调控水稻耐铝性的基因OsAlR1及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，更具体地，涉及调控水稻耐铝性的基因OsAlR1及其应用。

背景技术

可溶性铝离子的普遍存在是全球酸性土壤作物生产的主要限制因素。在pH值正常的土壤中，铝通常会被不溶性化合物如硅酸盐、硫化物和二氧化硅等固定，对植物没有毒性。但在pH≤5.5的酸性土壤中，铝以游离铝离子的形式被植物根系吸收，对植物产生毒害作用，其中三价Al

近年来，由于过量施用氮肥、施肥结构不合理、工业污染造成的酸雨和降水量大灌排不畅等造成的土壤酸化现象普遍发生，已成为制约农业种植发展的一大难题。铝作用于植物的根尖，其中对根冠和分生区毒害作用最大，可溶性的Al

耐铝毒水稻品种的培育是解决土壤酸化带来的铝毒害问题的有效途径。因此发掘和鉴定水稻铝抗性相关候选基因，阐明其在铝毒胁迫下的生理和分子机制，为培育耐铝水稻品种提供基因资源尤为重要。

尽管目前已定位、克隆了几个耐铝相关的基因，但由于耐铝机制的复杂性，定位和克隆的基因还远远不能揭示水稻耐铝的分子机制，限制了这些基因在耐铝育种中的应用。因此亟需在广泛的水稻种质资源中挖掘耐铝基因资源，鉴定和克隆更多新的耐铝基因，为进一步探索水稻铝胁迫响应的分子机制和培育耐铝水稻品种奠定基础。

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种调控水稻耐铝性的基因OsAlR1及其在水稻耐铝育种中的应用，通过定位和克隆水稻中OsAlR1基因，获得了其核苷酸序列和蛋白质的氨基酸序列。

本发明提供了一种调控水稻耐铝性的基因OsAlR1，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

优选的，所述基因正调控提高水稻的耐铝性能。

优选的，所述基因以纯合形式存在于水稻基因组中以提高植株的耐铝毒能力。

本发明中所述OsAlR1基因序列通过如下方法获得：

从培育的水稻植株的叶片中提取DNA,用PCR引物即OsAlR1pF1引物和OsAlR1pR1引物，进行PCR扩增，经测序，获得OsAlR1基因核苷酸序列。

由OsAlR1基因编码的蛋白质包含有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

其中，所述OsAlR1pF1引物序列为如SEQ ID NO：3所示，具体为：5’-CCGATCCATCAGCAACCAAG-3’；

所述OsAlR1pR1引物序列为如SEQ ID NO：4所示，具体为：5’-GGTACCCATCTCGTCTTCCT-3’。

具体PCR反应体系采用50μL体系：DNA模板2μL，OsAlR1pF1引物(10μmol/L)2μL，OsAlR1pR1引物(10μmol/L)2μL，Taq Mix25μL，加ddH

PCR扩增程序如下：94℃预变形5min、94℃变性30s、54℃～60℃退火30s、72℃延伸1min，30～35个循环、72℃延伸10min。

水稻植株的具体培育方法为：打破休眠并经过消毒发芽的水稻种子，在28℃、14小时光照，10小时黑暗的条件下蒸馏水正常培养11d，第12d用含500μM CaCl

本发明还提供了含有上述基因的重组载体、含有上述基因的质粒，以及含有上述基因或载体的工程菌或宿主细胞。所述工程菌和宿主细胞可理解为本领域技术人员在转基因过程中所使用的的工程菌或宿主细胞。在优选的技术方案中，所述宿主细胞是含有所述基因的靶标序列的大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或植物细胞。随着科技发展，所述工程菌和宿主细胞的选择也许会发生变化，或非转基因目的的应用领域，也同样涉及载体和工程菌的利用，但只要含有本发明所述基因或本发明所述的载体，均在本发明的保护范围内。

本发明还提供了上述基因的应用，所述应用包括以下中的一种或多种：

1)用于水稻的耐铝育种；

2)通过使水稻中上述OsAlR1基因过表达，提高水稻耐铝能力；

3)降低水稻根系中的铝含量。

所述耐铝育种具体为培育抗铝胁迫或培育具有铝耐受性的水稻品种。

进一步地，本发明提供了利用荧光定量RT-PCR检测OsAlR1基因表达量的方法，包括以下步骤：

将水稻在28℃、14小时光照，10小时黑暗的条件下正常生长11d，第12d用含500μMCaCl

其中，所述OsAlR1F引物序列为如SEQ ID NO：5所示，具体为：5’-TCGTAGTGGACATGAGCGC-3’；

所述OsAlR1R引物序列为如SEQ ID NO：6所示，具体为：5’-TAGATGGTATCAAGGGCGGG-3’。

具体RT-PCR反应体系如下：2×SYBR GreenPro Taq HS Premix10μL；cDNA 4μL；Primer F(10μM)0.8μL；Primer R(10μM)0.8μL；ROX Reference Dye(20μM)0.4μL；RNasefree water to 20μL。

