一种山羊DRD1基因单核苷酸多态性的检测方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术与家畜育种领域，涉及山羊DRD1基因(登录号NC_030817.1)单个核苷酸的转换或颠换变异所引起的DNA序列发生多态性变化的位点在山羊胎产羔数分子标记辅助选择育种中的应用。

背景技术

传统的育种方法是利用种群遗传学和统计学相结合的方法来提高动物的生产性能，主要原理是将多个基因对表型的作用集中在一起，多个基因的平均效应最终形成了最佳的基因表型。在家畜育种工作中，繁殖性能占有十分重要的地位，是直接影响畜产品产量的重要性状。随着现代生物技术的发展，标记辅助选择(MAS)技术在育种中被广泛应用，从而可以通过直接在DNA水平上分析遗传变异以及检测各种基因在影响动物繁殖能力上的可能性，不仅显著提高了育种效率，而且筛选得到的繁殖性状能够稳定遗传，为改善繁殖性状提供了新的机会。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)是指在基因组水平上因单个核苷酸的插入、转换、颠换、缺失等变异所引起的DNA序列的多态性变化。SNPs是通过对其在几个群体中发生的基因组区域进行测序来确定和分析，它们大多位于较小内含子包围的外显子中，但也可能出现在非编码区。DNA测序是操作最简单、最快捷的SNPs检测方法，该方法先以目的基因的序列设计特异性引物，再进行PCR扩增，得到的扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行验证，然后将扩增产物进行DNA测序，从而获得扩增产物的碱基序列信息，再通过对比鉴定出SNPs位点的基因型。SNPs可以在DNA水平上直接反映生物个体之间的遗传变异，具有可标记数量多、研究条件不受环境和发育阶段的影响、多态性高、共显性等许多显著的优势，已经广泛应用于动物育种。

羊肉具有高蛋白、低脂、低胆固醇，以及富含钙、磷、铁等矿物质的优点，并且肉质鲜嫩美味。随着居民消费中对羊肉的需求不断增加，加之羊肉进口量下降明显，供需之间的矛盾日渐显著，使得提高羊肉产量迫在眉睫。通过提高山羊的产羔数可以提高羊肉的产量，以弥补羊肉生产与需求之间的不平衡，但应用传统育种方法提高产羔数的时间长、难度大，获得的优良性状难以稳定遗传。

多巴胺受体D1(dopamine receptor D1,DRD1)蛋白主要通过调节环磷酸腺苷(cAMP)的表达水平，从而进一步激活蛋白激酶A(PKA)，PKA通过磷酸化细胞质和细胞核因子来调控细胞代谢反应，使跨膜G蛋白偶联受体去敏感化，导致细胞神经递质释放，使得多巴胺发挥相应生理功能。研究发现，DRD1基因在猪的垂体、下丘脑、子宫、输卵管等组织表达，且推测其可能影响机体内生殖激素的分泌，从而影响繁殖性能。例如猪DRD1基因的外显子区域中筛查到多态性位点，且关联分析发现不同基因型与产仔数显著相关(“青海八眉猪DRD1基因多态性与其生长性状和产仔数的关联分析”.青海大学学报,2021,39(3):18-26.)。尽管DRD1基因的多态性对机体内分泌平衡的改变可能会导致繁殖性能随之发生改变，但对于山羊而言，其多羔性状较为复杂，需要发掘有效的分子标记位点以提高母羊平均产羔数。

发明内容

本发明的目的在于提供一种山羊DRD1基因单核苷酸多态性的检测方法及其应用，可以快速建立优良繁殖性状的山羊种群。

一种山羊DRD1基因单核苷酸多态性的检测方法，包括以下步骤：

以待测山羊基因组DNA为模板，通过PCR扩增位于DRD1基因参考序列NC_030817.1第95514212-95518301位的外显子片段，将扩增产物测序后根据测序结果鉴定待测山羊DRD1基因单核苷酸多态性位点的基因型，所述单核苷酸多态性位点包括g.712G＞T(NC_030817.1第95514924位)和g.1817T＞A(NC_030817.1第95515930位)。

上述山羊DRD1基因单核苷酸多态性的检测方法在山羊繁殖性状分子标记辅助选择育种中的应用。

山羊DRD1基因NC_030817.1第95514212-95518301位单核苷酸多态性位点在山羊繁殖性状分子标记辅助选择育种中的应用，所述单核苷酸多态性位点包括g.712G＞T(NC_030817.1第95514924位)和g.1817T＞A(NC_030817.1第95515930位)。

