一种特异性结合猪传染性肠胃炎病毒S蛋白的核酸适配体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及种特异性结合高表达TGEVS蛋白的病毒的核酸适配体及其应用。

背景技术

猪传染性胃肠炎（TGE）是一种广泛存在于所有年龄段的猪的急性肠道疾病，在1946年首次被确定为猪传染性肠胃炎病毒（TGEV），从那时起，它在猪群中已经成为一个最常见的腹泻病毒。2周龄以下的哺乳仔猪感染TGEV会引起严重的腹泻、呕吐、脱水和食欲不振的症状，甚至会导致死亡（仔猪感染后死亡率高达100%），这是导致繁殖群经济损失的一个重要原因。TGEV的病原体是一种冠状RNA病毒，研究发现有五种不同类型的冠状病毒可以引起猪疾病：α-CoV，包括猪流行性腹泻病毒（PEDV）、传播胃肠炎病毒（TGEV）、猪肠道甲型冠状病毒（SeACoV）和猪呼吸道冠状病毒（PRCV）；β-CoV，包括猪血凝脑脊髓炎病毒（PHEV）；以及δ-CoV，包括猪三角冠状病毒（PDCoV）。TGEV、PEDV、PDCoV和SeACoV可引起猪肠道冠状病毒病，给猪肉行业带来重大的经济损失。

到目前为止，抗TGEV的灭活疫苗已被证明在一定程度上对预防TGEV感染有一定作用，接种疫苗是预防TGEV感染的主要手段。然而，TGEV感染仔猪的现象仍然广泛存在，这表明目前的商业疫苗不足以解决这一问题，所以增强TGEV疫苗的免疫效果和开发新的有效抗病毒药物是迫在眉睫的问题。另外，TGEV的快速特异性检测对TGE的预防和控制也具有重要意义。虽然几种血清学检测方法可以对TGEV抗体进行有效检测，包括血清中和试验和间接荧光抗体检测，但它需要专业知识和专门设施，而且难以实现对大量血清的检测，在各种血清学测试中检测TGEV时经常会发生交叉反应，产生假阳性结果。所以继续开发新的方法或设计新的检测探针来实现对TGEV的有效检测是非常必要的。

核酸适配体是与抗体相似的功能性物质，相对于靶标有很高的特异性，但其与抗体相比具有更多优势：（1）目标物质种类多样。通过不同方法筛选出的适配体序列现已成功应用于检测不同靶标，例如小分子、蛋白质、多肽、有机染料、病毒、细菌和活细胞等;（2）亲和力高、特异性好且具有可修饰性。适配体的高亲和力来自于它们与靶标结合时的折叠能力，它们既可以将小分子整合到它们的核酸结构中，也可以将自身嵌入到大分子（如蛋白质）的结构中从而实现和各靶标的紧密结合。而且适配体序列仅与所需分析物（靶标）结合，而与整个混合样品中的一些非靶向分析物没有任何交叉反应，这被称为特异性，是减少假阳性结果的关键参数;（3）重现性高、化学稳定性好、制备周期短，合成成本低。一旦获得针对于靶标的适配体序列，就可以从商业来源合成，具有高重现性和纯度高的优势，而且由于寡核苷酸序列的重现性高基于此设计的各传感器可重复使用。此外，与基于蛋白质的抗体或酶相比，DNA适配体通常是高度化学稳定的;（4）合成条件更为方便，免疫原性低，储存要求不高，适合大批量生产。与依赖于动物免疫系统诱导的抗体制备不同，适配体通常是通过SELEX技术筛选出可以用于非免疫原性和毒性靶标的适配体。而且相较于抗体，通过体外筛选更有可能产生针对特定目标区域的适配体。综上所述，核酸适配体是功能性单链DNA或RNA寡核苷酸序列，作为一种新型的靶向识别分子被广泛应用于各个领域。但是目前，虽然通过SELEX技术成功筛选出对不同靶标的适配体序列，但并未发现有研究报道相关TGEVS蛋白的核酸适配体序列，因此本领域对特异性结合TGEV S蛋白的核酸适配体存在需求。

发明内容

基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种特异性结合高表达TGEV S蛋白的病毒的核酸适配体筛选及其应用，本发明与高表达TGEV S蛋白的病毒结合力很强，能特异性识别高表达的TGEV S蛋白和TGEV病毒。

本发明提出的一种特异性结合高表达TGEV S蛋白的核酸适配体，所述核酸适配体序列包含以下四种序列中的至少一种：

A、如SEQ ID No.1所示的DNA序列；

B、与SEQ ID No.1所示DNA序列具有60%以上同源性，且能够特异性结合高表达TGEV S蛋白的DNA序列；

C、在严格条件下与SEQ ID No.1所示DNA序列杂交的DNA序列；

D、由SEQ ID No.1所示DNA序列转录的RNA序列。

优选地，上述与SEQ ID No.1所示DNA序列具有同源性，且能够特异性结合高表达TGEV S蛋白的DNA序列，其同源性可以为60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%。

