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一种用于骨骼肌损伤标志物miRNA-206及IL-6联检的荧光可视化方法及试剂盒

文献发布时间：2024-04-18 19:58:26

技术领域

本发明属于生物医学领域。具体涉及一种用于同时检测骨骼肌损伤标志物miRNA-206及IL-6荧光探针及试剂盒，并将其用于实际血液样品中miRNA-206及IL-6的荧光检测。

背景技术

在运动过程中，肌肉疲劳被视为一种安全机制，但若持续肌肉疲劳（MF），则肌肉细胞和支持组织的结构损伤即肌肉劳损（MS）就会发生，因此，MF程度可作为MS的早期检测依据。目前临床上对MS诊断主要以影像学为主，如超声成像（Sports health., 2017, 9(4),352）和核磁共振成像（Radiographics,2018, 38(1), 124），但是这些方法仅能帮助临床医生确定MS的严重程度，无法实现早期诊断和预防。MS早期诊断方法主要以肌电信号监测（IEEE T. Neur. Sys. Reh., 2017, 25(9), 1472）和生化指标（Am.J. Physiol. Regul.Integr. Comp. Physiol., 2015, 309(4), R378）检测为主，但是肌电信号主要是肌纤维膜内外离子紊乱和兴奋——收缩耦合作用波动引起，无法更好地体现肌肉当前的代谢活动状态，不能全面反映肌肉的疲劳状态，准确度较低。生物指标由于具有稳定且不受昼夜节律影响变化、与运动强度相关、并存在于生物液体中易被监测等优势，有望成为MS早期诊断依据。

骨骼肌在持续的运动牵拉和应力作用下，会出现代偿性失调，引起肌组织出现不同程度的形态学改变，这也是目前界定运动损伤的一种方法。近年来，已有研究证实有许多miRNAs参与了骨骼肌各项生命生理活动的调节，其中miRNA-206是骨骼肌特异性miRNA，在骨骼肌的发育和再生中起着重要的作用。在损伤的肌肉中，研究发现miR⁃206表达上调，并在肌肉再生中起重要作用。肌肉中Wnt信号通路的激活在细胞从增殖状态转到分化过程起着非常的重要作用，miR⁃206在肌肉再生过程中可通过靶向作用于高迁移率蛋白b3（highmobility group box 3，Hmgb3），抑制Hmgb3对Wnt信号通路激活的抑制作用，从而调节肌肉的再生（J. Clin. Invest., 2012, 122(6): 2054⁃2065.）。

此外，IL-6等促炎因子被认为是介导骨骼肌损伤早期炎症反应主要的炎性因子。在骨骼肌再生中，M1巨噬细胞通过分泌大量的细胞因子如IL-6等参与肌卫星细胞的募集、增殖和分化过程。由巨噬细胞、T细胞等分泌IL-6调节肌肉再生和维持肌肉稳态起着不可替代的作用。在肌卫星细胞中，肌管形成受损，而IL-6的过表达促进了肌肉干细胞的分化，表明IL-6在诱导肌肉干细胞增殖分化和肌管形成中发挥着重要作用（Febs.J., 2013, 280(17): 4131-4148）。

本申请基于前期流行病学调查和血清学样本分析，获得多个MS相关的血清标志物分子的基础上，建立严重跑步功能障碍小鼠模型进行验证和分析，进一步筛选出关键差异分子，如miRNA-206和IL-6作为研究的关键生物标志物，开发相应的快速检测试剂盒。目前miRNA和蛋白基因表达的检测试剂盒多为酶联免疫吸附剂测定（ELISA）和逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）（Plos One, 2010, 5(3), e3694.），但是这些检测方法样本处理复杂，受温度和时间影响较大，需要高技能人员和合适的实验室环境。此外，试剂成本和所需时间等问题不容忽视。因此迫切需要开发新的、快速和准确的诊断工具来检测目标标志物。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明公开了一种用于骨骼肌损伤标志物miRNA-206及IL-6双联检的荧光可视化方法及试剂盒。所述试剂盒可在10分钟左右对miRNA-206及IL-6进行特异性荧光检测。与传统的PCR检测技术相比较，本发明具有快速灵敏、简便价廉、荧光可视化等优势。可以实现对miRNA-206及IL-6的实时、快速、准确、双联检，为骨骼肌损伤的监控及防治创造条件，应用前景广阔。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案。

