一种基于eDNA技术兼顾生物入侵种类调查的渔业资源多样性调查方法

技术领域

本发明涉及渔业资源调查技术领域，具体涉及一种基于eDNA技术兼顾生物入侵种类调查的渔业资源多样性调查方法。

背景技术

鱼类多样性是反映水生态健康的重要指标，鱼类生物多样性监测通常采用网具拦截法、电鱼法、网具拖拽捕获和固定式诱捕等方法采集鱼类个体。肉眼观察计数，传统形态学鉴定方法识别鱼类物种。但是该方法效率低、耗费人力物力，且具有极大的偶然性、对生态系统具有一定的破坏。近年来，环境DNA(eDNA, environmental DNA)宏条形码监测技术的发展，为鱼类多样性资源调查与监测提供了新方向。

eDNA技术是通过从环境介质中提取DNA，对基因组的特定DNA片段进行PCR扩增和高通量测序，从而实现对生物群落的监测。例如，Zou等(2020)和舒璐等（2020)利用eDNA技术对鱼类多样性进行了研究，结果显示 eDNA 宏条形码技术可以快速检测鱼类多样性及其空间分布，克服了传统方法的局限性。Evans利用206 升的中型生态系统的研究证明了环境DNA 方法研究鱼类和两栖类的多样性及生物量的可行性。国内越来越多的研究学者也陆续开展基于eDNA技术的生物多样性研究工作，包括淮河流域、长江流域等全国各河流湖泊。

OTU（Operational Taxonomic Unit；操作分类单元），是指分子水平的最小分类单元，分子序列相同或者类似的DNA被认为是一个OTU。这种划分类似于传统形态学的“物种”的概念，但是OTU又不完全等同于物种。生态学家普遍认为OTU越多，代表物种多样性也越高。太湖是我国第三大淡水湖泊，渔业资源十分丰富，太湖鱼类志共记载太湖鱼类共107种。近年来，对太湖鱼类的调查较多，均是基于传统的形态学调查方法，基于太湖的eDNA鱼类多样性的研究鲜有报道。

发明内容

为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种基于eDNA技术兼顾生物入侵种类调查的渔业资源多样性调查方法。

为实现上述目的，本发明提供一种基于eDNA技术进行渔业资源多样性调查的方法，其包括以下步骤，收集表层水体的环境DNA，使用序列SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56所示引物对进行pcr，使用DNA Library Prep Kit试剂盒对pcr产物进行高通量测序，利用EcoView软件中USEARCH进行物种 OTUs聚类，基于NCBI数据库进行物种注释，获得物种名录。

优选的，所述PCR，其体系包含Taq DNA polymerase 0.3 μL（Takara, Japan），10× PCR Buffer 3 μL，Dntp mixture 2.4 μL，上下游引物各1.5 μL，DNA模板2 μL，ddH

优选的，所述PCR，扩增条件为：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性15 s，57℃退火20s，72℃延伸20 s，35个循环。

优选的，收集表层水体的环境DNA，其为依据土壤基因组DNA提取试剂盒修改方法提取滤膜DNA。

本发明还提供一种调查生物入侵种类的方法，其为：采集水体上层环境DNA样品，进行物种OTUs聚类后，当OTU为序列SEQ ID NO:3：TACGAGAGGCCCAAGTTGATAAAATACGGCGTAAAGCGTGGTTAAAAGCCCCCACTAAACTAAGACTAAACCTTTCCAAAGCTGTTATACGCACCCGGAAATATGAAACTCAACTACGAAAGTGGCCTTAATTTCCCCTTGACCCCACGAAAGCTGCGAA时，可以确定存在生物入侵种食蚊鱼。

本发明的有益效果如下：

本申请方法发现外来物种5种，分别为食蚊鱼、大口黑鲈、尼罗罗非鱼、革胡子鲶、下口鲇，其中食蚊鱼和尼罗罗非鱼为外来入侵物种，与传统方法在鱼类多样性指数、太湖鱼类的洄游性、栖息水层和食性等生态类型结果高度一致，且eDNA技术在各点位的种类检出数均高于传统形态学方法，可以进一步增加监测调查的可靠性。

附图说明

图1为本发明的采样点分布示意图。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本申请作进一步说明。

实施例1

本实施例在太湖均匀设置了16个采样点位，采样点分布见图1(采样位点简称S1~S16)。

采样及样品前处理：样品采集于2020年12月份。在每个采样点，用无菌聚丙烯瓶（Thermo；US）采集2 L表层水（在水面以下约20 cm处采集），现场用0.45 μ m混合纤维素酯（MCE）滤膜（易基诺；南京）过滤，每张滤膜过滤300 mL水样，每个点位过滤滤膜6张作为平行样品，过滤后的滤膜干冰存储。

