前列腺素H2 D-异构酶抗体的新用途
文献发布时间:2024-04-18 19:58:30
技术领域
本发明涉及分子生物学领域,尤其是涉及前列腺素H2 D-异构酶抗体的新用途。
背景技术
急性冠脉综合征是指冠状动脉内不稳定的粥样硬化斑块破裂或糜烂继发新鲜血栓形成所导致的心脏急性缺血综合征,分为ST段抬高型心肌梗死、非ST段抬高型心肌梗死和不稳定性心绞痛。引起急性冠脉综合征的冠状动脉疾病仍然是全球范围内主要的死亡原因之一。ST段抬高型心肌梗死占急性冠脉综合征的30%,而非ST段抬高型心肌梗死占70%。其中非ST段抬高型心肌梗死是指心内膜下心肌梗死,是不伴有急性ST段抬高的心肌坏死;心电图上无ST段抬高,无病理性Q波,仅有ST-T波改变,包括ST段压低,T波倒置或两者。心肌梗死除临床症状外,伴有心肌标志物血清肌钙蛋白,肌酸激酶等升高以及谷草转氨酶,乳酸脱氢酶等异常改变。目前,心脏生物标志物如心肌肌钙蛋白T(cTnT)或心肌肌钙蛋白I(cTnI)、肌酸激酶同工酶(CKMB)、肌红蛋白(Myo)的升高均有助于心肌梗死的诊断。
需要强调的是,非ST段抬高型心肌梗死和ST段抬高型心肌梗死是两种不同的临床实体及类别。虽然两者的症状和体征相似,但其心电图(ECG)表现及临床转归不同。由于非ST段抬高型心肌梗死的心电图并无ST段抬高,因此其诊断比ST段抬高型心肌梗死更加依赖于心脏生物标志物。目前,心脏生物标志物已经成为一种重要的诊断工具。ACC/AHA指南推荐肌钙蛋白(cTn)作为疑似心肌梗死患者唯一的心脏生物标志物。cTnT在心脏具有高度特异性,但是要使其浓度上升高于测定的第99个百分位数参考上限(URL)可能需要数小时,而且其仅在心肌梗死期间升高,对疾病的早期诊断及预后价值很小。如果初始肌钙蛋白水平为阴性,仍可怀疑心肌梗死。因此,这些传统的生物标志物并不能全面的反映非ST段抬高型心肌梗死疾病的进展及预后状态,在临床敏感性和特异性上存在局限性。综上所述,对临床上更为多见的非ST段抬高型心肌梗死,由于其发病时心电图并无ST段抬高,其诊断易被延误,在临床上急需寻求新型的、可充分反映心肌功能、心肌损伤程度或发病时间的更高敏感度和特异性的生物标志物。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供前列腺素H2 D-异构酶抗体的新用途,该用途有助于心肌梗死的主要类型非ST段抬高型心肌梗死的早期诊断,以降低死亡率。
本发明采用的技术方案是:
前列腺素H2 D-异构酶抗体在制备非ST段抬高型心肌梗死检测制剂或医疗器械方面的新用途。
优选的,上述前列腺素H2 D-异构酶抗体的新用途,所述医疗器械为非ST段抬高型心肌梗死早期筛查诊断试剂盒。
优选的,上述前列腺素H2 D-异构酶抗体的新用途,所述非ST段抬高型心肌梗死早期筛查诊断试剂盒的检测组包括:包被有前列腺素H2 D-异构酶抗体的多孔板、前列腺素H2D-异构酶纯品作为标准品、生物素标记抗体、辣根过氧化物酶标记亲和素、生物素标记抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液、样本稀释液、洗涤液、底物溶液和终止液,其中,
所述前列腺素H2 D-异构酶标准品浓度为0,0.78,1.56,3.12,6.25,12.5,25,50ng/ml;
所述生物素标记抗体为生物素化的抗前列腺素H2 D-异构酶抗体;
所述辣根过氧化物酶标记亲和素为链霉亲和素;
所述生物素标记抗体稀释液为:0.05%叠氮钠,0.01M磷酸缓冲液pH 7.2;
所述辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液:0.01M磷酸缓冲液pH7.2 0.05%硫柳汞;
所述样本稀释液为86%氯化钠、4.5%磷酸氢二钠、3.5%磷酸二氢钠、5%山羊血清,1%Proclin-300,pH值为6-7;
所述洗涤液:NaCl 9.0g,0.5%吐温20 5ml,加蒸馏水至1000ml;
所述底物溶液为3,3’,5,5’–四甲基联苯胺;
所述终止液:2mol/L硫酸。
上述非ST段抬高型心肌梗死早期筛查诊断试剂盒通过常规方法即可制备得到。