本发明提供了一种用于骨骼肌损伤标志物miRNA-206及IL-6双联检的荧光可视化检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒主要由PVC底板、样品垫、结合垫、吸水垫、硝酸纤维素膜、检测线和质控线构成；所述结合垫包括Materials-DNA1-DNA-Dye偶联物、Materials-DNA2-Apt-Dye偶联物和DNA6-Dye；所述Materials-DNA1-DNA-Dye偶联物包括金纳米粒子、DNA1和5´端或3´端修饰Dye的DNA-Dye，其中DNA1和DNA-Dye部分互补形成DNA-DNA杂交双链体，DNA-Dye能与miRNA-206互补配对，DNA1的5´端或3´端有巯基修饰，Materials和DNA-DNA杂交双链体通过共价键偶联；所述Materials-DNA2-Apt-Dye偶联物包括金纳米粒子、DNA2和5´端或3´端修饰Dye的Apt-Dye，其中DNA2和Apt-Dye部分互补形成DNA-Apt杂交双链体，Apt-Dye能与IL-6特异结合，DNA2的5´端或3´端有巯基修饰，Materials和DNA-Apt杂交；所述的Materials包括表面含有COOH、NH

进一步地，所述的DNA1包含5´或3´端带有COOH、NH

优选地，所述DNA1序列如下所示：

5´-SH–TTTTTAGAGTGGA-3´；

5´-SH–AAAAAAAGAGAGTGGA-3´；

5´-SH–TTTTTTTTTGGTGAGAGTGGA-3´；

5´-SH–AAAAAAAAAAAAGGGTGAGAGTGGA-3´；

5´-SH–TTTTTTTTTTTTTGTAGGGTGAGAGTGGA-3´；

上述8~16个碱基的单链DNA序列可随意更换碱基种类及顺序，-SH可更换为COOH、NH

进一步地，所述的DNA2包含5´或3´端带有COOH、NH

优选地，所述DNA2序列如下所示：

5´-SH–TTTTTGTTGACTA-3´；

5´-SH–AAAAAAAAGGTTGACTA-3´；

5´-SH–TTTTTTTTTGGAGGTTGACTA-3´；

5´-SH–AAAAAAAAAAAATGGAGGTTGACTA-3´；

5´-SH–TTTTTTTTTTTTTGGATGGAGGTTGACTA-3´；

上述8~16个碱基的单链DNA序列可随意更换碱基种类及顺序，-SH可更换为COOH、NH

进一步地，所述的DNA3包含5´或3´端带有COOH、NH

优选地，所述DNA3序列如下所示：

5´-SH–TTTTTAGAG-3´；

5´-SH–AAAAAAAGAGAG-3´；

5´-SH–TTTTTTTTTGGTGAGAG-3´；

5´-SH–AAAAAAAAAAAAGGGTGAGAG-3´；

5´-SH–TTTTTTTTTTTTTGTAGGGTGAGAG-3´；

上述4~12个碱基的单链DNA序列可随意更换顺序及碱基，-SH可更换为COOH、NH

进一步地，所述的DNA4包含5´或3´端带有COOH、NH

优选地，所述DNA4序列如下所示：

5´-SH–TTTTTGTTG-3´；

5´-SH–AAAAAAAAGGTTG-3´；

5´-SH–TTTTTTTTTGGAGGTTG-3´；

5´-SH–AAAAAAAAAAAATGGAGGTTG-3´；

5´-SH–TTTTTTTTTTTTTGGATGGAGGTTG-3´；

上述4~12个碱基的单链DNA序列可随意更换顺序及碱基，-SH可更换为COOH、NH

进一步地，所述的DNA5包含5´或3´端带有COOH、NH

优选地，所述DNA5序列如下所示：

5´-SH–TTTTTTCAACCTC-3´；

5´-SH–AAAAAAAATCAACCTCCA-3´；

5´-SH–TTTTTTTTTTCAACCTCCATC-3´；

5´-SH–AAAAAAAAAAAATCAACCTCCATCGG-3´；

5´-SH–TTTTTTTTTTTTTCAACCTCCATCGGAA-3´；

上述8~16个碱基的单链DNA序列可随意更换顺序及碱基，-SH可更换为COOH、NH

进一步地，所述的DNA6-Dye包含5´或3´端带有COOH、NH

优选地，所述DNA6序列如下所示：

5´-Cy3–GAGGTTGA-3´；

5´-Cy5–TGGAGGTTGA-3´；

5´-IR750–CCGATGGAGGTTGA-3´；

5´-FAM–TTCCGATGGAGGTTGA -3´；

5´-Rhodamine B–GATGGAGGTTGA -3´；

上述8~16个碱基的单链DNA序列可随意更换顺序及碱基，-SH可更换为COOH、NH

进一步地，所述的DNA-Dye包含5´或3´端带有Cy3、Cy5、FAM、Rhodamine B等任一不同荧光染料标记的具有不同碱基数量的单链DNA序列，所述DNA序列中与miRNA-206互补配对的22个碱基以外的4~12个碱基的单链DNA序列可随意更换顺序及碱基。

