一种磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽组合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于食品技术领域，具体涉及一种磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽组合物及其制备方法和应用。

背景技术

肠道菌群是自然界中最复杂的生态系统，肠道细菌种群数量约为10

肠道共生细菌参与人体新陈代谢的多个方面，有助于将机体摄入的淀粉、未吸收的糖、纤维素和非纤维素多糖等复杂营养物转化为肠道中的短链脂肪酸（short-chainfatty acids，SCFA）和气体，将粘蛋白和膳食纤维转化为易于吸收的单糖，通过刺激肠道上皮细胞增殖，促进营养物的吸收和代谢，形成肠道防御的关键屏障。该屏障由全身和粘膜免疫系统组成，并激活生物惰性化合物。碳水化合物和蛋白质发酵产生的SCFA是丁酸盐、丙酸盐和乙酸盐。肠道中产生的SCFA和气体的类型及数量取决于多种因素，包括饮食、肠道微生物群落组成、结肠运输时间以及脂肪酸在结肠中的分布等等。肠道菌群在人类脂肪组织的形成和沉积中起重要作用。实际上，人体肠道细菌之所以能够维持人体能量平衡，主要是因为能够摄取哺乳动物饮食中其他难以消化的成分。此外，微生物群通过从饮食中获得的能量参与能量代谢，特别是在调节体内脂肪储存、形成和脂肪酸氧化等方面。肠道菌群的变化，特别是厚壁菌增加和拟杆菌减少，可能与遗传因素相互作用，在肥胖发生和维持中起重要作用。此外，促成肥胖的重要因素还包括通过发酵不可吸收碳水化合物如膳食纤维、低聚糖等，从结肠摄取较高的能量。相比之下，肠道菌群也可能在神经性厌食症引起的体重严重减轻以及相关的精神障碍、焦虑和抑郁中起决定性作用。

肠道微生物群会受到各种情况的影响，在人的一生处于一种动态变化。健康人和肠道菌群之间有良性互动的沟通，导致肠道内细菌保持稳态平衡，从而保持胃肠道健康。当这种稳态收到干扰，失去平衡时，就会发生肠道菌群失衡，有时又叫肠道菌群失调或肠道菌群紊乱。

有四类重要的肠道菌群失衡：1）有益的微生物生物损失，如肠道菌群比例改变，好细菌的比例减少，甚至某些好细菌消失。2）肠道整体微生物多样性的丧失，特别是细菌的多样性减少。3）潜在有害微生物的过度生长，如肠道产甲烷菌过度生长。4）细菌分布位置的改变，如发生小肠细菌过度生长或小肠真菌过度生长。肠道菌群失衡造成尝试细菌功能成分和代谢活动的改变，引起的肠道菌群内稳态的破坏。

肠道菌群紊乱除了可以引起肠道疾病外，还可能与“肠外疾病的发病”有关。肠道疾病包括腹胀、腹泻、便秘、肠炎、炎症性肠病、肠易激综合征和乳糜泻等。肠道外疾病有文献报道，可以涉及将近90%的疾病，如过敏、哮喘、肥胖、糖尿病、肝病、心血管疾病、慢性肾炎，以及各种自身免疫性疾病。肠道菌群紊乱可“通过信号分子和生物活性代谢物”影响心血管系统，可能通过神经-肠内分泌激素导致疾病，从而导致心力衰竭和其他疾病，如慢性肾病、高血压、肥胖症和糖尿病。因此，维持肠道菌群的平衡对宿主的身体健康显得尤为重要。

发明内容

本发明涉及一种能够改善肠道菌群结构的磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽食用组合物。该食用组合物可以调节肠道菌群的结构，有效改善因肠道菌群失衡所引起的代谢综合症的症状（肥胖等），增加肠道中有益菌群的种类和数量，同时降低有害菌群的种类和数量，提高有益菌与有害菌的比例，提高肠道菌群生产短链脂肪酸的能力，维持肠道中上皮细胞的完整性，提高肠道对营养物质的吸收能力，提高营养物质的生物利用度。

本发明的目的之一在于提供一种磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽食用组合物，包括：磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽、葛根或葛根提取物。

上述组合物中，所述的磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽和葛根或葛根提取物的质量比为1：（1~50），优选为1：（15~25）。

