一种肝维康片的定量检测方法及其应用

技术领域

本发明属于药物检测技术领域，具体涉及一种肝维康片的定量检测方法及其应用。

背景技术

肝维康片由黄芪、山银柴胡、白术、藿香、马鞭草、防风、连翘、甘草等组成，具有疏肝健脾，清热利湿的作用。用于肝郁脾虚，湿热内阻所致胁痛，症见腹满纳呆，胁肋胀痛，身倦乏力，恶心，厌油腻，大便不爽，舌红苔腻；慢性乙型肝炎见上述证候者。

肝维康片中活性成分众多，且大多活性成分具有保肝、护肝的功效，在肝维康片中发挥着重要作用。而现行肝维康片质量标准仅采用薄层扫描法测定黄芪中黄芪甲苷含量，该测定方法不仅前处理过程较为繁琐，检测灵敏度低；而且仅检测黄芪甲苷，单一成分的含量测定不能反映肝维康片的质量全貌。

因此，提供一种能够全面评价、控制肝维康片质量的方法，对肝维康片质量控制、药物研发，具有重要意义。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种肝维康片的定量检测方法及其应用。本发明提供的定量检测方法，能够全面评价肝维康片质量，应用于肝维康片的质量控制和药物研发。

本发明提供了一种肝维康片的定量检测方法。

具体地，一种肝维康片的定量检测方法，包括以下步骤：

称取马鞭草苷、连翘酯苷A、连翘苷、升麻素苷、甘草苷、甘草酸铵、5-O-甲基维斯阿米醇苷和毛蕊异黄酮，溶解于溶剂中，制得对照品溶液；

称取肝维康片，溶解于溶剂中，制得供试品溶液；

将所述对照品溶液和所述供试品溶液，注入高效液相色谱仪进行检测，得到对照品和供试品的色谱图；并根据所述色谱图的峰面积计算所述供试品中各成分的含量；

在所述检测的过程中，采用流动相进行梯度洗脱，所述流动相包括0.05％～0.2％甲酸水溶液(A)和乙腈(B)；所述梯度洗脱的过程为：

0～25min，所述流动相中乙腈的体积百分比为3％～8％；

25～35min，所述流动相中乙腈的体积百分比由3％～8％升至32％～38％；

35～40min，所述流动相中乙腈的体积百分比由32％～38％升至48％～55％。

优选地，所述流动相包括0.08％～0.15％甲酸水溶液；进一步优选地，所述流动相包括0.08％～0.12％甲酸水溶液。可以理解的是，在所述0.05％～0.2％甲酸水溶液中甲酸的体积百分数占0.05％～0.2％；在所述0.08％～0.15％甲酸水溶液中甲酸的体积百分数占0.08％～0.15％；在所述0.08％～0.12％甲酸水溶液中甲酸的体积百分数占0.08％～0.12％。

优选地，所述梯度洗脱的过程为：

0～25min，所述流动相中乙腈的体积百分比为4％～6％；

25～35min，所述流动相中乙腈的体积百分比由4％～6％升至33％～36％；

35～40min，所述流动相中乙腈的体积百分比由33％～36％升至48％～52％。

进一步优选地，所述梯度洗脱的过程为：

0～25min，所述流动相中乙腈的体积百分比为4％～6％；

25～35min，所述流动相中乙腈的体积百分比由4％～6％升至33％～36％；

35～40min，所述流动相中乙腈的体积百分比由33％～36％升至48％～52％；

40～42min，所述流动相中乙腈的体积百分比为100％；

45～47min，所述流动相中乙腈的体积百分比为100％降至4％～6％。

优选地，所述溶剂选自甲醇、乙醇或乙腈中的至少一种。进一步优选地，所述溶剂为甲醇。甲醇的毒性较小，且溶解性优异，能够更好地溶解肝维康片及其主要活性成分。

优选地，在所述检测的过程中，检测波长为230～250nm、265～285nm和300～320nm。其中，所述检测波长为230～250nm时，检测马鞭草苷、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、毛蕊异黄酮和甘草酸铵；所述检测波长为265～285nm时，检测甘草苷和连翘苷；所述检测波长为300～320nm时，检测连翘酯苷A。