优选地，所述DNA-Dye序列如下所示：

5´-Cy3–CCACACACTTCCTTACATTCCACTCT-3´；

5´-Cy5–CCACACACTTCCTTACATTCCACTCTCA-3´；

5´-IR750–CCACACACTTCCTTACATTCCACTCTCACC-3´；

5´-FAM–CCACACACTTCCTTACATTCCACTCTCACCCT-3´；

5´-Rhodamine B–CCACACACTTCCTTACATTCCACTCTCACCCTAC-3´；

上述DNA序列中与miRNA-206互补配对的22个碱基以外的4~12个碱基的单链DNA序列可随意更换顺序及碱基，FAM可更换为Cy3、Cy5、IR750、FAM、Rhodamine B等荧光染料中的一种。

进一步地，所述的Apt-Dye包含5´或3´端带有Cy3、Cy5、FAM、Rhodamine B等任一不同荧光染料标记的具有不同碱基数量的单链DNA序列；所述DNA序列中IL-6适配体的29个碱基以外的4~12个碱基的单链DNA序列可随意更换顺序及碱基，修饰位置可在不同碱基数量的单链DNA序列的5´或3´端。

优选地，所述Apt-Dye序列如下所示：

5´-Cy3–CTTCCAACGCTCGTATTGTAGTCTTTAGTCAAC-3´；

5´-Cy5–CTTCCAACGCTCGTATTGTAGTCTTTAGTCAACCT-3´；

5´-IR750–CTTCCAACGCTCGTATTGTAGTCTTTAGTCAACCTCC-3´；

5´-FAM–CTTCCAACGCTCGTATTGTAGTCTTTAGTCAACCTCCAT-3´；

5´-Rhodamine B–CTTCCAACGCTCGTATTGTAGTCTTTAGTCAACCTCCATCC-3´；

上述DNA序列中IL-6适配体的29个碱基以外的4~12个碱基的单链DNA序列可随意更换顺序及碱基，FAM可更换为Cy3、Cy5、FAM、Rhodamine B等荧光染料中的一种，其修饰位置可在不同碱基数量的单链DNA序列的5´或3´端。

进一步地，所述试剂盒的操作方法为检测时将待测液滴加到样品垫上，进行特异性互补配对5~10min，根据荧光强度变化对miRNA-206及IL-6进行同时定性定量检测，得到定性定量检测结果。

与现有技术比，本发明的有益效果如下。

本发明所公开的试剂盒通过miRNA-206引发探针DNA-Dye发生链置换反应，形成长的、一端带有单链的RNA-DNA双链产物，然后DNA修饰的Materials（Materials-DNA3）可以捕获该产物，通过测定荧光信号来确定miRNA-206浓度。同时，通过IL-6与探针Apt-Dye中适配体结合，形成长的、一端带有单链的Apt-靶蛋白复合物，然后DNA修饰的Materials（Materials-DNA3）可以捕获该产物，通过测定荧光信号来确定IL-6浓度。实现了可以同时检测骨骼肌损伤标志物miRNA-206及IL-6。

本发明所公开的骨骼肌损伤标志物miRNA-206及IL-6荧光探针及试剂盒在检测时将待测血液样本加到样品垫上，进行5~10min的特异性反应，根据有无荧光可准确的检测样品中是否含有miRNA-206以及IL-6，同时根据荧光强度变化可以对miRNA-206及IL-6进行检测。本发明具有快速灵敏、简便价廉、荧光可视化等优势。可以实现对miRNA-206及IL-6的实时、快速、准确、双联检，为骨骼肌损伤的监控及防治创造条件，应用前景广阔。