发明人通过磁珠-SELEX（Bead based SELEX）技术对高表达TGEV的S蛋白进行核酸适配体筛选。

筛选过程如下：（1）通过目标物质（TGEV S蛋白）和磁珠孵育得到TGEV S蛋白-磁珠复合物；（2）向上述复合物中加入定量文库，室温旋转孵育得到TGEV S蛋白-磁珠-文库的混合物；（3）通过对上述混合物高温煮沸解离，磁吸附后得到TGEVS蛋白-文库复合物，即得到单链DNA（ssDNA）；（4）以上述ssDNA作为模板进行PCR循环扩增得到双链DNA（dsDNA），并利用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行切胶回收；（5）利用Lambda酶酶切得到ssDNA，此时就得到文库-TGEV S蛋白复合物，即为下一轮筛选文库。重复上述步骤，通过缩短孵育时间和增加洗涤缓冲液（WB）对TGEV S蛋白-磁珠-文库混合物的洗涤次数来增加筛选压力，并使用高表达的PEDV S1、S2、S3、S4蛋白以及磁珠、BSA作为反筛靶标加入反向筛选提高适配体的特异性。这样的筛选过程直到结合率基本不在上升时停止，结合率采用荧光法测得。筛选得到特异性识别高表达TGEVS蛋白的DNA核酸适配体，简称其为核酸适配体Apt 3，其序列如SEQ IDNo.1所示。

上述与SEQ ID No.1所示DNA序列具有同源性的DNA序列，可以通过在SEQ ID No.1所示DNA序列上删除或增加部分互补的核苷酸等方法获得。

另外，本领域技术人员应该理解，作为对上述技术方案的改进，可对上述核酸适配体的核苷酸序列上的某一位置进行截断，截断的目的主要是为了获得更高的结合TGEV S蛋白的亲和力，或虽然亲和力没有明显提升但是具有更高的稳定性。

本领域技术人员应该理解，作为对上述技术方案的改进，以上经截断、修饰或连接处理后的核酸适配体，都具有原核酸适配体基本相同或类似的分子结构、理化性质和功能，都可应用于与TGEV S蛋白的结合；经截断、修饰或连接处理后的核酸适配体可以保持或提高核酸适配体与TGEVS蛋白的亲和力，或可以提高核酸适配体的稳定性。

优选地，所述核酸适配体序列被修饰，所述修饰包括磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代氧或同位素化。

优选地所述核酸适配体序列上连接荧光标记物、放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料、小肽、siRNA或酶。

本发明还提出了一种核酸适配体衍生物，所述核酸适配体衍生物是由上述核酸适配体序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架序列，或者是由上述核酸适配体改造成的肽核酸。

硫代磷酸酯骨架序列修饰是最简单和广泛使用的可应用于增加核酸酶抗性的化学修饰，未经修饰的核酸适配体可以显示活性，但他们会被核酸酶迅速降解，因此作用有限。在寡核苷酸的磷酸酯骨架上，硫代磷酸酯键用硫原子取代了非桥键氧原子，使得核苷酸间键抵抗核酸酶的降解从而更稳定。

肽核酸(peptidenucleicacids,PNA)是一类以多肽骨架取代糖磷酸主链的DNA类似物，以中性的肽链酰胺2-氨基乙基甘氨酸键取代了DNA中的戊糖磷酸酯键骨架，其余的与DNA相同。PNA可以通过Watson-Crick碱基配对的形式识别并结合DNA或RNA序列，形成稳定的双螺旋结构，有很高的杂交稳定性、优良的特异序列识别能力、不被核酸酶和蛋白酶水解，并可以与配基相连共转染进入细胞。

上述硫代磷酸酯骨架序列和肽核酸可用核酸适配体按照本领域常规方法制得。

本发明还提出了上述核酸适配体或核酸适配体衍生物在抗肿瘤药物中的应用。

本发明还提出了上述核酸适配体或核酸适配体衍生物在捕获高表达TGEV S蛋白的病毒中的应用。

本发明还提出了上述核酸适配体或核酸适配体衍生物在制备检测高表达TGEV S蛋白的试剂盒或分子探针中的应用。

发明人使用磁珠-SELEX方法，通过十五轮的筛选获得了一个特定的核酸适配体Apt 3，它可以特异性结合到高表达的TGEV S蛋白上，核酸适配体Apt 3与高表达TGEV S蛋白的解离常数Kd为33.30±1.59nM，在纳摩尔级别，结合力很强；基于核酸适配体Apt 3对高表达TGEV S蛋白和TGEV病毒的亲和力高、特异性好，可以用核酸适配体Apt 3制备试剂盒或分子探针用于识别、检测高表达TGEV S蛋白的病毒。

