麻疯树核糖体失活蛋白JcRIP12及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于基因工程及生物医药技术领域，涉及麻疯树核糖体失活蛋白JcRIP12及其编码基因和应用。

背景技术

当前，恶性肿瘤是影响人类平均寿命的主要因素之一，抗肿瘤药物的研发显得尤为重要。植物中的一些活性成分能选择性抑制肿瘤细胞的增殖，在开发抗癌新药方面已经取得了初步成果，为植物蛋白的抗肿瘤活性的研究及其资源的开发利用提供了新的途径。

麻疯树核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating proteins，RIPs)抗肿瘤活性的研究是麻疯树药用价值开发的重大突破。林娟通过体外实验证明从麻疯树中纯化得到的麻疯树种仁毒蛋白Curcin对胃癌细胞(SGC-7901)、小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)以及人肝癌细胞(HepG2)的增殖有明显的抑制作用，但对人宫颈癌细胞(hela)和人正常胚肺二倍体细胞(MRC)无抑制作用。麻疯树树皮核糖体失活蛋白Jc-SCRIP也表现出了对MCF-7细胞、SW620和HepG2的增殖抑制作用，对MCF-7细胞、SW620和HepG2的IC

目前，天然的核糖体失活蛋白的分离纯化工艺繁琐，提纯得率也非常低。例如，CN101891798B公开了麻疯树种仁毒蛋白Curcin的分离纯化方法，CN 107058261 B公开了麻疯树核糖体失活蛋白Curcin C的分离纯化方法。但二者的工艺过程繁琐复杂，不但工艺时间长，生产效率低，而且生产成本较高，不利于实现规模化的生产，这就阻碍了麻疯树核糖体失活蛋白的实际应用。因此，若能为麻疯树核糖体失活蛋白的工业生产提供更简捷的方法，对于麻疯树核糖体失活蛋白在抗肿瘤领域的实际应用将产生有力的推动作用。

发明内容

本发明提供了麻疯树核糖体失活蛋白JcRIP12、编码基因、载体和宿主，以及所述麻疯树核糖体失活蛋白JcRIP12在制备治疗肿瘤的药物中的应用，以丰富具有抗肿瘤活性的麻疯树核糖体失活蛋白的种类，为抗肿瘤药物的研发提供支持，并解决现有技术从麻疯树中分离纯化麻疯树核糖体失活蛋白存在的分离纯化过程繁琐、工艺复杂、生产效率低下和生产成本较高的问题。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明提供的麻疯树核糖体失活蛋白JcRIP12编码基因，该编码基因编码氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示的蛋白质，该编码基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种密码子优化的麻疯树核糖体失活蛋白JcRIP12编码基因，该编码基因编码氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示的蛋白质，该编码基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示的编码基因，是为了实现通过原核表达的方式获得麻疯树核糖体失活蛋白JcRIP12，在不改变基因编码氨基酸序列的前提下，依据大肠杆菌密码子偏好性对核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1的编码基因的密码子进行优化之后得到的。

在上述编码基因的技术方案的基础之上，本发明还提供了麻疯树核糖体失活蛋白JcRIP12，该麻疯树核糖体失活蛋白JcRIP12的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示。该麻疯树核糖体失活蛋白JcRIP12由核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的编码基因编码。

本发明还提供了包含核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示的编码基因的重组载体，以及包含核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示的编码基因的宿主。

进一步地，所述重组载体是将核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示的编码基因插入到原核表达载体中形成的，例如，所述的原核表达载体可以是pET-30a原核表达载体，也可以是其他原核表达载体。所述的宿主为大肠杆菌表达菌株。

当然，在核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1的编码基因的基础上，为了实现通过其他表达系统获得麻疯树核糖体失活蛋白JcRIP12，也可以在不改变基因编码氨基酸序列的前提下，依据其他表达系统的密码子偏好性对核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1的编码基因的密码子进行优化，构建得到适用于相应的表达系统的编码基因，之后以适用于相应表达系统的编码基因构建重组载体和宿主，即可用于表达麻疯树核糖体失活蛋白JcRIP12。