表达量计算方法采用△CT＝AVERAGE(样本CT值)-AVERAGE(内参CT值)算法，即：样本CT值的平均数-内参CT值的平均。

本发明还公开了包含引物OsAlR1F、OsAlR1R的试剂或试剂盒。本领域技术人员可借助常规技术手段获得包含上述引物的试剂或试剂盒。

本发明公开了一种培育耐铝性水稻的方法，具体为将含有所述OsAlR1基因导入水稻中，并使所述基因在水稻或水稻细胞中过表达，从而获得耐铝性增强的转基因水稻。

本发明还提供了一种在耐铝水稻WT-C20背景下敲除所述基因构建的水稻突变体KO-233，该水稻突变体不具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的基因；所述水稻突变体显著降低了水稻对铝毒的耐受性，是研究OsAlR1调控水稻耐铝机制的重要资源。

其中，水稻突变体的具体制备方法为：

(1)在OsAlR1基因的外显子区域设计一对gRNA引物，连接至载体质粒中；

(2)将质粒转化至农杆菌中，挑取农杆菌单克隆菌落，制备浸染液；

(3)将水稻愈伤组织于浸染液中浸染，浸染后的愈伤组织培养分化成苗得到水稻突变体。

其中，步骤(1)中，所述gRNA引物，其正向引物核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，具体为：ggcagcgttgcggtgcgtctgtgg；

反向引物核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，具体为：aaacccacagacgcaccgcaacgc。

步骤(1)中，连接至载体质粒的连接体系包含：2μL酶切后的pRGEB32，2.5μL的gRNA，1μL的10×T4 Buffer，0.5μL的T4 Ligase，并使用ddH

步骤(2)中，质粒为经测序正确的质粒，农杆菌为农杆菌EHA105，浸染液的制备方法为挑取单克隆于5mL含卡纳霉素和利福平抗性YEB培养液中，在28℃条件下200rpm震荡培养24-36h，之后于4000rpm离心5min，加入含200μM乙酰丁香酮的AAM感菌液制成浸染液。

步骤(3)中所述浸染包括以下步骤：将水稻愈伤组织放入浸染液侵染5-10min，然后将愈伤组织取出，无菌滤纸上沥干30-40min，置于共培养培养基上，25℃黑暗条件下培养3天，将愈伤组织取出，分别放到含头孢霉素和潮霉素的选择培养基上进行3轮筛选得到浸染后的愈伤组织。

上述gRNA引物还可以用于水稻OsAlR1基因编辑的引物在基因敲除、外援基因编辑插入中的应用，其正向引物核苷酸序列如SEQ IDNo.7所示，反向引物核苷酸序列如SEQ IDNo.8所示。

本发明进一步提供了一种耐铝性的检测方法，具体包括如下步骤：

(1)取籽粒饱满、粒型均匀的耐铝材料WT-C20和水稻敲除突变体KO-233(该突变体即不具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的基因)种子，放置在温度55℃烘箱中打破休眠5d；用1％H

(2)将种子放于培养皿中加入蒸馏水于30℃恒温箱中避光浸种24h，待种子长出1-2毫米幼芽时催芽，芽长约1cm时将种子转移至96孔植物水培盒中蒸馏水培养7d，期间每两天换一次蒸馏水，第八天更换为1/2浓度的Yoshida营养液培养至第十一天，每两天更换一次营养液；处理组第十二天用500μM CaCl

(3)取长势一致、健康茁壮的耐铝材料和突变体幼苗鲜样，剪取根系平铺于根系扫描仪中，各须根之间不交叠，根系扫描仪测量幼苗总根长；

(4)分别取0.2g耐铝材料和突变体的根系和/或叶片，加入聚四氟乙烯消解罐中，加入5mL浓硝酸，2mL过氧化氢，微波消解，待溶液澄清后，定容至50mL，过滤，检测铝离子含量。

本发明首次在水稻中定位和克隆了可调控水稻耐铝性的基因OsAlR1，提供了该基因的核苷酸序列、蛋白质的氨基酸序列；结合CRISPR-Cas9基因编辑方法敲除OsAlR1基因，构建敲除OsAlR1基因的突变体KO-233，与耐铝材料WT-C20相比，突变体KO-233的根长显著小于WT-C20，且突变体KO-233根系中铝含量显著高于WT-C20，可见，本发明提供的水稻OsAlR1基因在调控水稻耐铝性功能明确，为解决酸性土壤中铝毒害和使农业可持续发展提供了有效策略，为培育耐铝毒水稻品种提供了重要的基因资源。