附图说明

图1为指数富集磁珠系统进化方法筛选流程图。

图2为4-15轮筛选得到的FAM标记的单链DNA与靶标蛋白（TGEV S蛋白）、反筛蛋白（PEDV S1、PEDV S2、PEDV S3、PEDV S4）结合率的检测结果图。

图3为核酸适配体Apt 3和靶标蛋白（TGEV S蛋白）的解离常数曲线。

图4为荧光-染料法验证核酸适配体Apt 3对靶标蛋白（TGEV S蛋白）的特异性检测结果图。

图5为荧光-染料法验证核酸适配体Apt 3对靶标病毒（TGEV 2P）的特异性检测结果图。

具体实施方式

下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。

以下实施例中所述实验方法如无特殊说明，均为常规方法：所用的实验材料如无特殊说明，均为常规生化试剂，可通过商业途径购买得到。

实施例1

特异性结合高表达TGEV S蛋白的核酸适配体的筛选

1. 合成以下序列所示的随机单链DNA文库和引物：

随机单链DNA文库：

5’-AGCGTCGGATACCACTACTA-N40-ATCATGGAGTTCGTGGT-CAG-3’

其中，“N40”表示40个任意的核苷酸碱基连接而成的序列，该文库由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；

引物信息如表1所示，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；

表1引物及其序列

备注：FP-TGEV S2为正向引物；RP-TGEV S2为反向引物；5’-FAM-FP-TGEVS2为荧光标记的正向引物；5’-PO

将随机单链DNA文库、5’端引物、3’端引物分别用灭菌水配制成浓度均为100uM的贮存液，于-20℃保存备用。

2.采用磁珠-SELEX（Bead based SELEX）筛选方法筛选十五轮，筛选流程如图1所示。具体筛选方法如下。

2.1靶蛋白与磁性粒子的偶联：

摇晃磁性粒子使其均匀（Dynabeads™ His-Tag Isolation and Pulldown，Invitrogen公司，货号10103D），吸取50 μL（0.5 mg）到1.5 mL离心管中。将含有50 μL磁性粒子的1.5 mL管子用磁铁进行磁分离，磁吸5min，弃去上清液。加入250 μL缓冲液B，移液器吹打使磁性粒子重悬。磁吸5min，弃去上清液，重复洗涤2次（命名为：磁性粒子a管）。

缓冲液配制：缓冲液B：结合缓冲液（Binding Buffer，BB）：pH为7.4，含50 mMTris-HCl，5 mM KCl，100 mM NaCl，1 mM MgCl

2.2阳性筛选：

文库预处理变性：95°C变性10 min，冰上冷却10 min（第一轮为初始文库，干粉状，需在4°C，以4000 rpm/min的速度离心1 min，加适量的灭菌水溶解）。

正筛：将变性处理后的适配体文库与B在室温下旋转孵育90 min。（命名为：混合库C）。孵育结束后，磁吸5 min，吸取上清液于离心管中，命名为1。留下的沉淀即包含了新文库，将所获得的新文库命名为：“新文库D”。使用1.0 mL的缓冲液A对新文库D进行洗涤，磁吸后弃去上清，重复两次。再用500 μL缓冲液B洗涤上述文库D，磁分离后弃去上清，重复一次。

2.3适配体解离：

向沉淀的磁珠内加入100 μL灭菌水，煮沸10 min，磁铁吸附5 min，获得的上清即为与蛋白结合的文库。

2.4若为反向筛选，上述上清液混合库C即为新文库，直接进行PCR。

2.5 PCR扩增：先进行小量PCR，反应结束后，利用TBE 3.0%琼脂糖凝胶验证筛选结果。取10 μL的扩增产物，置于琼脂糖凝胶孔中，120 V电压条件下，电泳40min，观察扩增的结果例如条带大小是否符合，有无其他条带。再进行扩大量PCR，反应结束后，将所有的扩增产物置于TBE 3.0%琼脂糖凝胶孔中，120 V电压条件下，电泳40 min，观察扩增的结果（注：此时引物为带修饰的序列）。PCR体系如表2。