本发明还提供了一种制备上述麻疯树核糖体失活蛋白JcRIP12的方法，该方法是在适合上述宿主产生麻疯树核糖体失活蛋白JcRIP12多的条件下培养该宿主，然后分离纯化所述宿主产生的麻疯树核糖体失活蛋白JcRIP12。

本发明通过体外抗肿瘤活性实验证实，麻疯树核糖体失活蛋白JcRIP12对人非小细胞肺癌细胞(A549)、人骨肉瘤细胞(U2OS)、人肝癌细胞(HepG2)以及人胃癌细胞(SGC-7901)的增殖均具有较高水平的抑制作用，而对正常细胞系人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的增殖抑制作用较弱。特别是，麻疯树核糖体失活蛋白JcRIP12对人非小细胞肺癌细胞(A549)的增殖抑制作用显著优于现有的Curcin和Curcin C；同时，麻疯树核糖体失活蛋白JcRIP12对人肝癌细胞(HepG2)的增殖抑制作用显著优于Curcin。麻疯树核糖体失活蛋白JcRIP12对正常细胞的毒性小于Curcin和Curcin C。由此说明本发明提供的麻疯树核糖体失活蛋白JcRIP12可作为抗肿瘤药物开发的潜在活性物质，在制备治疗肿瘤的药物中应用。

进一步地，麻疯树核糖体失活蛋白JcRIP12在制备治疗肿瘤的药物中应用时，所述的肿瘤为人非小细胞肺癌、人骨肉瘤、人肝癌或者人胃癌，进一步优选为非小细胞肺癌或人肝癌。

与现有技术相比，本发明提供的技术方案产生了以下有益的技术效果：

1.本发明提供了麻疯树核糖体失活蛋白JcRIP12及其编码基因，以及所述麻疯树核糖体失活蛋白JcRIP12在制备治疗肿瘤的药物中的应用，丰富了具有抗肿瘤活性的麻疯树核糖体失活蛋白的种类，可为抗肿瘤药物的研发提供支持。

2.在麻疯树核糖体失活蛋白JcRIP12编码基因的基础之上，本发明通过对其密码子进行优化，并将优化后的基因片段插入到原核表达载体中，之后转入大肠杆菌表达菌株中进行原核表达，再经过纯化，实现了麻疯树核糖体失活蛋白JcRIP12的制备。也就是本发明通过原核表达实现了麻疯树核糖体失活蛋白JcRIP12的高效生产，为麻疯树核糖体失活蛋白JcRIP12的工业生产提供了途径，同时，本发明通过抗肿瘤活性实验证实，麻疯树核糖体失活蛋白JcRIP12具有与现有的Curcin和Curcin C相当或者更好的抗肿瘤活性。本发明解决了现有技术从麻疯树中分离纯化麻疯树核糖体失活蛋白存在的分离纯化过程繁琐、工艺复杂、生产效率低下和生产成本较高的问题。

3.本发明通过体外抗肿瘤活性实验证实：麻疯树核糖体失活蛋白JcRIP12对人非小细胞肺癌细胞(A549)、人骨肉瘤细胞(U2OS)、人肝癌细胞(HepG2)以及人胃癌细胞(SGC-7901)的增殖均具有较高水平的抑制作用。特别地，麻疯树核糖体失活蛋白JcRIP12对人非小细胞肺癌细胞(A549)的增殖抑制作用显著优于从麻疯树中分离纯化得到的Curcin和Curcin C；同时，麻疯树核糖体失活蛋白JcRIP12对人肝癌细胞(HepG2)的增殖抑制作用也显著优于Curcin。麻疯树核糖体失活蛋白JcRIP12对正常细胞的毒性小于Curcin和CurcinC。由此说明本发明提供的麻疯树核糖体失活蛋白JcRIP12可在制备治疗肿瘤的药物中应用。