优选的，所述单核苷酸多态性位点还包括g.191C＞T(NC_030817.1第95514403位)、g.2490G＞A(NC_030817.1第95516702位)中的一个或两个。

优选的，所述单核苷酸多态性位点还包括g.1607C＞T(NC_030817.1第95515819位)。

优选的，所述单核苷酸多态性位点还包括g.282C＞T(NC_030817.1第95514494位)。

优选的，所述PCR采用的引物如下所示，该引物用于扩增上述g.191C＞T和g.282C＞T两个单核苷酸多态性位点所在山羊基因组DNA区域：

D1-F：5`-CTGTCGCCCGCAACTCTT-3`

D1-R：5`-AGGTCGTTTGCCGAAAGGAG-3`。

优选的，所述PCR采用的引物如下所示，该引物用于扩增上述g.712G＞T这个单核苷酸多态性位点所在山羊基因组DNA区域：

D2-F：5`-TGGGCTTGACAGTGAAGATGC-3`

D2-R：5`-ACCGACAAAGTCCATGCCAC-3`。

优选的，所述PCR采用的引物如下所示，该引物用于扩增上述g.1607C＞T和g.1817T＞A两个单核苷酸多态性位点所在山羊基因组DNA区域：

D3-F：5`-ACCGCATCCATCCTCAATCT-3`

D3-R：5`-GCTCGTGATGGCTGGAAAAC-3`。

优选的，所述PCR采用的引物如下所示，该引物用于扩增上述g.2490G＞A这个单核苷酸多态性位点所在山羊基因组DNA区域：

D4-F：5`-ATTCCTCCTTGAACCCCATC-3`

D4-R：5`-TGTGTGTTTGTTTCATTGGC-3`。

优选的，所述单核苷酸多态性位点的基因型可以作为提高山羊胎产羔数(具体指初产母羊平均产羔数)性状的DNA标记。

优选的，所述山羊为金堂黑山羊、川南黑山羊、简州大耳羊中的一种或多种。

本发明的有益效果体现在：

本发明根据山羊DRD1基因外显子序列(参考序列NC_030817.1第95514212-95518301位)设计引物，以山羊基因组DNA为模板，通过PCR扩增、电泳鉴定和测序，能够简单、快速精确地检测到与提高山羊胎产羔数相关的单核苷酸多态性位点(具体包括g.712G＞T和g.1817T＞A)，并通过基因型鉴定，确定个体携带相应分子标记的情况。

进一步的，本发明根据山羊DRD1基因(登录号NC_030817.1)外显子序列设计特异性引物，通过PCR扩增后，利用电泳验证扩增产物，所得电泳条带清晰、单一，有利于提高测序结果的准确性。

本发明依据对山羊DRD1基因单核苷酸多态性位点(SNPs位点)与山羊胎产羔数进行的关联分析，共发现了g.191C＞T、g.282C＞T、g.712G＞T、g.1607C＞T、g.1817T＞A、g.2490G＞A6个与提高山羊胎产羔数具有显著相关性的SNPs位点，从而可以通过对在山羊DRD1基因上发现的这些SNPs位点进行检测，快速建立优良繁殖性状的山羊(例如金堂黑山羊、川南黑山羊)遗传资源群体，从而有利于加快良种选育速度。

附图说明

图1为使用1％的琼脂糖凝胶电泳检测提取的不同个体部分基因组DNA的完整性所得电泳图，其中：M表示Marker。

图2为以不同个体基因组DNA混池为模板，经引物对D1、D2、D3或D4扩增山羊DRD1基因外显子区产物的琼脂糖凝胶电泳图。

图3为山羊DRD1基因PCR扩增产物测序图，其中：黑色框标出的部分表示筛查到的多态性位点g.191C＞T、g.282C＞T、g.712G＞T、g.1607C＞T、g.1817T＞A、g.2490G＞A。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。所述实施例仅用于解释本发明，而非对本发明保护范围的限制。

本发明利用PCR和DNA测序技术对山羊DRD1基因(参考序列：NC_030817.1)外显子(具体涉及第一和第二外显子)区域的多态性进行检测，并将其与山羊繁殖性状进行关联分析，鉴定可以作为山羊分子育种中辅助选择的分子标记。