进一步优选地，在所述检测的过程中，所述检测波长为235～245nm、270～280nm和305～315nm；如所述检测波长为240nm、275nm和310nm。

优选地，在所述检测的过程中，采用Agilent ZOBAX SB-C18柱(250×4.6mm，5μm)搭配相同固定相的ZOBAX SB-C18预柱(12.5×4.6mm，5μm)进行HPLC分析。

优选地，在所述检测的过程中，流速为0.8～1.2mL/min，柱温为25～35℃，进样量为5～15μL。如在所述检测的过程中，所述流速为1.0mL/min，所述柱温为30℃，所述进样量为10μL。

优选地，所述供试品溶液的制备过程如下：将一定量的肝维康片研磨成均匀的肝维康片粉末，称取所述肝维康片粉末加入溶剂，超声后将上清液过0.22μm的滤膜，取续滤液作为供试品溶液。

优选地，所述对照品溶液中，所述马鞭草苷的浓度为62.5～312.50μg/mL；所述升麻素苷的浓度为1.25～62.50μg/mL；所述连翘酯苷A的浓度为62.5～312.50μg/mL；所述甘草苷的浓度为6.25～250.00μg/mL；所述5-O-甲基维斯阿米醇苷的浓度为3.13～125.00μg/mL；所述连翘苷的浓度为31.25～312.50μg/mL；所述毛蕊异黄酮的浓度为1.25～125.00μg/mL；所述甘草酸铵的浓度为12.5～150.00μg/mL。

本发明还提供了上述肝维康片的定量检测方法的应用。

具体地，上述肝维康片的定量检测方法在评价、控制肝维康片质量中的应用。

肝维康片由黄芪、山银柴胡、白术、藿香、马鞭草、防风、连翘、甘草等组成。研究发现，马鞭草苷是马鞭草中的重要活性成分，具有多种生物活性，如肝保护、抗丙肝病毒、促进睡眠、保护心肌等作用；防风中色原酮化合物升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷是防风药材中的重要活性成分，且是评价防风药材质量的衡量标准，防风水提物和醇提物均能显著降低小鼠血清ALT、AST活性，降低肝匀浆MDA含量，提高SOD活性，表现出良好的保肝作用；连翘酯苷A和连翘苷是连翘属植物连翘的主要活性成分，连翘酯苷A和连翘苷具有抗炎、抗氧化、改善肝纤维化等功效；甘草苷作为一种单体活性物质是甘草中的主要黄酮类化合物，具有抗抑郁，保护神经、心脏、肝脏等多种药理活性，甘草酸铵亦是甘草中活性成分之一，具有保肝作用；毛蕊异黄酮作为黄芪中黄酮类成分的代表，具有抗氧化、保护肝肾和抗肿瘤的作用。因此，本发明以肝维康片中马鞭草苷、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、连翘酯苷A、连翘苷、甘草苷、甘草酸铵和毛蕊异黄酮作为代表性活性成分，并建立高效液相色谱法同时定量检测代表性活性成分的含量，所述定量检测方法能够全面评价、控制肝维康片的质量，对肝维康片的质量控制、药物研发具有重要意义。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

(1)本发明提供的肝维康片的定量检测方法，能够同时定量测定肝维康片中代表性活性成分马鞭草苷、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、连翘酯苷A、连翘苷、甘草苷、甘草酸铵和毛蕊异黄酮的含量。该定量检测方法能够全面评价、控制肝维康片的质量。

(2)本发明提供的肝维康片的定量检测方法，采用高灵敏度的高效液相色谱仪，开发了能够同时测定8种代表性活性成分的分析方法，该方法操作简便、专属性强、重复性好、结果准确，可为肝维康片的质量控制、质量标准提高提供技术参考。