附图说明

图1是JcRIP12基因的PCR验证图，箭头所指为JcRIP12基因所在位置。

图2是JcRIP12基因序列密码子优化前后对照图。

图3是质粒双酶切验结果。

图4是JcRIP12蛋白的小量表达结果，箭头所指为JcRIP12蛋白所在位置。

图5是利用SDS-PAGE分析JcRIP12蛋白纯化的结果。

图6是JcRIP12蛋白的SDS-PAGE检测结果。

图7是JcRIP12蛋白的Western Blot检测结果。

图8是JcRIP12蛋白、Curcin和Curcin C的紫外吸收光谱。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明所述麻疯树核糖体失活蛋白JcRIP12及其编码基因与应用作进一步说明。以下所描述实施例仅仅是本发明的一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明的发明内容和实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的其他实施方式，都属于本发明所保护的范围。

以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照J.萨姆布鲁克等著的《分子克隆实验指南》(第三版)中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

以下各实施例中，Curcin是指Lin Juan等公开的麻疯树核糖体失活蛋白(见Antitumor effects ofcurcin from seeds ofJatropha curcas,Acta PharmacologicaSinica,2003,24(3),241-246)，下述各实施例中的Curcin按照CN 101891798 B中公开的方法制备。Curcin C是指按照CN107058261B中公开的方法制备的麻疯树核糖体失活蛋白。

以下实施例主要以通过大肠杆菌原核表达的方式获得麻疯树核糖体失活蛋白JcRIP12为例，给出了麻疯树核糖体失活蛋白JcRIP12的制备方法。当然也可以通过其他表达系统来表达获得麻疯树核糖体失活蛋白JcRIP12。通过大肠杆菌原核表达的方式获得麻疯树核糖体失活蛋白JcRIP12时，首先通过生物信息学同源比对等技术，从麻疯树基因组JatCur_1.0中鉴定得到了JcRIP12基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，并通过克隆验证了JcRIP12基因的存在。然后，依据大肠杆菌密码子偏好性对JcRIP12基因的密码子进行优化，之后将优化后的基因插入到原核表达载体中，并转化到大肠杆菌表达菌株中，再诱导表达，成功实现了麻疯树核糖体失活蛋白JcRIP12的表达，并通过纯化和复性在全菌中获得了麻疯树核糖体失活蛋白JcRIP12。

当然，在JcRIP12基因的基础上，为了实现通过其他表达系统获得麻疯树核糖体失活蛋白JcRIP12，也可以在不改变基因编码氨基酸序列的前提下，依据其他表达系统的密码子偏好性对JcRIP12基因的密码子进行优化，构建得到适用于相应的表达系统的编码基因，之后以适用于相应表达系统的编码基因构建重组载体和宿主，即可用于表达麻疯树核糖体失活蛋白JcRIP12。在JcRIP12基因可得到本发明保护的基础上，这样的实施方式也属于本发明所保护的范围。

实施例1：麻疯树核糖体失活蛋白JcRIP12编码基因(JcRIP12基因)的获取

利用NCBI平台获取到的麻疯树基因组JatCur_1.0数据，通过生物信息学同源比对等技术，从麻疯树基因组JatCur_1.0中鉴定得到12个JcRIP成员，JcRIP12为其中的一个家族成员。并通过设计如下表1所示的引物，以麻疯树cDNA为模版通过PCR技术验证了JcRIP12基因的存在，JcRIP12基因的PCR验证图如图1所示，JcRIP12基因的核苷酸序列如序列表的SEQ ID NO.1所示。