本发明所公开的试剂盒操作简便、反应时间短，不需要大型精密仪器辅助，非常方便，因此易于在临床和各级基层医疗机构普及和应用。

附图说明

图1.骨骼肌损伤标志物miRNA-206及IL-6双联检的荧光可视化方法及试剂盒示意图。

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思进行等同替换或改变均属于本发明保护范畴。

以下实施例中miRNA-206，广州市锐博生物科技有限公司有售。

IL-6，上海普欣生物技术有限公司有售。

实施例1利用试剂盒1对miRNA-206及IL-6进行检测。

一、本发明所述试剂盒1的制备以及序列准备：

DNA1：5´-SH–TTTTTAGAGTGGA-3´；

DNA2：5´-SH–TTTTTGTTGACTA-3´；

DNA3：5´-SH–TTTTTAGAG-3´；

DNA4：5´-SH–TTTTTGTTG-3´；

DNA5：5´-SH–TTTTTTCAACCTC-3´；

DNA5-Cy3：5´-Cy3–GAGGTTGA-3´；

DNA-Cy3：5´-Cy3–CCACACACTTCCTTACATTCCACTCT-3´；

Apt-Cy3：5´-Cy3–CTTCCAACGCTCGTATTGTAGTCTTTAGTCAAC-3´。

2. GO与DNA1连接：取10μL DNA1（10μM）与10mL GO混合30min。10000rpm离心10min，PBS洗涤三次，得到GO-DNA1。

3. GO与DNA2连接：取10μL DNA2（10μM）与10mL GO混合30min。10000rpm离心10min，PBS洗涤三次，得到GO-DNA2。

4. GO与DNA3连接：取10μL DNA3（10μM）与10mL GO混合30min。10000rpm离心10min，PBS洗涤三次，得到GO-DNA3。

5. GO与DNA4连接：取10μL DNA4（10μM）与10mL GO混合30min。10000rpm离心10min，PBS洗涤三次，得到GO-DNA4。

6. GO与DNA5连接：取10μL DNA5（10μM）与10mL GO混合30min。10000rpm离心10min，PBS洗涤三次，得到GO-DNA5。

7. GO-DNA1与DNA-Cy3结合：取10μL与DNA-Cy3（10μM）与1mL GO-DNA1在65℃下进行特异性互补配对5min。10000rpm离心10min，PBS洗涤三次，得到GO-DNA1-DNA-Cy3。

8. GO-DNA2与Apt-Cy3结合：取10μL与Apt-Cy3（10μM）与1mLGO-DNA2在65℃下进行特异性互补配对5min。10000rpm离心10min，PBS洗涤三次，得到GO-DNA2-Apt-Cy3。

9. GO-DNA1-DNA-Cy3固定：用PBS缓冲液洗涤结合区，使其湿润。在结合区涂覆一层EDC和NHS混合物（1:6）。用PBS缓冲液再次洗涤结合区。将GO-DNA1-DNA-Cy3滴到结合区，并用玻璃片将其压扁，使GO更好地与结合区接触。将结合区与GO在紫外灯下暴露5min，以激活EDC和NHS，使其与GO表面的羰基反应，并形成共价化学键，将GO固定在结合区上。用PBS缓冲液再次洗涤结合区，以除去未反应的化学品和离子。将结合区在室温下干燥。

10. GO-DNA2-Apt-Cy3固定：用PBS缓冲液洗涤结合区，使其湿润。在结合区涂覆一层EDC和NHS混合物（1:6）。用PBS缓冲液再次洗涤结合区。将GO-DNA2-Apt-Cy3滴到结合区，并用玻璃片将其压扁，使GO更好地与结合区接触。将结合区与GO在紫外灯下暴露5min，以激活EDC和NHS，使其与GO表面的羰基反应，并形成共价化学键，将GO固定在结合区上。用PBS缓冲液再次洗涤结合区，以除去未反应的化学品和离子。将结合区在室温下干燥。

11. GO-DNA3固定：用PBS缓冲液洗涤检测区，使其湿润。在检测区涂覆一层EDC和NHS混合物（1:6）。用PBS缓冲液再次洗涤检测区。将GO-DNA3滴到检测区，并用玻璃片将其压扁，使GO更好地与检测区接触。将检测区与GO在紫外灯下暴露5min，以激活EDC和NHS，使其与GO表面的羰基反应，并形成共价化学键，将GO固定在检测区上。用PBS缓冲液再次洗涤检测区，以除去未反应的化学品和离子。将检测区在室温下干燥。