1.实验试剂与耗材

1.1试剂

①T3 Super PCR Mix聚合酶(购自北京擎科生物科技有限公司)；②DNAMarkerD2000(购自天根生化科技(北京)有限公司)；③核酸染料(super red)(购自Biosharp公司)；④琼脂糖(购自HydraGene公司)，无水乙醇、NH

1.2耗材

1.5mL离心管、PCR反应管均购自白鲨生物科技有限公司；5mL真空抗凝采血管、采血针购自江苏宇力医疗器械有限公司；其他实验用耗材均由成都彭士达实验用品有限公司提供。

2.溶液与缓冲液

所有溶液与缓冲液均采用去离子超纯水配制，高压灭菌条件为121℃、15min。

2.1红细胞裂解液的配制

NH

2.2 5×TBE缓冲液的配制

Tris 54g、硼酸27g，及EDTA 3.72g，加水定容至1L，室温下保存备用，使用时稀释至0.5×TBE缓冲液。

2.3 1％琼脂糖凝胶

称取0.6g琼脂糖加入60mL 0.5×TBE缓冲液，放入微波炉加热1min至溶液清亮；溶液冷却后加入核酸染料6μL，轻摇使染料充分混匀，倒入制胶板冷却备用。

3.设计山羊DRD1基因外显子扩增引物

在NCBI上检索山羊DRD1基因的序列(NC_030817.1)，并利用Primer 5.0设计能够扩增DRD1基因外显子DNA片段的引物。引物序列见表1(2021年11月设计完成)。

表1.DRD1基因扩增引物表

4.以引物对D1、D2、D3、D4 PCR扩增待测山羊DRD1基因片段

4.1山羊全血样品的采集

实验所用的山羊共计134个样本，其中川南黑山羊54只，简州大耳羊47只，金堂黑山羊33只，具体信息见表2。采样方式：采取抗凝(EDTA-K2)全血样品，冰盒低温带回实验室后置于-80℃冻存。产羔数据由养殖场工作人员统计并记录。

表2.采样信息表

4.2血液样品基因组DNA的提取与分离

(1)将全血解冻后，抽取200μL到1.5mL离心管中，加入20μL蛋白酶K涡旋混匀后加入400μL红细胞裂解液(如果血液少于200μL，用PBS缓冲液调整血液样品体积至200μL)。

(2)将含有血液样品与红细胞裂解液的混合物置于56℃水浴锅中温育10分钟，孵育期间或涡旋离心管几次，或使用震荡水浴锅，直至细胞完全裂解。

(3)加入200μL 96％～100％乙醇，通过移液器充分吹打混匀即可。

(4)将已经制备好的混合液转移入纯化柱中，将纯化柱以6000×g的速度离心1min。弃掉含废液的收集管，将纯化柱放入一个新的2mL收集管中。

(5)加入500μL“DNA提取试剂盒”漂洗缓冲液Ⅰ至纯化柱中，8000×g离心1分钟后弃掉废液，将纯化柱放回收集管中。

(6)向纯化柱中加入500μL的“DNA提取试剂盒”漂洗缓冲液Ⅱ(已加指定的100％乙醇)，以最大速度(≥14000rpm)离心3分钟后弃滤液。

(7)将纯化柱放回收集管中，并再次以最大速度(≥14000rpm)离心1分钟，弃掉含废液的收集管，将纯化柱转移至新的1.5mL无菌离心管中。

(8)向纯化柱滤网膜中央加入50μL灭菌水以洗脱DNA，室温静置2分钟后，以12000rpm的速度离心1min。为了得到最高的DNA产量，可用50μL灭菌水再次重复洗脱步骤。

(9)弃掉纯化柱，将提取后的DNA样品放入-20℃冰箱备用。

4.3分光光度法检测DNA

用紫外分光光度计测定DNA样品的浓度和OD

4.4琼脂糖凝胶电泳检测DNA

用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品，如果电泳图显示的条带比较亮且无杂带，则该DNA样品符合实验要求(参见图1)。

4.5构建DNA混池

随机从提取的简州大耳羊、金堂黑山羊或川南黑山羊血液DNA样品中各选20个样，用ddH

4.6PCR扩增

PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2mL PCR管中，然后加入模板DNA(先以制备的DNA混池为模板用于检测多态性位点，再以单个样本的DNA为模板用于计算基因型)，离心后进行PCR扩增。

