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一种适用于拟轮枝镰孢菌的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用

文献发布时间：2023-06-19 16:06:26

技术领域

本发明涉及一种适用于拟轮枝镰孢菌的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用。

背景技术

拟轮枝镰孢菌是一类全球范围发生的植物病原真菌，不仅能够通过病原菌侵染造成玉米减产，而且能够产生多种真菌毒素，污染农作物以及农副产品，对人畜的健康造成影响。因此对其功能基因组进行研究以寻找药物靶标来开发相关农药具有重要的经济意义。目前拟轮枝镰孢菌的功能基因组研究受到研究方法效率低以及抗性筛选标记数量少的限制，进展相对缓慢，因此发展新的基因编辑技术对拟轮枝镰孢菌的基础研究、代谢工程以及合成生物学研究等具有重要意义。

尿嘧啶生物合成相关基因可作为营养缺陷型筛选标记应用于丝状真菌的基因功能研究。pyrG基因编码的乳清苷-5’-磷酸脱羧酶和pyrE基因编码的乳清酸磷酸核糖转移酶在尿嘧啶的从头合成途径中起着重要作用，任何一个基因缺失所产生的尿嘧啶缺陷型菌株都不能正常合成生长所必须的尿嘧啶，必须在外源补充尿嘧啶的情况下才能够生长，同时该突变体还可以被5-氟乳清酸(5-FOA)反向筛选。5-FOA筛选的机制如下：5-FOA可以作为乳清酸类似物进入尿嘧啶从头合成路径，最终产生具有细胞毒性的5-氟尿嘧啶，因此野生型菌株的生长会受到抑制，而营养缺陷型菌株因缺少尿嘧啶合成途径，无法将5-FOA转化为有毒物质，因此可以生长。这些特性使得pyrG和pyrE基因具有开发成为抗性筛选标记基因的潜力。对拟轮枝镰孢菌中的尿嘧啶生物合成相关基因进行研究能够促进该类病菌中传转化筛选标记的发掘。

CRISPR/Cas9是近年来快速发展的一种基因编辑技术，主要包含两部分：具有DNA双链剪切功能的Cas9蛋白和能够识别靶标位点的sgRNA。其中sgRNA由能够与靶标DNA序列结合的crRNA以及能够与Cas9蛋白结合的tracRNA组成，crRNA通过tracRNA将Cas9蛋白引导至靶标基因处对DNA双链进行切割，结合生物体自身的DNA修复机制，人为设计实验，即可实现对基因的破坏、敲除、敲入以及单碱基编辑等目的。由于CRISPR/Cas9系统具有原理简单、操作简便、敲除效率高以及成本低廉等优点，已经在动物、植物、细菌以及真菌等生物体中得到广泛应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种适用于拟轮枝镰孢菌的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用，解决了目前拟轮枝镰孢菌基因组功能研究方法效率低以及抗性筛选标记数量少的问题，加快了研究进展，对拟轮枝镰孢菌的基础研究、代谢工程以及合成生物学研究等具有重要意义。

为了达到上述目的，本发明提供的一种适用于拟轮枝镰孢菌的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用，具有如下技术方案：

一种适用于拟轮枝镰孢菌的CRISPR/Cas9载体的构建方法，包括以下步骤：

S1.根据尿嘧啶生物合成相关基因pyrG和pyrE的外显子序列，分别选取核酸序列为如SEQ IDNO.1和SEQ IDNO.2所示的靶标位点locus505和locus86；