附图说明

图1是OsAlR1基因的结构示意图。

图2是本发明中耐铝材料WT-C20和铝敏感材料WT-C21在100μMAlCl

图3是本发明中野生型WT-C20和OsAlR1基因敲除突变体KO-233在100μMAlCl

图4是本发明中野生型WT-C20和OsAlR1基因敲除突变体KO-233在100μMAlCl

图5是本发明中野生型WT-C20和OsAlR1基因敲除突变体KO-233在100μMAlCl

具体实施方式

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。实施例中所用到的试剂均由市售。

本实施例中，以模拟作物水稻为研究对象

1)OsAlR1基因在不同铝耐受性水稻中的基因表达量

水稻幼苗在铝胁迫下进行培育，结合根长、株高、根系铝离子含量等参数选取出两份极端材料分别是铝敏感材料WT-C21和耐铝材料WT-C20；

将WT-C21和WT-C20的种子分别在28℃、14小时光照，10小时黑暗的条件下蒸馏水正常培养11d，处理组第12d用含500μMCaCl2(pH＝4)的Yoshida营养液预处理24h，第13d用含100μMAlCl3(500μMCaCl2(pH＝4))的Yoshida营养液处理48h；对照组则在12d至14d继续正常培育；

分别提取WT-C21和WT-C20根系RNA，利用艾科瑞公司SteadyPure植物RNA提取试剂盒(AG21019)提取RNA，用艾科瑞公司Evo-M-MLV反转录试剂预混液试剂盒(AG11706)将RNA反转录为cDNA。以cDNA为模板，用OsAlR1F引物(5’-TCGTAGTGGACATGAGCGC-3’)和OsAlR1R引物(5’-TAGATGGTATCAAGGGCGGG-3’)，采用艾科瑞公司SYBR Green Pro Taq HS qPCR试剂盒(AG11701)检测OsAlR1基因表达量，结果如图2和下表1所示。铝胁迫后OsAlR1在耐铝材料WT-C20中的表达量显著升高，在铝敏感材料WT-C21中的表达量则下降。

具体RT-PCR反应体系如下：2×SYBR GreenPro Taq HS Premix10μL；cDNA 4μL；Primer F(10μM)0.8μL；Primer R(10μM)0.8μL；ROX Reference Dye(20μM)0.4μL；RNasefree water to 20μL。

表1WT-C20和WT-C21中OsAlR1基因相对表达量

注：其中CK为对照样，Al为上述方法中用含100μM AlCl3处理的样本，WT-C20为耐铝材料，WT-C21为铝敏感材料。

2)CRISPR-Cas9基因编辑方法敲除OsAlR1基因

CRISPR-Cas9敲除载体的构建：

在OsAlR1基因的外显子区域设计一对gRNA引物，OsAlR1pF2引物(ggcagcgttgcggtgcgtctgtgg)和OsAlR1pR2引物(aaacccacagacgcaccgcaacgc)连接至pRGEB32质粒中，得到CRISPR-Cas9敲除载体。连接体系如下：酶切后的pRGEB32 2μL，gRNA2.5μL，10×T4 Buffer 1μL，T4 Ligase 0.5μL，ddH2O补足10μL。连接体系16℃反应4h。

将CRISPR-Cas9敲除载体导入水稻植株：

测序正确的质粒转化至农杆菌EHA105中，挑取单克隆于5mL含卡纳霉素和利福平抗性YEB培养液中，28℃200rpm震荡培养24 36h；4000rpm离心5min；用含200μM乙酰丁香酮的AAM感菌液制成浸染液。将长大一定大小的水稻愈伤组织放入AAM浸染液侵染5 10min,然后将愈伤组织取出，无菌滤纸上沥干30 40min,后，置于共培养培养基上，25℃暗培养3天。将愈伤组织取出，分别放到含头孢霉素和潮霉素的选择培养基上进行3轮筛选。挑取在选择培养基上存活较好颜色鲜黄的抗性愈伤移入分化培养基中，培养至分化成苗，得到OsAlR1基因敲除突变体，本发明中称之为KO-233。

3)水稻植株的培育

先根据上述步骤2)中获得OsAlR1基因敲除突变体KO-233的种子，选取耐铝材料WT-C20和OsAlR1基因敲除突变体KO-233正常发芽的水稻种子，同时在28℃、14小时光照，10小时黑暗的条件下蒸馏水正常培养11d，第12d用含500μMCaCl

4)测序

利用CTAB法分别提取步骤3)中培育得到的WT-C20和KO-233叶片中的DNA，用OsAlR1pF1引物(5’-CCGATCCATCAGCAACCAAG-3’)、和OsAlR1pR1引物(5’-GGTACCCATCTCGTCTTCCT-3’)，进行PCR扩增。