12. GO-DNA4固定：用PBS缓冲液洗涤检测区，使其湿润。在检测区涂覆一层EDC和NHS混合物（1:6）。用PBS缓冲液再次洗涤检测区。将GO-DNA4滴到检测区，并用玻璃片将其压扁，使GO更好地与检测区接触。将检测区与GO在紫外灯下暴露5min，以激活EDC和NHS，使其与GO表面的羰基反应，并形成共价化学键，将GO固定在检测区上。用PBS缓冲液再次洗涤检测区，以除去未反应的化学品和离子。将检测区在室温下干燥。

13. 试剂盒的制备：将样品垫、结合区、检测区和吸水垫按图1所示固定在底板上。各部分粘贴牢固后，组装好的检测试纸条在干燥条件下，4℃避光保存备用。

二、对miRNA-206及IL-6进行检测：分别将1mL实验组1（含miRNA-206和IL-6）、实验组2（含miRNA-206）、实验组3（含IL-6）与对照组（水）滴加在样品垫上进行检测。用便携式荧光检测仪读取信号，有荧光信号记为+，无荧光信号记为-，检测结果如下。

表1实验组和对照组的测试结果

。

三、检测结果：与对照组相比，实验组能够准确的检测样品中是否含有miRNA-206以及IL-6。因此，骨骼肌损伤标志物miRNA-206以及IL-6荧光探针及双联检试剂盒能够灵敏的检测样品中的miRNA-206以及IL-6。

实施例2利用试剂盒2对miRNA-206及IL-6进行检测。

一、本发明所述试剂盒2的制备。

1. 序列准备：

DNA1：5´-SH–AAAAAAAGAGAGTGGA-3´；

DNA2：5´-SH–AAAAAAAAGGTTGACTA-3´；

DNA3：5´-SH–AAAAAAAGAGAG-3´；

DNA4：5´-SH–AAAAAAAAGGTTG-3´；

DNA5：5´-SH–AAAAAAAATCAACCTCCA-3´；

DNA6-Cy5：5´-Cy5–TGGAGGTTGA-3´；

DNA-Cy5：5´-Cy5–CCACACACTTCCTTACATTCCACTCTCA-3´；

Apt-Cy5：5´-Cy5–CTTCCAACGCTCGTATTGTAGTCTTTAGTCAACCT-3´。

2. RGO与DNA1连接：取10μL DNA1（10μM）与10mL RGO混合30min。10000rpm离心10min，PBS洗涤三次，得到RGO-DNA1。

3. RGO与DNA2连接：取10μL DNA2（10μM）与10mL RGO混合30min。10000rpm离心10min，PBS洗涤三次，得到RGO-DNA2。

4. RGO与DNA3连接：取10μL DNA3（10μM）与10mL RGO混合30min。10000rpm离心10min，PBS洗涤三次，得到RGO-DNA3。

5. RGO与DNA4连接：取10μL DNA4（10μM）与10mL RGO混合30min。10000rpm离心10min，PBS洗涤三次，得到RGO-DNA4。

6. RGO与DNA5连接：取10μL DNA5（10μM）与10mL RGO混合30min。10000rpm离心10min，PBS洗涤三次，得到RGO-DNA5。

7. RGO-DNA1与DNA-Cy5结合：取10μL与DNA-Cy5（10μM）与1mL RGO-DNA1在65℃下进行特异性互补配对5min。10000rpm离心10min，PBS洗涤三次，得到RGO-DNA1-DNA-Cy5。

8. RGO-DNA2与Apt-Cy5结合：取10μL与Apt-Cy5（10μM）与1mL RGO-DNA2在65℃下进行特异性互补配对5min。10000rpm离心10min，PBS洗涤三次，得到RGO-DNA2-Apt-Cy5。

9. RGO-DNA1-DNA-Cy5固定：用PBS缓冲液洗涤结合区，使其湿润。在结合区涂覆一层EDC和NHS混合物（1:6）。用PBS缓冲液再次洗涤结合区。将RGO-DNA1-DNA-Cy5滴到结合区，并用玻璃片将其压扁，使RGO更好地与结合区接触。将结合区与RGO在紫外灯下暴露5min，以激活EDC和NHS，使其与RGO表面的羰基反应，并形成共价化学键，将RGO固定在结合区上。用PBS缓冲液再次洗涤结合区，以除去未反应的化学品和离子。将结合区在室温下干燥。