S2.以pFC334载体为模板，采用核苷酸序列如SEQ IDNO.3和SEQ IDNO.6、SEQIDNO.5和SEQ IDNO.4所示的引物对进行PCR，分别扩增得到核苷酸序列如SEQ IDNO.9和SEQIDNO.10所示的片段；以pFC334载体为模板，采用核苷酸序列如SEQ IDNO.3和SEQ IDNO.8、SEQ IDNO.7和SEQ IDNO.4所示的引物对进行PCR，扩增得到核苷酸序列如SEQ IDNO.11和SEQ IDNO.12所示的片段；分别以核苷酸序列如SEQ IDNO.9和SEQ IDNO.10、SEQ IDNO.11和SEQ IDNO.12所示的片段为模板，采用核苷酸序列如SEQ IDNO.3和SEQ IDNO.4所示的引物对进行融合PCR，扩增得到核苷酸序列如SEQ IDNO.13和SEQ IDNO.14所示的sgRNA表达框；

S3.以限制性内切酶PacI单酶切pFC332载体，利用一步克隆法将S2步骤所得的sgRNA表达框片段分别连接至pFC332载体上，连接产物转化至TG-1大肠杆菌感受态细胞中，经氨苄霉素抗性筛选、菌落PCR筛选以及测序验证后，得到适用于拟轮枝镰孢菌的CRISPR/Cas9载体。

本发明还提供一种采用上述构建方法构建得到的适用于拟轮枝镰孢菌的CRISPR/Cas9载体。

本发明还提供适用于拟轮枝镰孢菌的CRISPR/Cas9载体在拟轮枝镰孢菌尿嘧啶生物合成基因研究中的应用。

优选地，该应用包括以下步骤：

将上述的CRISPR/Cas9载体通过聚乙二醇(PEG)介导的原生质体转化方法导入拟轮枝镰孢菌的原生质体内，先用潮霉素(Hyg)抗性平板筛选后，再用5-氟乳清酸(5-FOA)抗性平板筛选，挑取转化子扩大培养后提取基因组，测序后与野生型菌株的序列比对，分析靶标基因的突变位点，结合观察突变体的表型，验证尿嘧啶生物合成相关基因的功能。

本发明的一种适用于拟轮枝镰孢菌的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用，解决了目前拟轮枝镰孢菌基因组功能研究方法效率低以及抗性筛选标记数量少的问题，并具有以下优点：

本发明构建了适用于拟轮枝镰孢菌F.verticillioides的CRISPR/Cas9载体，并对尿嘧啶生物合成相关基因进行破坏，通过表型观察进一步验证目的基因的功能，为拟轮枝镰孢菌的功能基因组研究以及新型药物靶标的发掘奠定了技术基础。

附图说明

图1为本发明靶向尿嘧啶生物合成相关基因pyrG和pyrE的CRISPR/Cas9载体pFC332_pyrG_sgRNA505和pFC332_pyrE_sgRNA86的构建图；其中，图中的A为靶标位点locus505和locus86对应的sgRNA表达框片段的融合扩增图，1-2泳道为locus505的sgRNA表达框融合，3-4泳道为locus86的sgRNA表达框融合；图中的B为CRISPR/Cas9载体pFC332_pyrG_sgRNA505的菌落PCR筛斑图，1/4/5/7/8泳道为阳性克隆；图中的C为CRISPR/Cas9载体pFC332_pyrE_sgRNA86的菌落PCR筛斑图，1-4/6-8泳道为阳性克隆；图中的M表示1kb DNAladder。

图2为本发明原生质体制备图；其中，图中的A为镜检幼植体，孢子萌发但是未完全长成菌丝的状态即为幼植体；图中的B为镜检原生质体的图片。

图3为本发明CRISPR/Cas9载体pFC332_pyrG_sgRNA505和pFC332_pyrE_sgRNA86分别导入拟轮枝镰孢菌原生质体进行pyrG和pyrE基因破坏的基因型图；其中括号内的数字表示发生此种基因型改变的突变体的数量。

图4为本发明CRISPR/Cas9载体pFC332_pyrG_sgRNA505和pFC332_pyrE_sgRNA86分别导入拟轮枝镰孢菌原生质体进行pyrG和pyrE基因破坏的表型图；其中，MM为MinimalMedium；UU为0.7g/L uracil+1.5g/Luridine；5-FOA为1.5g/L 5-FOA；Hyg为50μg/mL潮霉素Hygromycin；WT为野生型拟轮枝镰孢菌；dis-pyrG为pyrG基因被破坏的突变体；dis-pyrE为pyrE基因被破坏的突变体。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂。

