m1A甲基转移酶TRMT10C在制备抗肝癌药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及RNA甲基转移酶TRMT10C的抑制剂在制备治疗和/或预防肝癌的药物中的应用。

背景技术

肝癌是一类常见的恶性肿瘤，尽管不少患者在疾病早期就得到了诊断和治疗，但肝癌的复发率依然很高。对于病情已进入中晚期的患者预后更不乐观：如果癌症扩散到了周边的淋巴结，患者的5年生存率只有11％；当癌症扩散到其他器官后，5年生存率更是只有3％。但在目前，我们对于肝癌的有效治疗手段还极为有限。

当前的肝癌系统疗法可以分为两类，一类是多激酶抑制剂，另一类是免疫疗法，还有一些重要的在研疗法，如血管生成抑制剂和免疫检查点抑制剂等。目前，美国FDA批准了3款多激酶抑制剂，分别是索拉非尼(sorafenib)、瑞戈非尼(regorafenib)和乐伐潜尼(lenvatinib)，但是上述3款已获批的药物都有自身的劣势，如索拉非尼，从总体生存率收益上看是优于安慰剂，但它的客观缓解率(ORR)较低，只有2％。因此，有必要开辟一种抗肝癌的新作用机制或者一种肝癌药物的筛选方法，为肝癌治疗提供新的策略。我们希望有更多新药不断问世，给全世界的肝癌患者带来新的治疗方案。

发明内容

经过研究，发明人发现脂质代谢和血管生成在肝细胞癌(HCC)的肿瘤形成中起着关键作用，进一步，发明人发现通过抑制m1A甲基转移酶TRMT10C来促进c-FOS表达，可以显著抑制血管生成，甚至可以逆转脂质代谢失调。通过转录组分析、m1A甲基化分析和功能验证，发明人确定c-FOS是甲基化变化的关键靶点。从机制上讲，m1A甲基转移酶抑制剂可以减轻m1A甲基转移酶TRMT10C对c-FOS的修饰，引起下游基因CD146和PCSK9的转录调控，最终影响血管生成和脂质代谢。此外，TRMT10C和PCSK9在人类HCC肿瘤组织中的高表达与预后不良有关，而c-FOS表现出相反的模式，说明TRMT10C-c-FOS-PCSK9轴是HCC细胞死亡的重要机制。

本发明包括如下技术方案：

第一方面，本发明涉及m1A甲基转移酶TRMT10C的抑制剂在制备治疗和/或预防肝癌的药物中的应用。

进一步，所述m1A甲基转移酶TRMT10C的抑制剂选自(a1)-(a2)中的任意一种或两种的组合：

(a1)抑制m1A甲基转移酶TRMT10C活性的物质；

(a2)抑制编码m1A甲基转移酶TRMT10C的基因转录和/或翻译的物质。

其中，所述抑制m1A甲基转移酶TRMT10C活性的物质包括但不限于铜离子和/或铜离子载体。

所述抑制编码m1A甲基转移酶TRMT10C的基因转录和/或翻译的物质为小干扰RNA。

第二方面，本发明提供一种用于治疗和/或预防肝癌的药物组合物，所述药物组合物包含有效量的m1A甲基转移酶TRMT10C的抑制剂作为活性成分，其中，所述m1A甲基转移酶TRMT10C的抑制剂选自(a1)-(a2)中的任意一种或两种的组合：