PCR反应体系：T3 Super PCR Mix 22μL、引物对D1或D2或D3或D4的上游引物F(10μmol/L)1μL、引物对D1或D2或D3或D4的下游引物R(10μmol/L)1μL、模板1μL；共25μL。

PCR反应程序：98℃预变性3min；98℃变性10s，59或61℃退火10s，72℃延伸(15s/kb)，35个循环；然后72℃延伸2min，4℃保存扩增产物。

5.扩增PCR产物后琼脂糖凝胶电泳验证

琼脂糖凝胶电泳检测分3步：1)制作1.0％的琼脂糖凝胶，使用核酸染料染色，点样4μL，点样后120V电压电泳30min；2)待PCR扩增产物分离结束后，在BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像系统成像；3)将处于目的条带位置(即条带大小正确)、清晰且单一的条带(参见图2)送生工生物有限公司测序。

6.山羊DRD1基因SNPs位点筛查

使用Chromas 2软件对测序结果进行分析，如果同一个位点在多次测序结果中都出现明显的双峰情况，则该位点很可能就是SNPs位点(参见图3)。在山羊DRD1基因筛查到的SNPs位点如表3所示。

表3.DRD1基因SNPs位点的信息

7.山羊DRD1基因SNPs位点的频率统计与分析

7.1基因型频率：是指某种特定基因型的个体在群体中占有的比例。

7.2等位基因频率：是指在一个群体中，特定等位基因数量与同一基因座位上全部等位基因总数的比值，表示一个种群中基因的多样性，比值位于0～1之间。

7.3遗传纯合度(homozygosity，Ho)和杂合度(heterozygosity，He)：

杂合度He＝1-Ho

其中，p

Ho和He用于度量某一个群体在特定位点上等位基因的纯合程度。

7.4有效等位基因数(number of effective alleles,Ne)是在理想群体中，某一基因座上产生与实际群体中相同的纯合度所需的等位基因数，就是纯合度的倒数：

7.5多态信息含量(polymorphism information content,PIC)指的是一个标记用于在群体检测多态性的价值：

其中，P

遗传标记多态性在连锁分析时可对提供信息量进行度量，当PIC＞0.5时为高度多态性，0.25＜PIC＜0.5时为中度多态性，当PIC＜0.25时为低度多态性。

7.6某基因位点的Hardy-Weinberg平衡性(HWE)检测采用皮尔逊χ统计量：

其中，m为某一遗传位点基因型应有个数；i为基因型序号；f

7.7频率统计与分析结果

在简州大耳羊群体中，对DRD1基因g.191 C＞T、g.282 C＞T、g.712 G＞T、g.1607C＞T、g.1817 T＞A、g.2490 G＞A进行遗传多样性参数的统计与分析(运用Excel 2020对数据进行初步的统计和SNPs位点进行遗传多样性分析)，结果见表4。在g.191C＞T位点处，卡方检验结果为χ

在金堂黑山羊群体中，对DRD1基因g.191 C＞T、g.282 C＞T、g.712 G＞T、g.1607C＞T、g.1817 T＞A、g.2490 G＞A进行遗传多样性参数的统计与分析(运用Excel 2020对数据进行初步的统计和SNPs位点进行遗传多样性分析)，结果见表5。根据遗传多样性分析，6个位点均属于中度多态性；6个位点进行Hardy-Weinberg平衡系数检测的结果显示，g.191C＞T、g.712 G＞T、g.1607 C＞T、g.1817 T＞A位点处于Hardy-Weinberg平衡状态(P＞0.05)，g.282 C＞T和g.2490 G＞A位点均不处于Hardy-Weinberg平衡状态(0.01＜P＜0.05)。

在川南黑山羊群体中，在进行SNPs位点检测的时候有5个样品出现测序失败的情况，故数量减少5个。对DRD1基因g.191 C＞T、g.282 C＞T、g.712 G＞T、g.1607 C＞T、g.1817 T＞A、g.2490 G＞A进行遗传多样性参数的统计与分析(运用Excel 2020对数据进行初步的统计和SNPs位点进行遗传多样性分析)，结果见表6。根据遗传多样性分析，6个位点均属于中度多态性，对6个位点进行Hardy-Weinberg平衡系数检测的结果显示，g.191 C＞T、g.282 C＞T、g.712 G＞T、g.1607 C＞T、g.1817 T＞A、g.2490 G＞A位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态(P＞0.05)。