实施例1靶标位点的选取

在EnsemblFungi网站获取拟轮枝镰孢菌尿嘧啶生物合成相关基因pyrG(Gene ID：FVEG_04828)和pyrE(Gene ID：FVEG_06123)的序列信息，在pyrG基因外显子区域的5’端内部选取一个靶标位点locus505，在pyrE基因外显子区域的5’端内部选取一个靶标位点locus86，所选靶标位点均位于PAM位点(NGG)的5’端20bp序列。利用EnsemblFungi网站的BLAST在线比对工具，将靶标位点与拟轮枝镰孢菌的全基因组序列进行比对，检查其特异性后即可进行后续操作。

locus505的序列(SEQ IDNO.1)：

5’-GTCGCCTTGAGGGTAGGATG-3’；

locus86的序列(SEQ IDNO.2)：

5’-GCAAGAATTCTTGCTTGTAG-3’。

实施例2CRISPR/Cas9载体的构建

以pFC334载体为模板，以pFC334_PacI_F/pyrG_sgRNA505_R、pyrG_sgRNA505_F/pFC334_PacI_R为引物对，利用PrimeSTAR Max Premix(2X)进行PCR，扩增得到pyrG_sgRNA505_1和pyrG_sgRNA505_2片段。

以pFC334载体为模板，以pFC334_PacI_F/pyrE_sgRNA86_R、pyrE_sgRNA86_F/pFC334_PacI_R为引物对，利用PrimeSTAR Max Premix(2X)进行PCR，扩增得到pyrE_sgRNA86_1和pyrE_sgRNA86_2片段。

分别以pyrG_sgRNA505_1和pyrG_sgRNA505_2片段、pyrE_sgRNA86_1和pyrE_sgRNA86_2片段为模板，pFC334_PacI_F/pFC334_PacI_R为引物对，利用PrimeSTAR MaxPremix(2X)进行融合PCR，扩增得到pyrG_sgRNA505和pyrE_sgRNA86表达框。每个sgRNA表达框包括：pFC332载体PacI酶切位点的左端同源臂+PgpdA启动子+含有可变区域的HH核酶(可变区域与靶标位点的前6个碱基反向互补配对)+靶标位点+gRNA scaffold+HDV核酶+TtrpC终止子+pFC332载体PacI酶切位点的右端同源臂，对扩增的表达框产物进行琼脂糖电泳，结果如图1中的A所示，其中，1-2泳道为locus505的sgRNA表达框融合，3-4泳道为locus86的sgRNA表达框融合，M为1kb DNAladder。

用限制性内切酶PacI单酶切pFC332载体，然后用一步克隆法将pyrG_sgRNA505和pyrE_sgRNA86表达框分别连接至pFC332载体中，连接产物42℃热激转化至TG-1大肠杆菌感受态，经过Amp抗性筛选以及用pFC334_PacI_F/pFC334_PacI_R引物对进行菌落PCR筛选后，对扩增产物进行琼脂糖电泳，结果分别如图1中的B和C所示，其中，图1中的B为pFC332_pyrG_sgRNA505的菌落PCR筛斑图，1/4/5/7/8泳道为阳性克隆；图1中的C为pFC332_pyrE_sgRNA86的菌落PCR筛斑图，1-4/6-8泳道为阳性克隆，M为1kb DNAladder。各挑选一个阳性克隆摇菌送生工生物工程有限公司测序，序列比对确认无误后即得到用于基因破坏的CRISPR/Cas9载体pFC332_pyrG_sgRNA505和pFC332_pyrE_sgRNA86；将含有pFC332_pyrG_sgRNA505和pFC332_pyrE_sgRNA86载体的大肠杆菌摇菌，提取质粒。