上述组合物中，所述磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽的分子量为250~7500Da，优选为1000~5000Da；所述磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽的50~200μm，优选为100~150μm。所述的磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽由鳕鱼胶原蛋白肽富集在金属有机框架纳米材料上，采用碱性溶液洗脱后得到。

鳕鱼胶原蛋白肽是鳕鱼胶原蛋白经过酸水解或酶水解后得到的小分子肽，是由8-50个氨基酸基团组成，鳕鱼胶原蛋白肽中含有非常丰富的氨基酸类，在所有的氨基酸中含量最高的氨基酸是甘氨酸，能维持机体的年轻态，改善身体的体质。同时，可以通过激活血小板改善凝血，且具有抗疲劳的功能。鳕鱼胶原蛋白肽中含有0.05~0.1%左右的磷酸化鳕鱼蛋白肽，磷酸化鳕鱼蛋白肽具有和钙，镁、铁、锌等金属离子形成配合物的能力促进小肠细胞的摄取。磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽与鳕鱼胶原蛋白肽和鳕鱼胶原蛋白相比，具有更高的抗氧化活性，同时还可以作为抗氧化剂辅助剂显著提高抗氧化剂的抗氧化能力，且在多种体系中（水相、油相）都能表现出抗氧化活性。

上述组合物中，所述葛根或葛根提取物的粒径为100~300μm，优选为125~150μm。葛根提取物或葛根以葛根素和大豆苷计，其中葛根素在食用组合物中的含量为0.75mg/g以上，大豆苷在食用组合物中的含量为0.25mg/g以上。

葛根是一种豆科的药食同源的植物，含有丰富的葛根素、大豆苷等具有很高的营养价值和食用价值，研究表明，葛根粉可以调节肠道微生物的生态，影响肠道菌群代谢营养物质的能力，可提高肠道中乳酸菌、梭状芽孢杆菌、双歧杆菌等益生菌的丰度，降低致病菌的丰度，降低炎症及其它病症的发病风险。

本发明的目的之二在于提供一种上述磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽组合物的制备方法，包括：将磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽、葛根或葛根提取物混合均匀，即得所述的磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽组合物。优选地，所述的制备方法具体包括以下步骤：

（1）金属有机框架纳米材料的制备

将芳香酸化合物与金属化合物混合，加入有机溶剂，氮气保护下恒温反应，洗涤、干燥，得到金属有机框架纳米材料；

（2）磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽的富集

将金属有机框架纳米材料加入到鳕鱼胶原蛋白肽溶液中，搅拌均匀，过滤后，采用碱性溶液洗脱固体组分，将洗脱液干燥后即得所述的磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽；

（3）制备磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽葛根食用组合物

将磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽、葛根或葛根提取物混合均匀，即得所述的磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽组合物。

上述制备方法，所述步骤（1）中：

所述的芳香酸化合物选自3,3-二羧基-4,4-连苯二酚、对苯二甲酸、没食子酸、2,5-二羟基对苯二甲酸、1,3,5-苯三甲酸中的至少一种；

所述的金属化合物选自金属氧化物、金属盐中的至少一种，优选选自氧化镁、氧化锌、硝酸锌、氯化铁、四氧化三铁、二氧化钛、氯化钯中的至少一种；

所述的金属化合物与芳香酸化合物的摩尔比为1:5 ~ 5:1，优选为1:3 ~ 3:1；

所述的有机溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺、3,3-二羧基-4,4-连苯二酚、对苯二甲酸中的至少一种；