DNA提取：依据土壤基因组DNA提取试剂盒（天根；上海）修改方法提取滤膜DNA，具体操作如下：将滤膜置于带有研磨珠的5 mL离心管内，加入800 μL缓冲液SA，使用环境DNA均质仪（易基诺；南京）12m/s的速度震荡30s，间隔30s，循环3次。加入150 μL缓冲液SC和15μL蛋白酶K，使用环境DNA均质仪（易基诺；南京）12m/s的速度震荡30s，间隔30 s，循环3次。70 ℃加热裂解15 min，离心2 min，转移全部上清至新的2ml离心管。加入10 μL RNase A，涡旋混匀，室温放置5 min。加入200μ L缓冲液SH，涡旋混匀后于4 ℃静置5 min，离心3min；取上清400 μL至96深孔板第1/7列，后续使用全自动核酸提取纯化仪自动化程序提取。提取结束后将深孔板第5/11列DNA吸出，用于下游实验。

PCR扩增：本研究利用线粒体DNA 12S rRNA区域引物进行鱼类宏条形码扩增，线粒体12S rRNA区域是鱼类检测中常用的引物区域，具有高可变性和高度保守性，该引物提高了鱼类eDNA扩增能力。12S引物PCR扩增体系：总体系30 μL，包含Taq DNA polymerase 0.3μL（Takara, Japan），10× PCR Buffer 3 μL，Dntp mixture 2.4 μL，上下游引物各1.5 μL，DNA模板2 μL，ddH

引物序列F，SEQ ID NO:1：TCGTGCCAGCCACCGCGGTTA；引物序列R，SEQ ID NO:2：ATAGTGGGGTATCTAATCCCAG。

高通量测序及数据分析：使用DNA Library Prep Kit试剂盒（诺唯赞；南京）构建高通量测序文库，利用Ion Proton平台测序仪进行样品的高通量测序。测序数据下机后，数据分析全部基于ubuntu 14.04版本下的EcoView软件。利用EcoView软件中USEARCH进行物种 OTUs(Operational Taxonomic Units)聚类。按照97%的相似性阈值将测序所得序列划分为不同的OTU，基于NCBI数据库完成物种注释。获得的结果与2019-2020年对太湖的5次传统调查数据进行对比分析。

高通量测序共获得2522310条序列，过滤低质量、序列长度小于80 bp和大于250bp后等数据，经注释后获得749449条序列。其中，注释到辐鳍鱼纲的序列数308906条，占总序列数的41%；注释到哺乳纲的序列数410606条，占总序列数的55%；注释到鸟纲的序列数25588条，占总序列数的3%；注释到两栖纲的序列数仅有135条，未注释出的序列数4214条，占总序列数总序列数的1%。按序列相似性97%进行物种聚类，共获得432个OTUs。其中，252个辐鳍鱼纲OTUs，占比58%；147个哺乳纲OTUs，占比34%；24个鸟类OTUs，占比6%；1个两栖纲OTUs，8个未知OTUs，占比2%。

经进一步质控，注释到鱼类物种的序列有253129条，占辐鳍鱼纲序列的81.9%，共注释到77个辐鳍鱼纲OTUs，隶属于8目20科46属54种（表1）。

表1 基于eDNA宏条形码的太湖鱼类物种

本次环境DNA技术调查共计16个点位，每个点位采集6个样本。调查共获得486个OTU，其中，有245个OTU注释到鱼类，占比50.41%；有142个OTU注释到哺乳类，占比29.22%；鸟类（5.14%）、爬行类和两栖类（3.09%）的占比较小，未注释到物种门类的OTU，共占12.76%。本次环境DNA调查获得太湖湖体鱼类共计54种/属，分属于10目20科45属，其中，包括定种鱼类47种（87.03%），定属鱼类7种（12.96%）。结果显示，太湖优势物种为刀鲚、蒙古鲌、子陵吻虾虎鱼及鳙，调查未发现珍稀濒危物种，发现外来物种5种，分别为食蚊鱼、大口黑鲈、尼罗罗非鱼、革胡子鲶、下口鲇，其中食蚊鱼和尼罗罗非鱼为外来入侵物种。eDNA技术能够监测出一些低丰度，而被传统形态监测方法漏检的物种

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。