表1

实施例2：基因的合成与载体的构建

1.目的基因片段的人工修饰

(1)成熟蛋白序列的预测

原核表达系统不能对蛋白进行修饰，需要人工切除信号肽。采用信号肽在线预测软件Signal P对Curcin和Curcin C的信号肽进行预测，结果显示二者的信号肽为1～28个氨基酸序列。但是，我们前期经天然提取纯化得到的Curcin和Curcin C的成熟蛋白序列N端测序结果显示，这两种蛋白的N端均存在42个氨基酸序列的缺失。这与Signal P预测的结果存在一定的偏差。有研究表明蛋白在成熟蛋白序列前端除了信号肽的剪切位点外还存在一段成熟的剪切位点(参见Hajar,Owji,Navid,et al.Acomprehensive review ofsignalpeptides:Structure,roles,and applications[J].European Journal ofCell Biology,2018,97(6):422-441.)。因此，我们推测Curcin和Curcin C在翻译过程中可能存在二次剪切。由于本申请所涉及的蛋白与Curcin和Curcin C均隶属同一基因家族，因此在预测其成熟蛋白序列时，以成熟的Curcin和Curcin C蛋白序列为模版，采用一级结构序列比对，并用三级结构验证比对结果，最终确定了成熟蛋白序列。最终预测得到的成熟蛋白序列存在38个氨基酸的缺失。此方法可保留天然蛋白的特点，排除过多的干扰因素，还原天然蛋白结构，为后续抗肿瘤活性的研究提供理论依据。

(2)密码子的偏好分析及其优化

运用在线网站(http://www.detaibio.com/tools/codon-usage-calculator.html)对JcRIP12基因的密码子使用频率进行分析。确定其确实存在大量影响表达的稀有密码子后，参照大肠杆菌密码子偏好性，在不改变基因编码氨基酸序列的前提下，运用在线网站(https://www.genscript.com)进行密码子优化。最后使用在线工具EMboss(http://www.bioinformatics.nl/emboss-explorer/)来计算密码子适应指数(Codon adaptation index,CAI)。Escherichia coli密码子使用频率列表来自kazusa数据库。经密码子优化后，密码子适应指数由优化前的0.649提高至0.79，密码子优化前后的对照情况如图2所示。

为确保原核表达效率，避免在基因克隆过程出现基因突变，本发明采用基因合成的方式获取密码子优化后的基因片段。在分析后得到的成熟序列的N端和C端增设酶切位点NdeI、HindIII，确认无误后委托上海生工合成，得到具有Amp抗性的重组质粒pET30a-JcRIP12a。最终得到的密码子优化的麻疯树核糖体失活蛋白JcRIP12编码基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

3.(1)重组质粒的提取

取含有重组质粒pET30a-JcRIP12a的菌液2～5mL，提取质粒，具体步骤参照TIANGEN质粒小提试剂盒说明书进行操作。提取后的质粒溶液置于-20℃保存。

(2)质粒的酶切验证

对提取后的质粒采用双酶切验证和测序验证确定其准确性。酶切时应避免所选酶切位点存在于目的基因片段中。质粒双酶切验结果如图3所示，所得质粒均在酶切下得到目的条带，且结合测序结果显示重组载体构建成功。

(3)转化BL21(DE3)感受态

将经酶切和测序验证确认无误后的重组质粒pET30a-JcRIP12a，用热激法(参见张迹,李智,张宇,等.一步法制备大肠杆菌BL21(DE3)菌株感受态细胞及转化条件优化[J].江苏农业科学,2016,44(12):529-532.)将重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。

实施例3：麻疯树核糖体失活蛋白JcRIP12(JcRIP12蛋白)在大肠杆菌中的表达与纯化

1.JcRIP12蛋白的诱导表达

(1)挑取PCR验证后含正确基因片段的单菌落至5mL新鲜的LB液体培养基中，在37℃恒温摇床上，以180rpm的转速过夜摇，即获得种子菌。

(2)将种子菌按照1:100的体积比转接到20mL新鲜的、含50ug/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃恒温摇床上，以180rpm的转速摇动培养。待菌液的OD

小量表达结果显示JcRIP12蛋白在15℃时表达量较高，因此我们将诱导条件设置为：IPTG终浓度0.2mM，15℃诱导16h，由于JcRIP12蛋白在小量表达中表达量过少，所以本实施例拟采用从全菌中获取蛋白。