附图说明

图1为马鞭草苷、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷和连翘苷的线性关系图；

图2为连翘酯苷A、甘草苷、毛蕊异黄酮和甘草酸铵的线性关系图；

图3为对照品混合溶液与肝维康片供试品溶液在检测波长为240nm下的HPLC色谱图；

图4为对照品混合溶液与肝维康片供试品溶液在检测波长为275nm下的HPLC色谱图；

图5为对照品混合溶液与肝维康片供试品溶液在检测波长为310nm下的HPLC色谱图。

具体实施方式

为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。

以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。

本发明实施例提供了一种肝维康片的定量检测方法，具体如下：

1、仪器与试药

1.1仪器

Agilent 1260Infinity高效液相色谱仪(Agilent安捷伦科技有限公司)，超声波清洗机(江苏昆山洁力美超声波仪器有限公司)。

1.2试药与试剂

马鞭草苷(≥98％)、升麻素苷(≥98％)、连翘酯苷A、5-O-甲基维斯阿米醇苷和甘草酸铵(≥98％)购自上海麦克林生化科技有限公司，甘草苷(≥98％)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，连翘苷(95％)购自上海毕得医药科技股份有限公司，毛蕊异黄酮(≥98％)购自成都乐美天医药科技有限公司；乙腈(色谱纯)、甲酸(分析纯)，成都科龙化工试剂厂；肝维康片(批号210202、210201、200102、200801和201201)购自河南福森药业有限公司。

2、方法与结果

2.1对照品溶液的制备

精密称取马鞭草苷、连翘酯苷A和连翘苷2.5mg置于离心管中并分别加入甲醇1mL，升麻素苷0.5mg置于离心管中并加入甲醇1mL，甘草苷和甘草酸铵2mg置于离心管中并分别加入甲醇1mL，5-O-甲基维斯阿米醇苷和毛蕊异黄酮1mg置于离心管中并分别加入甲醇1mL超声溶解，制得对照品溶液。

2.2供试品溶液的制备

将一定量的肝维康片研磨成均匀的粉末，后称取0.5g加入5mL的甲醇超声10min，将上清液过0.22μm的滤膜，取续滤液作为供试品溶液。

2.3色谱条件

采用Agilent ZOBAX SB-C18柱(250×4.6mm，5μm)搭配相同固定相的ZOBAXSB-C18预柱(12.5×4.6mm，5μm)进行HPLC分析。流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为乙腈。梯度洗脱程序：0～25min，5％B；25～35min，5％～35％B；35～40min，35％～50％B；40～42min，100％B；45～47min，100％～5％B。流速为1.0mL/min，检测波长为240nm(马鞭草苷、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、毛蕊异黄酮和甘草酸铵)，275nm(甘草苷和连翘苷)和310nm(连翘酯苷A)，柱温为30℃。所有样品进样量均为10μL。

2.4线性关系考察

分别准确量取马鞭草苷、升麻素苷、连翘酯苷A、甘草苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、连翘苷、毛蕊异黄酮和甘草酸铵的对照品溶液适量，加甲醇溶剂进行稀释至特定浓度，以0.22μm的滤膜过滤后进行HPLC分析。以峰面积对浓度进行线性回归。相应的线性关系图如图1至图2所示，其中图1中A、B、C、D分别为马鞭草苷、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷和连翘苷的线性关系图；图2中A、B、C、D分别为连翘酯苷A、甘草苷、毛蕊异黄酮和甘草酸铵的线性关系图。回归方程、最低检测限(LOD，S/N＝3)和最低定量限(LOQ，S/N＝10)见表1。