其中，所用引物序列如下(5’→3’)：

pFC334_PacI_F(SEQ IDNO.3)：

TAGCTGTTTCCGCTGAGGGTTTAATGCGTAAGCTCCCTAATTGGC；

pFC334_PacI_R(SEQ IDNO.4)：

CTGCTGTCTCGGCTGAGGTCTTAATGAGCCAAGAGCGGATTCCTC；

pyrG_sgRNA505_F(SEQ IDNO.5)：

TGAGGACGAAACGAGTAAGCTCGTCGTCGCCTTGAGGGTAGGATGGTTTTAGAGC；

pyrG_sgRNA505_R(SEQ IDNO.6)：

GACGAGCTTACTCGTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGGTCGCCCGGTGATGT；

pyrE_sgRNA86_F(SEQ IDNO.7)：

TGAGGACGAAACGAGTAAGCTCGTCGCAAGAATTCTTGCTTGTAGGTTTTAGAGC；

pyrE_sgRNA86_R(SEQ IDNO.8)：

GACGAGCTTACTCGTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGGCAAGACGGTGATGT。

所得的PCR产物核苷酸序列如下(5’→3’)：

pyrG_sgRNA505-1片段(SEQ IDNO.9)：

pyrG_sgRNA505-2片段(SEQ IDNO.10)：

TGAGGACGAAACGAGTAAGCTCGTCGTCGCCTTGAGGGTAGGATGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATGCTTCGGCATGGCGAATGGGACTGATTTAATAGCTCCATGTCAACAAGAATAAAACGCGTTTCGGGTTTACCTCTTCCAGATACAGCTCATCTGCAATGCATTAATGCATTGGACCTCGCAACCCTAGTACGCCCTTCAGGCTCCGGCGAAGCAGAAGAATAGCTTAGCAGAGTCTATTTTCATTTTCGGGAGACGAGATCAAGCAGATCAACGGTCGTCAAGAGACCTACGAGACTGAGGAATCCGCTCTTGGCTCATTAAGACCTCAGCCGAGACAGCAG；

pyrE_sgRNA86-1片段(SEQ IDNO.11)：

pyrE_sgRNA86-2片段(SEQ IDNO.12)：

TGAGGACGAAACGAGTAAGCTCGTCGCAAGAATTCTTGCTTGTAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATGCTTCGGCATGGCGAATGGGACTGATTTAATAGCTCCATGTCAACAAGAATAAAACGCGTTTCGGGTTTACCTCTTCCAGATACAGCTCATCTGCAATGCATTAATGCATTGGACCTCGCAACCCTAGTACGCCCTTCAGGCTCCGGCGAAGCAGAAGAATAGCTTAGCAGAGTCTATTTTCATTTTCGGGAGACGAGATCAAGCAGATCAACGGTCGTCAAGAGACCTACGAGACTGAGGAATCCGCTCTTGGCTCATTAAGACCTCAGCCGAGACAGCAG；

pyrG_sgRNA505表达框(SEQ IDNO.13)