2.JcRIP12蛋白的纯化

将前一步骤得到的全菌采用50mM Tris(pH8.0)，300mM NaCl，8M Urea，含1mM DTT的20mM Imidazole缓冲液超声裂解，同时以50mM Tris(pH8.0)，300mM NaCl，8M Urea，20mMImidazole缓冲液平衡Ni-IDA亲和层析柱，之后用不同浓度的Imidazole平衡缓冲液洗脱目标蛋白，并收集每个洗脱组分进行SDS-PAGE分析检测。采用SDS-PAGE分析JcRIP12蛋白纯化的结果如图5所示。

经Ni-IDA亲和层析柱纯化分析，收集纯度相对较高的Lane 5的蛋白(Lane 3～7均使用500mM的Imidazole平衡缓冲液洗脱)，将其加入到处理后的透析袋中，在4℃环境下，透析到缓冲液[1×PBS(pH7.4)，4mM GSH，0.4mM GSSG，0.4M L-Arginine，1M Urea]中复性，复性后JcRIP12蛋白最终透析于储存液[1×PBS(pH7.4)，5％Glycerol溶液]约6～8h。透析复性结束后，将所得上清用孔径为0.22μm的滤器过滤后分装，并将其冻存至-80℃。

实施例4：JcRIP12蛋白的性能检测

1.蛋白稳定性测试(冻融实验)

取一支冻于-80℃的JcRIP12蛋白，在冰水浴中放置5～10min待其缓慢融化，融化后在4℃冰箱内放置0.5h。无异常现象，说明JcRIP12蛋白的冻融实验是正常的。

2.蛋白浓度检测

采用Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定JcRIP12蛋白的浓度，最终测得JcRIP12蛋白的浓度为0.3mg/mL。

3.蛋白的SDS-PAGE检测

取JcRIP12蛋白样品若干，加入SDS-PAGE上样缓冲液(碧云天，SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X,无气味)产品编号：P0286-15 ml)于100℃下加热样品7min，然后离心取上清进行电泳。在120V稳压电泳至溴酚蓝带迁移至离凝胶底部1cm，取出凝胶，利用蛋白凝胶快速处理系统染脱色。再用Bio-Rad凝胶成像仪检测，结果如图6所示。

4.蛋白的Western Blot检测

取JcRIP12蛋白样品若干，样品经处理后经凝胶电泳后分离蛋白，再转移到PVDF膜上，在100V稳定电压1h，条带转移后的PVDF膜用脱脂奶粉封闭2h后，加入0.1％抗体的一抗孵育液孵育2h，随后用1:5000的体积比稀释的二抗孵育1h后采用ECL化学发光法显影，结果如图7所示。

5.蛋白的紫外吸收光谱

取200μL JcRIP12蛋白溶液于石英96孔板中，于连续波长酶标仪中测定其紫外吸光值，扫描范围为200～500nm，步长为1nm。同时以Curcin、Curcin C为对照进行相同的测试。结果如图8所示。

紫外吸收光谱法是研究蛋白质分子构象的常规方法，能够获得蛋白质分子的某些信息(参见：张树政.酶学研究技术[M].科学出版社,1987:45-61.)。如图8所示，Curcin、Curcin C以及JcRIP12蛋白均在b处存在一个最大吸收峰，这主要是由肽键贡献。c处存在一个最小的吸收峰，d处又存在一个吸收峰，主要由苯丙氨酸和色氨酸残基的电子跃迁贡献。在接近200nm的a处存在一段相当大但不成峰的曲线片段。JcRIP2蛋白与从麻疯树中分离纯化得到的Curcin和Curcin C相对照而言，紫外吸收曲线整体的波动趋势相同，但存在吸收峰下移的情况。

6.蛋白的相对分子量和等电点测定

将JcRIP12蛋白送至上海生工生物工程有限公司进行分子量鉴定和测序，采用毛细血管法进行等电点测定，结果显示JcRIP12蛋白的相对分子质量为30588.4Da，等电点为9.89，由274个氨基酸序列组成，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示。