表2PCR体系组成：

PCR扩增程序如下：95°C预变性5 min；95°C变性30 s，54°C退火30 s，72°C延伸1min，共25个循环；72°C5 min，4℃保存。

2.6dsDNA回收：将琼脂糖凝胶中的目标条带切下，切下的胶块装入已在侧壁与底部扎孔的500 μL的离心管中，再外套一个1.5 mL的离心管，利用封口膜固定，离心（4°C，12000 rpm，15 min）使液体从凝胶块中挤出，称取液体质量。之后加入等质量体积（1mg对应1 μL）的DNA提取剂，摇匀，然后离心（4℃，12000 rpm，2min），缓慢吸取上层透明液于称量过的空管中，重复2次提取过程。最后加1/10质量体积的醋酸钠（3 mol/L，pH为7.5）和2倍质量体积的无水乙醇（已-20°C预冷），混匀，4°C放置1 h后，离心（12000 rpm，10 min）得dsDNA沉淀，再用1 mL70%乙醇漂洗2次（合并沉淀混合），烘干残留液体，沉淀用适量灭菌水溶解。

2.7酶切法制备ssDNA：使用微量紫外分光光度计测回收的dsDNA的A

2.8多轮筛选：重复上述SELEX步骤，按照预先设置的筛选条件进行之后的筛选。从第二轮开始，增加SELEX筛选压力，即对ssDNA文库浓度、洗涤次数、孵育时间等参数做出相应调整以增加适配体的亲和力（如表3）。

表3筛选流程

。

3. 石墨烯（GO）-荧光辅助法监测筛选过程：该方法借助石墨烯可经π-π堆积作用吸附游离的单链DNA并可通过离心去除石墨烯的特点，来检测每轮筛选产物和TGEV S蛋白的结合力，具体过程如下：（1）将文库25 pmoL和250 μLBB混合后测荧光作为F

4. 高通量测序：经数轮筛选后，选择结合率最高的一轮酶切产物用无标签引物对最后一轮的次级文库进行PCR扩增，其富集产物送往生工（上海）股份有限公司进行高通量测序。

5. 测序结果分析：利用DNAMAN软件对测序获得的序列进行一级结构的同源性对比分析，并用Mfold sever软件对各家族序列进行最小自由能分析和二级结构模拟，选出对于TGEV S2的四条候选适配体。

实施例2

利用荧光-染料法对四条候选适配体进行亲和力分析并检测核酸适配体Apt 3与靶标蛋白的解离常数。

1.亲和力分析：硫黄素T（ThT）是一种水溶性的荧光染料，在游离状态下没有荧光发射，但ThT可通过末端堆叠、嵌入和凹槽结合来识别G-四链体结构，然后产生增强的荧光信号，具体操作如下：

将变性处理后的适配体序列进行不同浓度稀释（0 nM、40 nM、80 nM、100 nM、200nM、300 nM）；向上述不同浓度适配体序列中加入靶标（TGEV S2，10 μg），室温旋转孵育1.5h；向上述混合溶液中加入硫磺素T（30 μg/mL，30 μL），室温避光旋转孵育0.5 h；利用荧光分光光度计（F-7100）测定溶液的荧光值。

运用Origin软件对收集的数据进行处理，根据公式Y=Bmax·X/（Kd+X）进行非线性拟合，求出解离常数Kd值。其中：Y为相应的荧光峰值，Bmax为体系的最大荧光值，X为适配体的浓度。

图3为核酸适配体Apt3与靶标蛋白的亲和力拟合曲线。

由此得到的核酸适配体Apt 3与靶标蛋白的解离常数Kd为33.30±1.59nM，核酸适配体Apt 3与靶标蛋白的结合能力很强，解离常数在纳摩尔级别。

实施例3

利用荧光-染料法检测适配体Apt 3对靶标蛋白和靶标病毒的特异性：

取已变性的适配体Apt 3（400 nM，100 μL）中加入不同靶标（蛋白TGEV 10 μg、PEDV S2 10 μg、PEDV S3 10 μg、PEDV S4 10 μg以及病毒PEDV F2 30 μL、PEDV K16 30 μL、TGEV 2P 30 μL），室温旋转孵育1.5 h；向上述混合溶液中加入硫磺素T（30 μg/mL，30 μL），室温避光旋转孵育0.5 h；利用荧光分光光度计（F-7100）测定溶液的荧光值。结果如图4和图5所示，图4为荧光-染料法验证核酸适配体Apt 3对靶标蛋白（TGEV S蛋白）的特异性检测结果图；图5为荧光-染料法验证核酸适配体Apt 3对靶标病毒（TGEV2P）的特异性检测结果图。

由此得到的核酸适配体Apt 3与靶标蛋白和病毒均有良好的特异性。

由图3、图4、图5和表5得到核酸适配体Apt 3与靶标蛋白的解离常数Kd为33.30±1.59nM，核酸适配体Apt 3与靶标蛋白的结合能力很强，解离常数在纳摩尔级别。

表5为核酸适配体Apt 3的序列及其与靶标蛋白的解离常数

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。