TAGCTGTTTCCGCTGAGGGTTTAATGCGTAAGCTCCCTAATTGGCCCATCCGGCATCTGTAGGGCGTCCAAATATCGTGCCTCTCCTGCTTTGCCCGGTGTATGAAACCGGAAAGGCCGCTCAGGAGCTGGCCAGCGGCGCAGACCGGGAACACAAGCTGGCAGTCGACCCATCCGGTGCTCTACACTCGACCTGCTGAGGTCCCTCAGTCCCTGGTAGGCAGCTTTGCCCCGTCTGTCCGCCCGGTGTGTCGGCGGGGTTGACAAGGTCGTTGCGTCAGTCCAACATTTGTTGCCATATTTTCCTGCTCTCCCCACCAGCTGCTCTTTTCTTTTCTCTTTCTTTTCCCATCTTCAGTATATTCATCTTCCCATCCAAGAACCTTTATTTCCCCTAAGTAAGTACTTTGCTACATCCATACTCCATCCTTCCCATCCCTTATTCCTTTGAACCTTTCAGTTCGAGCTTTCCCACTTCATCGCAGCTTGACTAACAGCTACCCCGCTTGAGCAGACATCACCGGGCGACCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACGAGTAAGCTCGTCGTCGCCTTGAGGGTAGGATGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATGCTTCGGCATGGCGAATGGGACTGATTTAATAGCTCCATGTCAACAAGAATAAAACGCGTTTCGGGTTTACCTCTTCCAGATACAGCTCATCTGCAATGCATTAATGCATTGGACCTCGCAACCCTAGTACGCCCTTCAGGCTCCGGCGAAGCAGAAGAATAGCTTAGCAGAGTCTATTTTCATTTTCGGGAGACGAGATCAAGCAGATCAACGGTCGTCAAGAGACCTACGAGACTGAGGAATCCGCTCTTGGCTCATTAAGACCTCAGCCGAGACAGCAGpyrE_sgRNA86表达框(SEQ IDNO.14)

TAGCTGTTTCCGCTGAGGGTTTAATGCGTAAGCTCCCTAATTGGCCCATCCGGCATCTGTAGGGCGTCCAAATATCGTGCCTCTCCTGCTTTGCCCGGTGTATGAAACCGGAAAGGCCGCTCAGGAGCTGGCCAGCGGCGCAGACCGGGAACACAAGCTGGCAGTCGACCCATCCGGTGCTCTACACTCGACCTGCTGAGGTCCCTCAGTCCCTGGTAGGCAGCTTTGCCCCGTCTGTCCGCCCGGTGTGTCGGCGGGGTTGACAAGGTCGTTGCGTCAGTCCAACATTTGTTGCCATATTTTCCTGCTCTCCCCACCAGCTGCTCTTTTCTTTTCTCTTTCTTTTCCCATCTTCAGTATATTCATCTTCCCATCCAAGAACCTTTATTTCCCCTAAGTAAGTACTTTGCTACATCCATACTCCATCCTTCCCATCCCTTATTCCTTTGAACCTTTCAGTTCGAGCTTTCCCACTTCATCGCAGCTTGACTAACAGCTACCCCGCTTGAGCAGACATCACCGTCTTGCCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACGAGTAAGCTCGTCGCAAGAATTCTTGCTTGTAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATGCTTCGGCATGGCGAATGGGACTGATTTAATAGCTCCATGTCAACAAGAATAAAACGCGTTTCGGGTTTACCTCTTCCAGATACAGCTCATCTGCAATGCATTAATGCATTGGACCTCGCAACCCTAGTACGCCCTTCAGGCTCCGGCGAAGCAGAAGAATAGCTTAGCAGAGTCTATTTTCATTTTCGGGAGACGAGATCAAGCAGATCAACGGTCGTCAAGAGACCTACGAGACTGAGGAATCCGCTCTTGGCTCATTAAGACCTCAGCCGAGACAGCAG实施例3拟轮枝镰孢菌中尿嘧啶生物合成相关基因pyrG和pyrE的破坏

用于尿嘧啶生物合成相关基因pyrG和pyrE破坏的CRISPR/Cas9载体pFC332_pyrG_sgRNA505和pFC332_pyrE_sgRNA86导入拟轮枝镰孢菌原生质体的方法如下：