表2

实施例5：抗肿瘤活性探究

本实施例中，测试JcRIP12蛋白的抗肿瘤活性，将JcRIP12蛋白、Curcin和Curcin C分别作用于人非小细胞肺癌细胞(A549)、人骨肉瘤细胞(U2OS)、人肝癌细胞(HepG2)和人胃癌细胞(SGC-7901)这4个肿瘤细胞系，以及1个正常细胞系人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。以Curcin、Curcin C作为对照组，评价其抗肿瘤活性。具体如下：

选取对数生长期的A549、U2OS、HepG2、SGC-7901和HUVEC，用0.25％的胰酶消化单层A549、U2OS、HepG2、SGC-7901和HUVEC，用对应的培养基将其配置成细胞悬浮液。具体地，HepG2细胞系的培养基为：DMEM(High Glucose)；U2OS细胞系的培养基为：McCoy's5A Media(Modifiedwith TRicine)；A549、SGC-7901、HUVEC细胞系的培养基为：RPMI-1640；所有培养基均添加10％FBS和1％Penicillin-Streptomycin-Gentamicin。

按6×10

以不添加蛋白的培养基作为空白组。

按照下述公式计算细胞的增殖抑制率，用Graphpad软件进行统计学分析并计算半数抑制浓度IC

式中，X给药组，X空白组，X对照组分别代表给药组、空白组和对照组在450nm处的吸光值。

表3

由表3可知，JcRIP12蛋白在体外对肿瘤细胞A549、U2OS、HepG2和SGC-7901的增殖抑制效果较好，且对正常细胞HUVEC的增殖抑制作用较弱。JcRIP12蛋白对肿瘤细胞A549、HepG2的毒性均明显强于Curcin，JcRIP12蛋白对肿瘤细胞对A549的毒性明显强于CurcinC，JcRIP12蛋白对肿瘤细胞U2OS和SGC-7901的抗肿瘤活性也在一个较高水平。对正常细胞的毒性小于Curcin和Curcin C，具有抗肿瘤的广谱性，是抗肿瘤药物开发的潜在活性物质，可在制备治疗肿瘤的药物中应用。

序列表

<110> 四川大学

<120> 麻疯树核糖体失活蛋白JcRIP12及其编码基因和应用

<130> 2022.5.11

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 918

<212> DNA

<213> 麻疯树(Jatropha curcas L.)