上述非ST段抬高型心肌梗死早期筛查诊断试剂盒的具体操作方法为:
1)取离体血浆样本,检测前在4℃环境下过夜后,2500rpm离心10min,用样本稀释液进行1:100倍稀释后进行检测;
2)标准品制备:标准品于6000rpm离心30s后,用样品稀释液1ml充分溶解标准品,使用移液器对准冻存管底部反复吹打至少5次助溶,充分混匀得到标准品S7。取1.5ml离心管7枚(S0-S6),各加入250μl样本稀释液,吸取250μl标准品S7到第一个离心管中(S6),轻轻吹打混匀;从S6中吸取250μl到第二个EP管中(S5),轻轻吹打混匀;以此类推进行标准品的倍比稀释;S0为样本稀释液;
3)操作步骤:
a)针对设置的标准品孔、待测样本孔,每孔分别加标准品或待测样本100μl,轻轻晃动混匀,贴上板贴,37℃温育2小时;
b)弃去孔内液体,甩干,不用洗涤;
c)每孔加生物素标记抗体100μl,贴上新的板贴,37℃温育1小时;
d)弃去孔内液体,甩干,用洗涤液洗板3次,每次浸泡2分钟,每孔加200μl,甩干;
e)每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100μl,贴上新的板贴,37℃温育1小时;
f)弃去孔内液体,甩干,洗板5次,每次浸泡2分钟,每孔加200μl,甩干;
g)每孔加底物溶液90μl,37℃避光显色20分钟;
h)每孔加终止液50μl,终止反应;
i)反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm处测量各孔的光密度(OD值);
4)数据处理:
使用CurveExpert(vers ion 1.4)软件对OD值进行处理,使用标准品OD值绘制合适的标准曲线并得到相应函数后,将各样品孔OD值代入方程式后得到各孔样本浓度值。
本发明的有益效果是:
本发明利用现代生物学技术和生物信息学分析对前列腺素H2 D-异构酶的检测及功能进行了初步研究,高浓度的前列腺素H2 D-异构酶具有早期预测非ST段抬高型心肌梗死的用途,可应用于制备检测制剂来早期干预;同时,依赖前列腺素H2 D-异构酶的浓度分层分析还可应用于制备非ST段抬高型心肌梗死筛查诊断试剂盒,对早期非ST段抬高型心肌梗死有着较好的评价效能和潜在的巨大应用价值。
附图说明
图1是蛋白质组学检测到的含有前列腺素H2 D-异构酶的网络互作图;
图2是ELISA检测的前列腺素H2 D-异构酶、在正常对照,不稳定性心绞痛及非ST段抬高型心肌梗死患者中的含量,其中,PTGDS:前列腺素H2D-异构酶;对照组:Control;不稳定心绞痛组:unstable angina(UA);非ST段抬高型心肌梗死:non ST-segment elevationmyocardial infarction(NSTEMI)
图3是不同发病时间点的NSTEMI患者以及对照组和不稳定心绞痛组患者血浆PTGDS和传统生物标记物的区别。
图4血浆中PTGDS及传统生物标记物在心肌梗死患者中的变化趋势。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案,下面结合附图及具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。
实施例1
1.人体血浆样本的收集
非ST段抬高型心肌梗死组、ST段抬高型心肌梗死组及不稳定性心绞痛组为于急诊就诊的非ST段抬高型心肌梗死、ST段抬高型心肌梗死及不稳定心绞痛患者,冠脉造影阴性患者为对照组。每位患者自周围静脉采全血2ml,立即于2500rpm离心15分钟,分离上层血浆。再将分离的血浆分为数等份,置于血浆收集管中,置于-80℃冰箱冻存待检。
2.蛋白质组学检测
1)血浆蛋白质组检测
采用数据非依赖采集(Data independent acquisition,DIA)技术检测三组各混合样本中的蛋白质。
2)蛋白提取
a)每个样品取40μl血浆,以结合缓冲液(试剂盒:Binding Buffer)十倍稀释。
b)除去柱子上的盖子,以纸吸去贮存缓冲液。
c)除去柱底部的尖咀,放入大小适合的收集管。
d)加入结合缓冲液,让其靠重力流过柱体。
e)将柱子放入一个新的大小适合的收集管中。