其中，PCR反应体系采用50μL体系：DNA模板2μL，正反向引物(10μmol/L)各2μL，TaqMix25μL，加ddH2O补足50μL。

PCR扩增程序如下：94℃预变形5min、94℃变性30s、54℃～60℃退火30s、72℃延伸1min，30～35个循环、72℃延伸10min。

经测序获得耐铝材料WT-C20中OsAlR1基因核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。同时选取OsAlR1敲除突变体KO-233中OsAlR1基因以纯合形式存在的突变体以进行后续的耐铝能力测定实验。

5)WT-C20和突变体KO-233耐铝能力测定

取籽粒饱满，粒型均匀的耐铝材料WT-C20及水稻敲除突变体KO-233各200粒，放置在温度55℃烘箱中打破休眠5d。用1％H2O2对种子表面进行消毒，于25℃摇床中震荡15-20min后，用蒸馏水冲洗表面3-4次直至表面无残留。将种子放于培养皿中加入蒸馏水于30℃恒温箱中避光浸种24h，待种子长出1-2毫米幼芽时催芽，芽长约1cm时将种子转移至96孔植物水培盒中蒸馏水培养7d，期间每两天换一次蒸馏水，第八天更换为1/2浓度的Yoshida营养液培养至第十一天，每两天更换一次营养液。处理组第十二天用500μM CaCl

以相对根伸长为指标评价根据上述方法获得的OsAlR1基因敲除突变体KO-233植株和耐铝材料WT-C20的耐铝毒能力。图3和下表2、表3展示了AlCl

表2铝处理对WT-C20和KO-233总根长的影响

表3铝处理对WT-C20和KO-233总表面积的影响

其中，CK为对照组，Al为处理组，WT-C20为耐铝材料，KO-233为基因敲除突变体。

结果表明，耐铝材料WT-C20在铝处理下的根长和根总表面积都显著高于OsAlR1基因敲除突变体KO-233。

6)WT-C20和突变体KO-233根系铝含量测定

分别取0.2g耐铝能力测定中培养的样品，每个样品分别进行如下操作：加入聚四氟乙烯消解罐中，加入5mL浓硝酸，2mL过氧化氢，微波消解，待溶液澄清后，定容至50mL，过滤，检测铝离子含量。图4展示了AlCl

表4WT-C20和KO-233根系中铝离子含量

7)耐铝材料WT-C20和OsAlR1基因敲除突变体KO-233细胞形态观察

采用石蜡切片法观察细胞形态，实验步骤参考王秀文等人的方法(王秀文，2015)：取处理好15d的水稻幼苗根系，用75％酒精消毒后的刀片切下，放入FAA固定液(福尔马林-醋酸-乙醇)中进行保存，以备后续切片试验。样本固定：用消毒后的刀片在距根尖2cm处切取2mm小段，放入FAA固定液中固定30min。样本脱水和透明：使用FAA固定液固定后，用50％、75％、85％、95％的乙醇分梯度脱水，每个梯度脱水10min，最后在无水乙醇中脱水2次。然后转入二甲苯和无水乙醇混合液中(1:2、2:1、1:1)，分别透明10min，最后转入二甲苯中透明两次，每次5min。样本包埋切片：将透明后的样本放入融化的石蜡液中，约1h。待蜡块冷却后，用轮转式石蜡切片机进行连续切片，厚度约5μm，50℃烤干。番红固绿染色及封片：切片放入番红染色液中1-2h，然后用蒸馏水清洗，洗去多余染料。继而将切片放入50％、70％、80％梯度下的乙醇中进行脱水，每个步骤约5s。取出来的切片放入固绿染色液中约1min，取出后同上步骤，放入3个梯度下的乙醇进行脱水。完成后用中性树胶封片，在光学显微镜下进行拍照分析。具体结果如图5所示，结果表明突变体KO-233的皮质细胞长度在铝胁迫前与野生型WT-C20没有明显变化，铝胁迫后突变体的根系皮质细胞长度显著短于野生型。

8)耐铝基因OsAlR1在水稻耐铝育种中的应用

在生产实践中，本领域技术人员可将上述基因转化植物细胞，再将转化后的植物细胞培育成植株。通过转基因方法，利用植物表达载体转化植物细胞以培育耐铝性水稻，进而可以改善水稻的耐铝性。在生产实践中，本领域技术人员还可将上述基因通过分子标记辅助选择育种方法来增强水稻的耐铝性。如以铝敏感性水稻品种作为轮回亲本，耐铝强的品种作为耐铝基因OsAlR1的供体，通过分子标记辅助选择，进行水稻耐铝性改良。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。