以每摩尔金属化合物来计，所述有机溶剂的用量为1~20L，优选为5~15L；

所述恒温反应的条件为：温度为80~350℃、时间为0.5~8h；优选地，所述恒温反应的条件为：温度为100~200℃、时间为1~5h；

所述干燥的条件为：温度为70~200℃、时间为1~20h；优选地，所述恒温反应的条件为：温度为100~120℃、时间为6~18h；

所述的金属有机框架纳米材料任选地加入金属氧化物，优选地，所述的金属氧化物选自金属镁、锌、铁的氧化物中的至少一种。

上述制备方法，所述步骤（2）中：

所述鳕鱼胶原蛋白肽溶液的质量百分浓度为1~50%，优选为5~25%；

以所述鳕鱼胶原蛋白肽溶液为1L来计，所述金属有机框架纳米材料为10~150g，优选为20~80g；

所述碱性溶液选自氨水、NH

所述碱性溶液的质量百分浓度为0.5~5%，优选为2~4%；

所述干燥为喷雾干燥，干燥条件为进口温度80~200℃，优选为120~150℃；料液浓度为10~50%，优选为25~35%；排风量为0.1~0.5m

在本发明的技术方案中，所述磷酸化鳕鱼蛋白肽组合物的制备方法包括：

（1）金属有机框架纳米材料（MOF）的制备

将芳香酸化合物与金属化合物两种原料溶于有机溶剂，氮气保护下100~200℃恒温反应1~5小时后冷却至室温后过滤，甲醇洗涤后高温干燥6~18h，获得粉末状固体即为MOF金属有机框架纳米材料。

（2）磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽的富集

将MOF金属有机框架纳米材料用75%食用酒精溶液清洗三遍，鳕鱼胶原蛋白肽制成质量浓度为5~25%的溶液，二者混合后以60~200rpm的转速在室温下匀速搅拌10~50min，然后过滤分离MOF金属有机框架纳米材料，用碱性溶液洗脱，洗脱液经喷雾干燥后即可得到富集的磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽。

（3）将磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽、葛根或葛根提取物混合均匀，即得所述的磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽组合物。

本发明中利用磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽的磷酸极性基团能够很好地吸附在极性的金属有机框架纳米材料上，从而将磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽成分富集出，将金属有机框架纳米材料与磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽分离后，经过碱性溶液洗脱后得到。

本发明的目的之三在于提供上述磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽组合物，或者上述制备方法得到的磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽组合物，在调节肠道菌群或改善肠道吸收的食品中的应用。该食用组合物可以单独或与其它食品辅料组合形成适合于食用的不同形式，如粉状、胶囊状、片状、凝胶状、果冻状等，粉状形式用10~100℃水冲调并搅拌均匀后即可食用，其它形式可直接食用。本发明中，所述其他食品辅料可以是木瓜粉、西柚果汁粉、蔓越莓粉、红枣粉、姜粉、银耳粉、葡萄籽粉、沙棘粉、乌龙茶粉等。

本发明所述的磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽组合物可以被肠道中的菌群所利用并产生能被肠道内壁细胞吸收的短链脂肪酸，这些短链脂肪酸进入机体后参与机体的新陈代谢，提高了机体的免疫力。短链脂肪酸还可以进一步抑制有害菌群的定殖和增殖，起到进一步调节肠道菌群的作用。通过细胞实验和动物实验的研究表明：本发明提供的磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽组合物能显著提高正常和模型实验小鼠的肠道菌群的生物多样性，显著改变肠道菌群的群落结构，显著提高有益菌群和有害菌群的比例。

增加的有益细菌菌属主要包括： Faecalibacterium属、Lachnospiracertae_sedis属、Gemmiger属、Clostridium XIVa属、Coprococcus属、Ruminococcus属、Parabacteroides属、Bifidobacterium属、Clostridium IV属、Alistipes属、Oscillibacter属、Barnesiella属；降低的有害细菌菌属主要包括：Prevotella属、Megamonas属、Fusobacterium属、Blautia属；

增加的有益细菌菌种主要包括：Faecalibacterium prausnitzii、Barnesiellaintestinihominis、Alistipes putredinis、Bacteroides uniformis、Parabacteroidesdistasonis、Fusicatenibacter saccharivorans，

降低的有害细菌菌种主要包括：Megamonas funiformis、Prevotella copri、Fusobacterium mortiferum。

本发明所述的磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽组合物经体外模拟胃肠消化和厌氧模拟肠道菌群发酵后的溶液，与单独使用磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽、葛根经体外模拟胃肠消化和厌氧模拟肠道菌群发酵后的溶液进行体外Caco-2细胞渗透实验，测定不同物质的生物利用度。研究结果表明：所述组合物复配食用相对单独食用可大大提高营养物质的生物利用度。因此，本发明提供的磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽组合物对于正常生理状态和代谢综合征（如肥胖）状态下的肠道菌群均具有很好的调节作用，该组合物可以提高肠道中的短链脂肪酸的含量，具有一定的免疫调节功能。在本发明所述的技术方案中，所述的短链脂肪酸是指碳原子数小于6的脂肪酸包括但不限于乙酸、丙酸、丁酸、丁二酸（琥珀酸）、戊酸、异戊酸（乳酸）。在本发明所述的技术方案中，所述的可以提高食物中营养成分的生物利用度是指提高了磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽和葛根或葛根提取物中葛根素通过Caco-2单层细胞的能力。