表4.简州大耳羊基因位点群体遗传特性的统计

表5.金堂黑山羊基因位点群体遗传特性的统计

表6.川南黑山羊基因位点群体遗传特性的统计

8.山羊DRD1基因SNPs位点基因型效应的关联分析

基因型数据：PCR扩增产物经DNA测序分析所得的基因型。

生产数据：简州大耳羊、金堂黑山羊、川南黑山羊胎产羔数(具体指初产母羊平均产羔数)。

关联分析模型：运用IBM SPSS 18.0(statistical product and servicesolutions)软件一般线性模型对各SNPs位点的基因型与山羊产羔数进行关联分析，采用最小二乘法分析模型：

Y

其中，Y

在简州大耳羊群体中，g.191 C＞T、g.282 C＞T、g.712 G＞T、g.1607 C＞T、g.2490 G＞A都处于Hardy-Weinberg平衡状态(P＞0.05)，而g.1817 T＞A位点不处于Hardy-Weinberg平衡状态(P＜0.05)。对DRD1基因的SNPs位点与胎产羔数进行关联分析，结果见表7。g.1607 C＞T位点与胎产羔数有显著相关性，其中CC基因型胎产羔数要明显高于CT基因型(P＜0.05)；g.2490 G＞A位点与胎产羔数有显著相关性，其中GA基因型胎产羔数要明显高于AA基因型(P＜0.05)；在g.191 C＞T位点上CC基因型胎产羔数优于其它基因型。

在金堂黑山羊群体中，g.191 C＞T、g.712 G＞T、g.1607 C＞T、g.1817 T＞A位点处于Hardy-Weinberg平衡状态(P＞0.05)；g.282 C＞T和g.2490 G＞A位点不处于Hardy-Weinberg平衡状态(0.01＜P＜0.05)。对DRD1基因的SNPs位点与胎产羔数进行关联分析，结果见表7。g.1817 T＞A位点与胎产羔数有显著相关性，其中TT基因型胎产羔数要明显高于AA和TA基因型(P＜0.05)；g.2490G＞A位点与胎产羔数有显著相关性，其中GA基因型胎产羔数要明显高于GG基因型(P＜0.05)。

在川南黑山羊群体中，g.191 C＞T、g.282 C＞T、g.712 G＞T、g.1607 C＞T、g.1817 T＞A、g.2490 G＞A位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态(P＞0.05)。对DRD1基因的SNPs位点与胎产羔数进行关联分析，结果见表7。g.712 G＞T位点与胎产羔数有显著相关性，其中GT和TT基因型胎产羔数要明显高于GG基因型(P＜0.05)，g.191 C＞T位点与胎产羔数有显著相关性，其中CT基因型胎产羔数要明显高于CC基因型(P＜0.05)；在g.282C＞T位点上TT基因型胎产羔数优于其他基因型。

表7.山羊DRD1基因SNPs位点与产羔数(平均值±标准误差)的关联分析

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注：不同字母a、b、c表示每行(相同山羊品种的不同基因型)之间存在显著差异，即P＜0.05。

由表7可以看出，在简州大耳羊群体中，位于g.1607 C＞T或g.2490 G＞A位点上的不同基因型在简州大耳羊胎产羔数上有显著差异(P＜0.05)，且存在可以明显提高简州大耳羊产羔数的基因型。在金堂黑山羊群体中，位于g.1817 T＞A或g.2490 G＞A位点上的不同基因型在金堂黑山羊胎产羔数上有显著差异(P＜0.05)，且存在可以明显提高金堂黑山羊产羔数的基因型。在川南黑山羊群体中，位于g.191 C＞T或g.712G＞T位点上的不同基因型在川南黑山羊胎产羔数上有显著差异(P＜0.05)，且存在可以明显提高川南黑山羊产羔数的基因型。

结果表明：山羊DRD1基因外显子区(参考序列NC_030817.1第95514212-95518301位)多态性与简州大耳羊、金堂黑山羊和川南黑山羊的胎产羔数显著相关。

总之，本发明利用PCR扩增和DNA测序方法检测山羊DRD1基因(NC_030817.1)外显子区域的SNPs位点，并将其与简州大耳羊、金堂黑山羊和川南黑山羊繁殖性状进行关联分析，发现其存在可以作为提高简州大耳羊、金堂黑山羊和川南黑山羊产羔数性状的山羊分子育种中辅助选择的分子标记，为实现山羊繁殖性状的标记辅助选择(MAS)应用提供理论和实践依据，从而有助于加快良种选育速度。