f)加入稀释后的样本,让其靠重力流过柱体。
g)以600μl结合缓冲液清洗柱体。
h)再次以600μl结合缓冲液清洗柱体收集上三步的洗脱组份,即为去除白蛋白/IgG后的样本真空冷冻干燥后备用。
i)将冻干的样品加入300μl SDS裂解进行复溶。
j)将溶液在室温下12000×g离心10mi n,取上清,并再次离心取上清。
k)上清即为样品的总蛋白溶液,进行蛋白浓度测定并分装后储存于-80℃备用。
3)样品定量
样品按定量原理:BCA(b ici nchoni ni nc aci d)与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂,混合一起即成为苹果绿,即BCA工作试剂。在碱性条件下,BCA与蛋白质结合时,蛋白质将Cu
按照BCA方法定量样品中蛋白质。实验步骤如下:
a)按照BCA试剂盒说明书,根据buffer A:Buffer B=50:1(v/v)配置所需体积的显色液。
b)取出部分待测蛋白溶液,加超纯水进行稀释(防止浓度过高,超出标准曲线工作范围)。
c)准备一个干净的96孔板,加入如下梯度的BSA标准蛋白溶液:0,1,2,4,8,12,16,20μl,然后每个孔加入相应体积的超纯水补充体积至20μl。
d)将2μl待测蛋白溶液加入96孔板,每个样品设置三个复孔,同样补充体积至20μl。
e)各孔内加入200μl预配置的显色液(显色液必须现用现配),37℃反应30mi n。
f)使用酶标仪进行吸光度值测定(波长562nm)。
g)根据标准蛋白溶液的已知浓度和吸光度值计算标准曲线,代入待测样品的吸光度值,即可算得蛋白浓度值。
4)SDS-PAGE电泳样品检测实验
a)每个样品取10μg,采用12% SDS-PAGE进行分离。
b)分离后的凝胶采用考马斯亮兰染色法进行染色。具体操作如下:固定2小时;染色12小时;水洗至背景清晰。
c)染色后的凝胶应用ImageScanner扫描仪进行扫描,扫描模式为灰度模式,光密度值为300dp i。
5)胰蛋白酶酶解
具体步骤如下:
a)根据测定的蛋白浓度,每个样品取50μg的蛋白,并用裂解液将不同组样品稀释调整到相同的浓度和体积。
b)在以上蛋白溶液中加入DTT,使得DTT的终浓度为4.5mM,混匀,在55℃孵育30min。
c)在冰上进行冷却直到达到室温(用手感觉时溶液不能太冷也不能太热)。
d)加入相应体积的碘乙酰胺,使得终浓度为9mM,充分混匀,室温避光放置15mi n。
e)在以上溶液中加入6倍体积的丙酮沉淀蛋白,-20℃放置4小时以上或者过夜。
f)4℃,8000×g离心10分钟收集沉淀,挥发丙酮2-3min。
g)加入100μl TEAB2复溶沉淀,加入1/50样品质量的1mg/ml胰酶Trypsin-TPCK,并于37℃消化过夜。
h)加磷酸调PH值为3左右终止酶解反应。
6)肽段除盐
酶解后的肽段采用RP-C18固相萃取柱脱盐。
a)平衡:甲醇1ml(含0.1%TFA)冲洗1次,90%乙腈-水1ml(含0.1%TFA)冲洗1次,水(含0.1%TFA)冲洗1次;
b)样品:样品加1ml(含0.1%TFA)充分溶解,上样,靠重力自然吸附3次;
c)冲洗:0.1%三氟乙酸-水冲洗3次;
d)洗脱:用90%乙腈-水(含0.1%TFA)靠重力自然洗脱3次。
e)复溶:真空抽干,60μL 0.1%甲酸-水复溶。
7)LC-MS/MS高分辨质谱检测
质谱进样前,每个样品按照体积比iRT:待测样品=1:10的体积比混合,作为内标。iRT标准品(Biognosys,ThermoFisher)是包含11条合成的自然界中不存在的肽段的混合试剂盒,其稳定性、灵敏性以及保留时间都经过优化,相对比较稳定,而且不会对待测样品产生影响,因此,被广泛用做色谱系统的校正以及定量质控。本实验中,将iRT标准肽段溶解为浓度为10×的溶液,2-8℃保存(保质期12周)。
i)高pH液相分离
a)样品:所有酶解后的样本取等量肽段混合,使用Agilent 1100 HPLC系统,在pH=10的流动相中进行组分分离。
b)分离条件
色谱柱:Agilent Zorbax Extend–C18窄径柱,2.1×150mm,5μm。