本发明经过将离乳ICR小鼠随机分为高脂饲料组和普通饲料组，饲喂25天后构建肥胖小鼠模型进行生物活性验证实验，结果显示：本发明提供的磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽组合物组合物能显著提高肥胖模型实验大鼠的肠道菌群的生物多样性，显著改变肠道菌群的群落结构，显著提高有益菌群和有害菌群的比例。该磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽组合物组合物还可以提高肠道中的短链脂肪酸的含量，具有一定的免疫调节功能，食用该组合物相比较单独食用来说，可以提高食物中营养成分的生物利用度。本发明所述的技术方案中，所述的单独食用是指磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽添加或不添加不同种类的食用原料，或葛根或葛根提取物添加或不添加不同种类的食用原料。

本发明旨在开发一种能够改善肠道菌群结构的食用组合物。本发明分析了葛根和磷酸化鳕鱼蛋白肽在肠道中的生理活性特点，结合宏基因组测序技术，提出了一种调节肠道菌群及改善肠道吸收的食品组合物，该组合物可以作为一种类似益生元功能的膳食补充剂去调节和改善正常或特定人群的肠道生态状况，比如提高有益菌的丰度，降低致病菌的丰度，提高肠道菌群产生短链脂肪酸的能力，提高机体的免疫力。

附图说明

图1为实施例1磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽葛根组合物处理后肠道中的OUT差异图。

图2为实施例1磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽葛根组合物处理后肠道中的差异菌属。

图3为葛根粉和实施例1磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽葛根组合物中葛根素的表观渗透系数。

发明具体实施方式内容

下面结合具体实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明的进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域技术人员根据本发明内容对本发明做出的一些非本质的改进和调整仍属本发明的保护范围。

实施例1 磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽葛根食用组合物的制备

（1）Mg-MOF金属有机框架纳米材料的制备

将3,3-二羧基-4,4-连苯二酚与MgO以1:2摩尔比混合，每摩尔MgO添加1L N,N-二甲基甲酰胺（DMF），氮气保护下120℃恒温反应3小时后冷却至室温后过滤，甲醇洗涤后高温干燥12h，获得粉末状固体即为Mg-MOF金属有机框架纳米材料。

（2）磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽的富集

将500g Mg-MOF金属有机框架纳米材料用75%食用酒精溶液清洗三遍，鳕鱼胶原蛋白肽制成10L质量浓度为5%的溶液，二者混合后以120rpm的转速在室温下匀速搅拌30min，然后过滤分离Mg-MOF金属有机框架纳米材料，用10%的氨水洗脱，洗脱液经喷雾干燥后即可得到富集的磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽。

（3）制备磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽葛根食用组合物

称取磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽和葛根粉，其中磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽和葛根粉的比例为1:20，充分混合，用80℃热水冲调并搅拌均匀，置4℃冰箱保存备用。饲喂量均按照葛根素50mg/kg计算。

实施例2 磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽葛根食用组合物的制备

(1) Zn-MOF金属有机框架纳米材料的制备

将Zn(NO

（2）磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽的富集

将250g Zn-MOF金属有机框架纳米材料用75%食用酒精溶液清洗三遍，鳕鱼胶原蛋白肽制成10L质量浓度为8%的溶液，二者混合后以80rpm的转速在室温下匀速搅拌30min，然后过滤分离Zn-MOF金属有机框架纳米材料，用10%的氨水洗脱，洗脱液经喷雾干燥后即可得到富集的磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽。

（3）制备磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽葛根食用组合物

称取磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽、葛根粉、木瓜粉和红枣粉，其中磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽、葛根粉、木瓜粉和红枣粉的比例为1:20:5:5，充分混合，用60℃水冲调并搅拌均匀，置4℃冰箱保存备用。饲喂量均按照葛根素50mg/kg计算。