10. RGO-DNA2-Apt-Cy5固定：用PBS缓冲液洗涤结合区，使其湿润。在结合区涂覆一层EDC和NHS混合物（1:6）。用PBS缓冲液再次洗涤结合区。将RGO-DNA2-Apt-Cy5滴到结合区，并用玻璃片将其压扁，使RGO更好地与结合区接触。将结合区与RGO在紫外灯下暴露5min，以激活EDC和NHS，使其与RGO表面的羰基反应，并形成共价化学键，将RGO固定在结合区上。用PBS缓冲液再次洗涤结合区，以除去未反应的化学品和离子。将结合区在室温下干燥。

11. RGO-DNA3固定：用PBS缓冲液洗涤检测区，使其湿润。在检测区涂覆一层EDC和NHS混合物（1:6）。用PBS缓冲液再次洗涤检测区。将RGO-DNA3滴到检测区，并用玻璃片将其压扁，使RGO更好地与检测区接触。将检测区与RGO在紫外灯下暴露5min，以激活EDC和NHS，使其与RGO表面的羰基反应，并形成共价化学键，将RGO固定在检测区上。用PBS缓冲液再次洗涤检测区，以除去未反应的化学品和离子。将检测区在室温下干燥。

12. RGO-DNA4固定：用PBS缓冲液洗涤检测区，使其湿润。在检测区涂覆一层EDC和NHS混合物（1:6）。用PBS缓冲液再次洗涤检测区。将RGO-DNA4滴到检测区，并用玻璃片将其压扁，使RGO更好地与检测区接触。将检测区与RGO在紫外灯下暴露5min，以激活EDC和NHS，使其与RGO表面的羰基反应，并形成共价化学键，将RGO固定在检测区上。用PBS缓冲液再次洗涤检测区，以除去未反应的化学品和离子。将检测区在室温下干燥。