检测波长:紫外210nm和280nm。
流动相A相:ACN-H2O(2:98,v/v),流动相B相:ACN-H2O(90:10,v/v)(两个流动相均用氨水调节pH至10),流速:250μl/min。
梯度洗脱条件:0-10min,2%B;10-10.01min,2-5%B;10.01-37min,5-20%B;37-48min,20-40%B;48-48.01min,40-90%B;48.01-58min,90%B;58-58.01min,90-2%B;58.01-63min,2%B。
组份收集:第10分钟开始,依次每隔一分钟收集洗脱液到1-10号离心管中,按照1→10的顺序循环收取馏分。共收集10个组份,真空冷冻干燥抽干,样品冷冻保存待上质谱。
ii)液质联用条件
a)质谱扫描参数见表1。
表1 DDA质谱条件
b)液相洗脱梯度见表2。
流速300nl/min,buffer A为0.1%FA水溶液,buffer B为0.1%FA/80%ACN/20%水。
表2 DDA色谱条件
每个样品酶解后的肽段单独上机采集,扫描范围设置为350-1250m/z,isolationwindow为26m/z。
DIA质谱扫描参数见表3。
表3 DIA质谱条件
DIA液相洗脱梯度见表4。
流速300nl/min,buffer A为0.1%FA水溶液,buffer B为0.1%FA/80%ACN/20%水。
表4 DIA色谱条件
8)数据解析
此操作的目的是将质谱输出的谱图与fasta库产生的理论谱图进行匹配,将机器信号转变为肽段和蛋白序列信息,然后结合序列信息、肽段保留时间、碎片离子信息等进行谱图库的建立,便于后续的DIA分析。
LC-MS/MS原始文件导入Spectronaut Pulsar软件进行搜库建库。主要参数见表5。
表5 DDA建库参数
DIA原始数据的处理使用Spectronaut Pulsar软件完成,关键步骤如下(详细说明参见软件用户手册)。
a)打开Spectronaut Pulsar软件的Analysis模块,选择“+”新建分析;
b)根据软件提示逐步完成参数设置,开始分析;
c)分析完成,进入“Report”模块导出定量数据。
蛋白质组学检测到的含有前列腺素H2 D-异构酶、H-钙粘着蛋白/H-钙粘连蛋白、Rho GDP解离抑制因子2的网络互作图见图1。
实施例2
酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)
采用ELISA法在新收取的血浆样本中对前列腺素H2 D-异构酶进行了验证。实验原理:待测蛋白的抗体预埋于96孔板底部,标准品和样品加入后,其中的待测蛋白会与抗体结合。在去除未结合的基他底物后,加入待测蛋白的生物素共轭抗体。冲洗,加入抗生物素共扼辣根过氧化物酶标记抗体(HRP),通过冲洗去除未结合的HRP。加入显色剂,终止反应后,测量液体的吸光度。
验证前列腺素H2 D-异构酶,
包被有前列腺素H2 D-异构酶抗体的多孔板
前列腺素H2 D-异构酶纯品作为标准品
生物素标记抗体
辣根过氧化物酶标记亲和素
生物素标记抗体稀释液
辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液
样本稀释液
洗涤液
底物溶液
终止液
其中
所述前列腺素H2 D-异构酶标准品浓度为0,0.78,1.56,3.12,6.25,12.5,25,50ng/ml;
所述生物素标记抗体为生物素化的抗前列腺素H2 D-异构酶抗体;
所述辣根过氧化物酶标记亲和素为链霉亲和素;
所述生物素标记抗体稀释液为:0.05%叠氮钠,0.01M磷酸缓冲液pH 7.2;
所述辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液:0.01M磷酸缓冲液pH7.2 0.05%硫柳汞;
所述样本稀释液为86%氯化钠、4.5%磷酸氢二钠、3.5%磷酸二氢钠、5%山羊血清,1%Proclin-300,pH值为6-7;
所述洗涤液:NaCl 9.0g,0.5%吐温20 5ml,加蒸馏水至1000ml;
所述底物溶液为3,3’,5,5’–四甲基联苯胺;
所述终止液:2mol/L硫酸。