将野生型拟轮枝镰孢菌LNF15-11菌株接种至PDA平板，25℃培养7天后，用移液枪吸取3mL酵母浸出粉胨葡萄糖(YEPD)液体培养基，吹打菌丝，将孢子洗下来，置于150mLYEPD液体培养基中，25℃，150rpm过夜摇培10h；显微镜镜检，孢子萌发长成幼植体的状态即可，幼植体镜检结果如图2的A所示，孢子萌发但是未完全长成菌丝的状态即为幼植体；8000rpm，5min离心收集幼植体，弃去上清；用10mL 0.7M NaCl重悬，8000rpm，5min离心，弃去上清，用2mL 0.7M NaCl重悬备用；称取0.1g裂解酶(Lysing enzymes)和0.05g崩溃酶(Driselase)溶解于15mL 0.7M NaCl中，过0.22m细菌过滤器；将幼植体与两种酶混合，用0.7M NaCl定容至20mL，于28℃，100rpm摇培3h；显微镜镜检，确认全部幼植体均裂解为原生质体状态，镜检结果如图2中的B所示；4℃，2500rpm，5min离心收集原生质体，去上清；用10mL提前预冷的0.7MNaCl重悬，4℃，2500rpm，5min离心，去上清，用1mL提前预冷的0.7MNaCl重悬，得到原生质体原液，随后将其浓度调整为10

分别取10μg的pFC332_pyrG_sgRNA505和pFC332_pyrE_sgRNA86载体，加入100μL原生质体中，混匀，冰上静置20min；逐滴加入100μL40％PEG3350溶液，混匀，冰上静置30min；加800μLFRB溶液(Fusarium Regeneration Broth，1M蔗糖、0.02％酵母提取物)，于25℃、150rpm过夜摇培12h复壁；溶解50mLFRA固体培养基(Fusarium RegenerationAgar，1M蔗糖、0.02％酵母提取物、1.5％琼脂粉)，待温度冷却但是不凝固的状态时，加入复壁后的溶液，同时加入50μg/mL Hyg抗性，倒板，凝固后置于25℃培养至长出单个转化子；在平板上覆盖水琼脂(含1.5g/L的5-FOA，0.7g/L的uracil和1.5g/L的uridine)，25℃培养至转化子长到水琼脂表面；将转化子挑取至单个的PDA筛选培养基(含1.5g/L的5-FOA，0.7g/L的uracil和1.5g/L的uridine)上，每个平板可挑取8个转化子，25℃培养4天，将能长起来的转化子单独转接至单个的PDA培养基(含0.7g/L的uracil和1.5g/L的uridine)，25℃培养7天；保存甘油菌，剩余菌丝用于基因组DNA提取，同时提取野生型拟轮枝镰孢菌LNF15-11的基因组DNA。

以转化子和野生型拟轮枝镰孢菌菌株LNF15-11基因组DNA为模板，分别设计如下引物对并合成，pyrG_CRI_Seq_F/pyrG_CRI_Seq_R、pyrE_CRI_Seq_F/pyrE_CRI_Seq_R，用该引物对扩增含有靶标位点的序列并送生工生物工程有限公司测序，测序比对结果表明pyrG和pyrE基因被成功破坏，如图3所示，为CRISPR/Cas9载体pFC332_pyrG_sgRNA505和pFC332_pyrE_sgRNA86分别导入拟轮枝镰孢菌原生质体进行pyrG和pyrE基因破坏的基因型图，其中括号内的数字表示发生此种基因型改变的突变体的数量；测序验证后的突变体分别转接至MM、MM_UU、MM_UU+5-FOA、MM_UU+Hyg培养基上进行表型观察(其中，MM：Minimal Medium；UU：0.7g/L uracil+1.5g/L uridine；5-FOA：1.5g/L 5-FOA；Hyg：50μg/mL Hyg)，pyrG和pyrE基因破坏的表型图结果如图4所示，结果显示野生型拟轮枝镰孢菌菌株在普通的MM培养基以及添加UU营养物质的培养基上能够正常生长；而被5-FOA抗生素抑制生长；pyrG和pyrE基因破坏突变体均表现为在普通MM培养基上无法正常生长，只有在外源添加UU营养物质的情况下才能够正常生长，并且表现出对5-FOA的抗性，野生型菌株以及两种破坏突变体的生长均受Hyg抗生素的抑制，说明该体系内的CRISPR/Cas9质粒在无抗性筛选压力的情况下，已经从突变体菌株中丢失。表型观察结果进一步说明pyrG和pyrE基因被成功破坏，同时说明pyrG和pyrE在尿嘧啶生物合成中均具有重要作用。