<400> 1

atggaaggaa atatgaaggt ctggcttgta gtggcaacat ggttatgctg gactattata 60

tttggattgg ctagggttat taacccatct gcaattcata actacacagc cgatgcaatt 120

ccctctgtaa gctttaccat tactcgtatc cccggtgatg ataagactga ctacaagcag 180

cttatggtag atcttcgaaa aaaattgtct tctggcacta ctagcaatgg agtaccagtg 240

ttacgctcca cagcttcaaa agaagccaaa tatcttttag tcaatataat aaattcaggg 300

aagaaggaaa tcacgttagg attaaatgtt attaatgcat atgttttggc ttataaagtg 360

ggagataaat cttatttctt taacgatccg actgaattga aggatgcaca aactcatctt 420

ttcaaagaca caaagcaaac cgccataaaa attacaggta gctacgactc tctcaaagct 480

caaggaggag atcgagaatc agtagattta ggaatcgggc aattagactc tcacatctat 540

acactccata aatcgacagc gttaaaagac gttgctaagt ctcttgtttg tattattcag 600

atggtttcag aagcagcccg atttaagtct attgagaata agatagtaga taagattgat 660

ggaagtttta aaccgaagct tgatataatc actcgtgaga acaactgggg tgacctttct 720

gaaggaattc aaaacgctga taagaaggga aattttaaaa caaaagttag attgcagaag 780

gaagatggta aggaggatat tatatctaac gttaatcaaa taataggaga gatgggaatt 840

ttgctgtata agaagaagaa gatctacaat attccaagtt ttggacaaac aaattttgga 900

aaccttatcc agaactaa 918

<210> 2

<211> 837

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 2

catatgcatc atcatcatca tcacgcgatt ccgagcgtta gctttaccat tacccgtatt 60

ccgggcgacg ataaaaccga ctacaagcag ctgatggtcg atctgcgtaa aaaactgagc 120

agcggtacca ccagtaacgg cgttccggtt ctgcgtagta ccgcgagcaa agaagcgaaa 180

tacctgctgg tcaacatcat caacagcggc aagaaagaaa ttaccctggg tctgaacgtc 240

atcaacgcgt acgttctggc gtataaagtt ggcgataaga gctacttctt caacgacccg 300

accgaactga aagacgcaca gacccacctg tttaaggaca ccaaacagac cgcgatcaaa 360

atcaccggta gctacgatag cctgaaagca caaggtggcg atcgcgaaag cgtggatctg 420

ggtattggcc aactggatag ccatatctat accctgcata aaagcaccgc gctgaaagac 480

gttgcaaaga gcctggtctg catcattcag atggtctctg aagcggcgcg ctttaaaagc 540

atcgaaaaca agatcgtcga caagattgac ggcagcttca agccgaaact ggatatcatc 600

acccgcgaaa acaactgggg cgatctgtct gaaggtattc agaacgcgga caagaagggc 660

aacttcaaga ccaaagtccg cctgcagaaa gaagacggca aagaggacat catcagcaac 720

gtcaaccaga tcatcggcga aatgggtatc ctgctgtaca agaagaagaa gatctacaac 780

atcccgagct ttggccagac caactttggt aacctgattc agaactaatg aaagctt 837

<210> 3

<211> 274

<212> PRT

<213> 人工合成()

<400> 3

Met His His His His His His Ala Ile Pro Ser Val Ser Phe Thr Ile

1 5 10 15

Thr Arg Ile Pro Gly Asp Asp Lys Thr Asp Tyr Lys Gln Leu Met Val

20 25 30

Asp Leu Arg Lys Lys Leu Ser Ser Gly Thr Thr Ser Asn Gly Val Pro

35 40 45

Val Leu Arg Ser Thr Ala Ser Lys Glu Ala Lys Tyr Leu Leu Val Asn

50 55 60

Ile Ile Asn Ser Gly Lys Lys Glu Ile Thr Leu Gly Leu Asn Val Ile

65 70 75 80

Asn Ala Tyr Val Leu Ala Tyr Lys Val Gly Asp Lys Ser Tyr Phe Phe

85 90 95

Asn Asp Pro Thr Glu Leu Lys Asp Ala Gln Thr His Leu Phe Lys Asp

100 105 110

Thr Lys Gln Thr Ala Ile Lys Ile Thr Gly Ser Tyr Asp Ser Leu Lys

115 120 125

Ala Gln Gly Gly Asp Arg Glu Ser Val Asp Leu Gly Ile Gly Gln Leu

130 135 140

Asp Ser His Ile Tyr Thr Leu His Lys Ser Thr Ala Leu Lys Asp Val

145 150 155 160

Ala Lys Ser Leu Val Cys Ile Ile Gln Met Val Ser Glu Ala Ala Arg

165 170 175

Phe Lys Ser Ile Glu Asn Lys Ile Val Asp Lys Ile Asp Gly Ser Phe

180 185 190

Lys Pro Lys Leu Asp Ile Ile Thr Arg Glu Asn Asn Trp Gly Asp Leu

195 200 205

Ser Glu Gly Ile Gln Asn Ala Asp Lys Lys Gly Asn Phe Lys Thr Lys

210 215 220

Val Arg Leu Gln Lys Glu Asp Gly Lys Glu Asp Ile Ile Ser Asn Val

225 230 235 240

Asn Gln Ile Ile Gly Glu Met Gly Ile Leu Leu Tyr Lys Lys Lys Lys

245 250 255

Ile Tyr Asn Ile Pro Ser Phe Gly Gln Thr Asn Phe Gly Asn Leu Ile

260 265 270

Gln Asn