具体操作方法为:
1)取离体血浆样本,检测前在4℃环境下过夜后,2500rpm离心10min,用样本稀释液进行1:100倍稀释后进行检测;
2)标准品制备:标准品于6000rpm离心30s后,用样品稀释液1ml充分溶解标准品,使用移液器对准冻存管底部反复吹打至少5次助溶,充分混匀得到标准品S7。取1.5ml离心管7枚(S0-S6),各加入250μl样本稀释液,吸取250μl标准品S7到第一个离心管中(S6),轻轻吹打混匀;从S6中吸取250μl到第二个EP管中(S5),轻轻吹打混匀;以此类推进行标准品的倍比稀释;S0为样本稀释液;
3)操作步骤:
a)针对设置的标准品孔、待测样本孔,每孔分别加标准品或待测样本100μl,轻轻晃动混匀,贴上板贴,37℃温育2小时;
b)弃去孔内液体,甩干,不用洗涤;
c)每孔加生物素标记抗体100μl,贴上新的板贴,37℃温育1小时;
d)弃去孔内液体,甩干,用洗涤液洗板3次,每次浸泡2分钟,每孔加200μl,甩干;
e)每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100μl,贴上新的板贴,37℃温育1小时;
f)弃去孔内液体,甩干,洗板5次,每次浸泡2分钟,每孔加200μl,甩干;
g)每孔加底物溶液90μl,37℃避光显色20分钟;
h)每孔加终止液50μl,终止反应;
i)反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm处测量各孔的光密度(OD值);
4)数据处理:
使用CurveExpert(vers ion 1.4)软件对OD值进行处理,使用标准品OD值绘制合适的标准曲线并得到相应函数后,将各样品孔OD值代入方程式后得到各孔样本浓度值。结果见图2。
综上,通过实施例1的蛋白质组学研究发现ST段抬高性心肌梗死患者血浆中前列腺素H2 D-异构酶较对照组和不稳定性心绞痛组上调。前列腺素H2 D-异构酶可作为PGD2的催化酶,催化PGH2转化为PGD2,还可作为亲脂配体结合蛋白分泌到细胞膜外。前列腺素H2D-异构酶存在于人的心血管系统,包括平滑肌细胞和内皮细胞以及冠状动脉粥样硬化斑块,从而分泌到冠状动脉循环中。已经证明稳定性心绞痛、原发性高血压和肾功能不全患者中前列腺素H2 D-异构酶水平升高。研究表明,尿和血清中前列腺素H2 D-异构酶的水平可作为糖尿病和高血压肾脏损伤的敏感指标。冠脉循环中前列腺素H2 D-异构酶水平升高可能与心绞痛有关。
实施例1中仅于ST段抬高型心肌梗死患者作了蛋白质组学研究而产生了筛查诊断的结果。针对这一情况,实施例2创新性地应用前列腺素H2 D-异构酶水平升高于非ST段抬高型心肌梗死疾病,采用ELSIA方法研究非ST段抬高型心肌梗死患者血浆中前列腺素H2 D-异构酶的浓度,首次发现在非ST段抬高型心肌梗死患者血浆中前列腺素H2 D-异构酶的浓度明显高于对照组和不稳定性心绞痛(见图2)。更为重要的是,在对不同发病时间点非ST段抬高型心肌梗死患者的血浆进行ELISA检测,首次发现血浆中前列腺素H2 D-异构酶的浓度最早可在发病时间1.5h升高,约4.5h可达高峰,见图3。因此,实施例2证明,与传统的心脏生物标志物比较,非ST段抬高型心肌梗死患者血液中的前列腺素H2 D-异构酶(PTGDS)在其他标志物还未升高时,即有明显升高(见图4),说明前列腺素H2D-异构酶对非ST段抬高型心肌梗死是一种比传统的心脏生物标志物更为敏感的新的生物标志物。这一点对非ST段抬高型心肌梗死的早期诊断是至关重要的,其应用可能挽救大量心肌梗死患者的生命。
以上所述实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述,并非对本发明的范围进行限定,在不脱离本发明设计精神的前提下,本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进,均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
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