13. 试剂盒的制备：将样品垫、结合区、检测区和吸水垫固定在底板上。各部分粘贴牢固后，组装好的检测试纸条在干燥条件下，4℃避光保存备用。

表2实验组和对照组的测试结果

。

实施例3利用试剂盒3对miRNA-206及IL-6进行检测。

一、本发明所述试剂盒3的制备。

1. 序列准备：

DNA1：5´-SH–TTTTTTTTTGGTGAGAGTGGA-3´；

DNA2：5´-SH–TTTTTTTTTGGAGGTTGACTA-3´；

DNA3：5´-SH–TTTTTTTTTGGTGAGAG-3´；

DNA4：5´-SH–TTTTTTTTTGGAGGTTG-3´；

DNA5：5´-SH–TTTTTTTTTTCAACCTCCATC-3´；

DNA6-IR750：5´-IR750–CCGATGGAGGTTGA-3´；

DNA-IR750：5´-IR750–CCACACACTTCCTTACATTCCACTCTCACC-3´；

Apt-IR750：5´-IR750–CTTCCAACGCTCGTATTGTAGTCTTTAGTCAACCTCC-3´。

2. MnO

3. MnO

4. MnO

5. MnO

6. MnO

7. MnO

8. MnO

9. MnO

10. MnO

11. MnO

12. MnO

13. 试剂盒的制备：将样品垫、结合区、检测区和吸水垫固定在底板上。各部分粘贴牢固后，组装好的检测试纸条在干燥条件下，4℃避光保存备用。

表3实验组和对照组的测试结果

。

实施例4利用试剂盒4对miRNA-206及IL-6进行检测。

一、本发明所述试剂盒4的制备。

1. AuNPs的制备：配制0.07M氯金酸（HAuCl

2. 序列准备：

DNA1：5´-SH–TTTTTTTTTTTAGGGTGAGAGTGGA-3´；

DNA2：5´-SH–TTTTTTTTTTTATGGAGGTTGACTA-3´；

DNA3：5´-SH–TTTTTTTTTTTAGGGTGAGAG-3´；

DNA4：5´-SH–TTTTTTTTTTTATGGAGGTTG-3´；

DNA5：5´-SH–TTTTTTTTTTATCAACCTCCATCGG-3´；

DNA6-FAM：5´-FAM–TTCCGATGGAGGTTGA -3´；

DNA-FAM：5´-FAM–CCACACACTTCCTTACATTCCACTCTCACCCT-3´；

Apt-FAM：5´-FAM–CTTCCAACGCTCGTATTGTAGTCTTTAGTCAACCTCCAT-3。

3. AuNPs与DNA1连接：取10μL DNA1（10μM）与10mL AuNPs混合30min。10000rpm离心10min，PBS洗涤三次，得到AuNPs-DNA1。

4. AuNPs与DNA2连接：取10μL DNA2（10μM）与10mL AuNPs混合30min。10000rpm离心10min，PBS洗涤三次，得到AuNPs-DNA2。

5. AuNPs与DNA3连接：取10μL DNA3（10μM）与10mL AuNPs混合30min。10000rpm离心10min，PBS洗涤三次，得到AuNPs-DNA3。

6. AuNPs与DNA4连接：取10μL DNA4（10μM）与10mL AuNPs混合30min。10000rpm离心10min，PBS洗涤三次，得到AuNPs-DNA4。

7. AuNPs与DNA5连接：取10μL DNA5（10μM）与10mL AuNPs混合30min。10000rpm离心10min，PBS洗涤三次，得到AuNPs-DNA5。

8. AuNPs-DNA1与DNA-FAM结合：取10μL与DNA-FAM（10 μM）与1mL AuNPs-DNA1在65℃下进行特异性互补配对5 min。10000rpm离心10 min，PBS洗涤三次，得到AuNPs-DNA1-DNA-FAM。

9. AuNPs-DNA2与Apt-FAM结合：取10μL与Apt-FAM（10μM）与1mL AuNPs-DNA2在65℃下进行特异性互补配对5min。10000rpm离心10min，PBS洗涤三次，得到AuNPs-DNA2-Apt-FAM。

10. AuNPs-DNA1-DNA-FAM固定：用PBS缓冲液洗涤结合区，使其湿润。在结合区涂覆一层EDC和NHS混合物（1:6）。用PBS缓冲液再次洗涤结合区。将AuNPs-DNA1-DNA-FAM滴到结合区，并用玻璃片将其压扁，使AuNPs更好地与结合区接触。将结合区与AuNPs在紫外灯下暴露5min，以激活EDC和NHS，使其与AuNPs表面的羰基反应，并形成共价化学键，将AuNPs固定在结合区上。用PBS缓冲液再次洗涤结合区，以除去未反应的化学品和离子。将结合区在室温下干燥。

11. AuNPs-DNA2-Apt-FAM固定：用PBS缓冲液洗涤结合区，使其湿润。在结合区涂覆一层EDC和NHS混合物（1:6）。用PBS缓冲液再次洗涤结合区。将AuNPs-DNA2-Apt-FAM滴到结合区，并用玻璃片将其压扁，使AuNPs更好地与结合区接触。将结合区与AuNPs在紫外灯下暴露5min，以激活EDC和NHS，使其与AuNPs表面的羰基反应，并形成共价化学键，将AuNPs固定在结合区上。用PBS缓冲液再次洗涤结合区，以除去未反应的化学品和离子。将结合区在室温下干燥。

12. AuNPs-DNA3固定：用PBS缓冲液洗涤检测区，使其湿润。在检测区涂覆一层EDC和NHS混合物（1:6）。用PBS缓冲液再次洗涤检测区。将AuNPs-DNA3滴到检测区，并用玻璃片将其压扁，使AuNPs更好地与检测区接触。将检测区与AuNPs在紫外灯下暴露5min，以激活EDC和NHS，使其与AuNPs表面的羰基反应，并形成共价化学键，将AuNPs固定在检测区上。用PBS缓冲液再次洗涤检测区，以除去未反应的化学品和离子。将检测区在室温下干燥。

13. AuNPs-DNA4固定：用PBS缓冲液洗涤检测区，使其湿润。在检测区涂覆一层EDC和NHS混合物（1:6）。用PBS缓冲液再次洗涤检测区。将AuNPs-DNA4滴到检测区，并用玻璃片将其压扁，使AuNPs更好地与检测区接触。将检测区与AuNPs在紫外灯下暴露5min，以激活EDC和NHS，使其与AuNPs表面的羰基反应，并形成共价化学键，将AuNPs固定在检测区上。用PBS缓冲液再次洗涤检测区，以除去未反应的化学品和离子。将检测区在室温下干燥。

14. 试剂盒的制备：将样品垫、结合区、检测区和吸水垫固定在底板上。各部分粘贴牢固后，组装好的检测试纸条在干燥条件下，4℃避光保存备用。

表4实验组和对照组的测试结果

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实施例5利用试剂盒5对血液样品的检测。

一、本发明所述试剂盒5的制备。