实施例3 磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽葛根食用组合物的制备

(1) Fe

将5mol FeCl

将Zn(NO

将100g Fe

（2）磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽的富集

将300g Fe

（3）制备磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽葛根食用组合物

称取磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽、葛根粉、酵母提取物和沙棘粉，其中磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽、葛根粉、酵母提取物和沙棘粉的比例为1:20:2:3，充分混合，用40℃水冲调并搅拌均匀，置4℃冰箱保存备用。饲喂量均按照葛根素50mg/kg计算。

实施例4磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽葛根食用组合物调节肥胖模型下的肠道菌群

将20只生长状态相同的离乳ICR小鼠用高脂饲料构建肥胖小鼠模型进行生物活性验证实验。将肥胖小鼠随机分为2组，1组为正常饲料（由玉米，面粉，鱼粉，豆粕，次粉，酵母粉，大豆油等配制而成）饲喂组（Control组），2组使用本发明中实施例1食用组合物饲喂组（Treatment 组）。每日利用实施例1所述食用复合物灌胃五次，饲喂量按照实施例1进行，连续灌胃20天后，收集新鲜粪便，提取粪便中的细菌DNA，进行16S rDNA的V3-V4区及宏基因组测序，测序结果分别利用QIIME2和HUMAnN2分析流程进行菌群分析。结果表明，使用本发明所述食用复合物组的OUT数量显著大于对照组（图1所示）。对Control组和Treatment组的差异菌群进行分析，结果见表1和图2，结果表明：饲喂本发明所述食用复合物可以显著提高Faecalibacterium属、Lachnospiracertae_sedis属、Gemmiger属、Clostridium XIVa属、Coprococcus属、Ruminococcus属、Parabacteroides属、Bifidobacterium属、ClostridiumIV属、Alistipes属、Oscillibacter属、Barnesiella属的丰度，显著降低Prevotella属、Megamonas属、Fusobacterium属、Blautia属的丰度。宏基因组分析从菌种水平的结果表明：饲喂本发明所述食用复合物可以显著提高Faecalibacterium prausnitzii、Barnesiellaintestinihominis、Alistipes putredinis、Bacteroides uniformis、Parabacteroidesdistasonis、Fusicatenibacter saccharivorans的丰度，显著降低Megamonasfuniformis、Prevotella copri、Fusobacterium mortiferum的丰度。

表1.磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽组合物处理后肠道中的差异菌种百分占比

实施例5磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽葛根食用组合物对小鼠肠道短链脂肪酸的影响

将20只生长状态相同的ICR小鼠随机分为2组，1组为正常饲料（由玉米，面粉，鱼粉，豆粕，次粉，酵母粉，大豆油等配制而成）饲喂组（对照组），2组使用本发明中食用实施例1组合物饲喂组（处理组）。每日利用实施例1所述食用复合物灌胃五次，饲喂量按照实施例1进行，连续灌胃20天后，收集新鲜粪便，提取粪便中的短链脂肪酸，利用GC-MS进行测定，测定结果见表2，从表2可以看出，使用本发明中食用组合物饲喂组的小鼠肠道中的三种主要脂肪酸的含量均显著高于正常饲料饲喂组的脂肪酸含量。

表2.磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽葛根食用组合物对小鼠肠道短链脂肪酸的影响

实施例6磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽组合物对葛根素生物利用度的影响

称取实施例1磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽和葛根粉，其中磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽和葛根粉的比例为1:20，充分混合，另外单独称取等量的葛根粉。将上述两组粉末加入到等量的清水中混匀，然后按照体外模拟消化程序依次模拟口腔消化、胃消化和小肠消化，经过体外模拟消化程序后收集溶液进行生物利用度试验。首先将Caco-2细胞在Transwell板上培养成单层细胞，然后将收集的消化液添加至Transwell细胞板Caco-2单层细胞的A侧，培养6小时后在Caco-2单层细胞的B侧收集消化液并测定消化液中葛根素的含量，计算表观渗透系数。如图3所示，从图3中可以看出，磷酸化鳕鱼胶原蛋白肽和葛根粉食用复合物经过模拟消化后的溶液中葛根素渗透通过Caco-2单层细胞的能力显著高于葛根粉单独使用经过模拟消化后的溶液中葛根素渗透通过Caco-2单层细胞的能力，说明本发明所述的食用复合物可以提高葛根素的生物利用度。