所用引物序列如下(5’→3’)：

pyrG_CRI_Seq_F(SEQ IDNO.15)：

AATAAGATCTTCACCCCTCGTTCC；

pyrG_CRI_Seq_R(SEQ IDNO.16)：

CGCTATCCTCGTCCAGTTGG；

pyrE_CRI_Seq_F(SEQ IDNO.17)：

ACGGACGGAGAGAGAAAGTG；

pyrE_CRI_Seq_R(SEQ IDNO.18)：

CAATACCGACAACGATACCGC。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

序列表

<110> 中国农业科学院农产品加工研究所

<120> 一种适用于拟轮枝镰孢菌的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> locus505

<400> 1

gtcgccttga gggtaggatg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> locus86

<400> 2

gcaagaattc ttgcttgtag 20

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

tagctgtttc cgctgagggt ttaatgcgta agctccctaa ttggc 45

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

ctgctgtctc ggctgaggtc ttaatgagcc aagagcggat tcctc 45

<210> 5

<211> 55

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

tgaggacgaa acgagtaagc tcgtcgtcgc cttgagggta ggatggtttt agagc 55

<210> 6

<211> 52

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

gacgagctta ctcgtttcgt cctcacggac tcatcaggtc gcccggtgat gt 52

<210> 7

<211> 55

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

tgaggacgaa acgagtaagc tcgtcgcaag aattcttgct tgtaggtttt agagc 55

<210> 8

<211> 52

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

gacgagctta ctcgtttcgt cctcacggac tcatcaggca agacggtgat gt 52

<210> 9

<211> 565

<212> DNA

<213> pyrG_sgRNA505-1

<400> 9

tagctgtttc cgctgagggt ttaatgcgta agctccctaa ttggcccatc cggcatctgt 60

agggcgtcca aatatcgtgc ctctcctgct ttgcccggtg tatgaaaccg gaaaggccgc 120

tcaggagctg gccagcggcg cagaccggga acacaagctg gcagtcgacc catccggtgc 180

tctacactcg acctgctgag gtccctcagt ccctggtagg cagctttgcc ccgtctgtcc 240

gcccggtgtg tcggcggggt tgacaaggtc gttgcgtcag tccaacattt gttgccatat 300

tttcctgctc tccccaccag ctgctctttt cttttctctt tcttttccca tcttcagtat 360

attcatcttc ccatccaaga acctttattt cccctaagta agtactttgc tacatccata 420

ctccatcctt cccatccctt attcctttga acctttcagt tcgagctttc ccacttcatc 480

gcagcttgac taacagctac cccgcttgag cagacatcac cgggcgacct gatgagtccg 540

tgaggacgaa acgagtaagc tcgtc 565

<210> 10

<211> 453

<212> DNA

<213> pyrG_sgRNA505-2

<400> 10

tgaggacgaa acgagtaagc tcgtcgtcgc cttgagggta ggatggtttt agagctagaa 60

atagcaagtt aaaataaggc tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtg 120

cttttggccg gcatggtccc agcctcctcg ctggcgccgg ctgggcaaca tgcttcggca 180

tggcgaatgg gactgattta atagctccat gtcaacaaga ataaaacgcg tttcgggttt 240

acctcttcca gatacagctc atctgcaatg cattaatgca ttggacctcg caaccctagt 300

acgcccttca ggctccggcg aagcagaaga atagcttagc agagtctatt ttcattttcg 360

ggagacgaga tcaagcagat caacggtcgt caagagacct acgagactga ggaatccgct 420

cttggctcat taagacctca gccgagacag cag 453

<210> 11

<211> 565

<212> DNA

<213> pyrE_sgRNA86-1

<400> 11