前申请/申请人档案名:231123

申请人姓名或名称:华东理工大学

申请人姓名或名称/语言:zh

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发明名称:一种生产聚3羟基丁酸乳酸酯的基因工程菌及其应用(zh)

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