表1八个化合物含量的线性范围、线性方程及相关系数、LOD和LOQ数据

2.5精密度实验

取同一份对照品混合溶液，同一天连续测定3次，计算各个成分峰面积的RSD，考察日内精密度；每天进样3次，连续测定3天，计算各个成分峰面积的RSD，考察日间精密度。结果马鞭草苷、升麻素苷、连翘酯苷A、甘草苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、连翘苷、毛蕊异黄酮和甘草酸铵的日内精密度RSD(n＝3)分别为1.3、2.0、0.8、1.1、1.0、0.7、1.5和2.4％，日间精密度RSD(n＝3)分别为0.9、1.0、1.5、0.7、2.1、2.0、1.3和2.5％。结果表明，本发明提供的检测方法的精密度良好。

2.6重复性实验

精密称取同一肝维康片粉末(批号：210202)各3份，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，分别测定，测得马鞭草苷、升麻素苷、连翘酯苷A、甘草苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、连翘苷、毛蕊异黄酮和甘草酸铵各个含量分别为729.61、29.16、1284.41、308.63、72.41、538.14、37.32和156.27μg/g，RSD值小于2.1％。结果表明，本发明提供的检测方法的重复性良好。

2.7回收率实验

采用标准加入法进行回收率实验，分别加入高、中和低三个不同浓度的八种化合物对照品溶液，然后进行含量测定。如表2所示，测得肝维康片(稀释2倍)中马鞭草苷、升麻素苷、连翘酯苷A、甘草苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、连翘苷、毛蕊异黄酮和甘草酸铵含量分别为364.7μg/g(36.47μg/mL)、14.80μg/g(1.48μg/mL)、642.21μg/g(64.59μg/mL)、154.32μg/g(15.61μg/mL)、36.21μg/g(3.62μg/mL)、269.07μg/g(27.00μg/mL)、18.40μg/g(1.84μg/mL)和78.12μg/g(7.8μg/mL)。加样回收率在97.5～104.8％之间，RSD值小于3.8％。相应的HPLC色谱图如图3至图5所示，其中图3中A和B为对照品混合溶液与肝维康片供试品溶液在检测波长为240nm下的HPLC色谱图；图4中C和D为对照品混合溶液与肝维康片供试品溶液在检测波长为275nm下的HPLC色谱图；图5中E和F为对照品混合溶液与肝维康片供试品溶液在检测波长为310nm下的HPLC色谱图。在图3至图5中，从左到右分别对应的是马鞭草苷(1)、升麻素苷(2)、连翘酯苷A(3)、甘草苷(4)、5-O-甲基维斯阿米醇苷(5)、连翘苷(6)、毛蕊异黄酮(7)和甘草酸铵(8)。

表2八个化合物加标回收率的测定结果

2.8样品含量测定

取五个批号的肝维康片样品，按照上述方法制备供试品溶液，采用所建立的HPLC方法测定其中八种化合物的含量，结果如表3所示，五个不同批号的肝维康片样品中八个化合物含量范围差异较小，分别为马鞭草甘727.60～729.92μg/g，升麻素苷29.16～29.80μg/g，连翘酯苷A1283.10～1284.59μg/g，甘草苷307.05～308.73μg/g，5-O-甲基维斯阿米醇苷72.32～73.38μg/g，连翘苷538.14～539.94μg/g，毛蕊异黄酮36.66～37.32μg/g和甘草酸铵155.86～158.52μg/g。表明该产品的质量较为稳定，本发明提供的检测方法能够作为肝维康片的质量控制方法。

表3不同批号肝维康片中八种化合物的含量(μg/g)(n＝3)

本发明实施例提供的定量检测方法的线性拟合度高、精密度高、重复性良好、加样回收率满足要求，能够用于测定肝维康片中代表性活性成分的含量，应用于肝维康片的质量控制和药物研发。

研究发现，在上述的定量检测方法中，若控制梯度洗脱的条件为：0～25min，所述流动相中乙腈的体积百分比为4％～6％；25～35min，所述流动相中乙腈的体积百分比由4％～6％升至33％～36％；35～40min，所述流动相中乙腈的体积百分比由33％～36％升至48％～52％，定量检测效果与上述实施例类似，均具有良好线性拟合度、精密度和重复性。

以上所述实施例仅表达了本发明的1种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。