(a1)抑制m1A甲基转移酶TRMT10C活性的物质；

(a2)抑制编码m1A甲基转移酶TRMT10C的基因转录和/或翻译的物质。

进一步的，所述药物组合物中还包括药学上可接受的载体。

第三方面，本发明提供一种m1A甲基转移酶TRMT10C在筛选用于治疗和/或预防肝癌的药物中的用途。

所述药物为m1A甲基转移酶TRMT10C的抑制剂，具体的，所述m1A甲基转移酶TRMT10C的抑制剂选自(a1)-(a2)中的任意一种或两种的组合：

(a1)抑制m1A甲基转移酶TRMT10C活性的物质；

(a2)抑制编码m1A甲基转移酶TRMT10C的基因转录和/或翻译的物质。

第四方面，本发明提供一种筛选用于治疗和/或预防肝癌的药物的方法，所述方法包括：

(1)使候选药物与肝癌细胞接触；

(2)鉴定m1A甲基转移酶TRMT10C在所述细胞中的表达水平，并与未接触候选药物的细胞中的m1A甲基转移酶TRMT10C表达水平相比较；

(3)选出使细胞内m1A甲基转移酶TRMT10C表达水平降低的物质作为治疗和/或预防肝癌的药物。

本发明提供了一种新的用于肝癌治疗的分子机制，发明人发现过量的铜通过抑制m1A甲基转移酶TRMT10C来促进c-FOS的表达，从而逆转脂质代谢的失调并抑制血管生成。从机制上讲，铜诱导可以减轻m1A甲基转移酶TRMT10C对c-FOS的修饰，引起下游基因CD146和PCSK9的转录调控，最终影响血管生成和脂质代谢。该发现证实TRMT10C-c-FOS-PCSK9轴是铜介导的肝癌细胞死亡的重要机制，本发明技术方案为利用这一新分子机制来治疗肝癌提供基础。

附图说明

图1DSF诱导的TRMT10C下调引起c-FOS介导的肝癌细胞凋亡。

图2DSF诱导的TRMT10C下调引起肝癌细胞凋亡。

图3TRMT10C通过调节c-FOS基因来调节肝癌细胞增殖。

图4DSF诱导引起CD146的表达显著降低。

图5TRMT10C调节c-FOS影响血管生成。

图6脂质代谢组学结果的KEGG富集分析。

图7DSF诱导的c-FOS通过调节PCSK9逆转肝癌细胞中TG的积累。

图8TRMT10C、c-FOS和PCSK9基因表达的关系。

图9不同条件下皮下肿瘤组织和HCC肿瘤细胞中脂质代谢产物水平。

图10c-FOS受上游TRMT10C调节，并影响下游PCSK9的表达。

图11TRMT10C、c-FOS和PCSK9表达与预后的关系。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

m1A甲基转移酶TRMT10C的抑制剂

本发明中所述的“m1A甲基转移酶TRMT10C的抑制剂”包括直接或间接(如通过反应性中间物、代谢物等)作用于m1A甲基转移酶TRMT10C从而抑制或降低m1A甲基转移酶TRMT10C的生物活性的物质，具体包括：(a1)在蛋白质水平上通过相互作用直接抑制m1A甲基转移酶TRMT10C生物活性的物质；(a2)抑制编码m1A甲基转移酶TRMT10C的基因转录和/或翻译的物质。这里所述的“m1A甲基转移酶TRMT10C生物活性”是指m1A甲基转移酶TRMT10C促进c-FOS表达的活性。

在本发明的一个实施例中，可抑制m1A甲基转移酶TRMT10C生物活性的物质为铜离子或铜离子载体，更优选的，所述铜离子载体为双硫仑(DSF)。本领域技术人员也完全能够根据本发明提供的筛选方法从候选药物中筛选得到其他具有抑制m1A甲基转移酶TRMT10C生物活性的药物。

本发明所述的“抑制编码m1A甲基转移酶TRMT10C的基因转录和/或翻译的物质”是指在基因水平上通过间接作用于m1A甲基转移酶TRMT10C的基因来影响m1A甲基转移酶TRMT10C的表达，通常是核酸类物质，例如小干扰RNA(siRNA)。

在获得所述抑制编码m1A甲基转移酶TRMT10C的基因转录和/或翻译的核酸序列(如siRNA)后，可用常规技术例如转化、转染、感染及物理技术将其引入对象细胞内。用来转移核酸分子的适当的病毒载体、质粒或克隆载体均为本领域所熟知。

用途

本发明提供一种m1A甲基转移酶TRMT10C的抑制剂在制备治疗和/或预防肝癌的药物中的应用。本发明所述的m1A甲基转移酶TRMT10C的抑制剂可诱导哺乳动物体内的肝癌细胞死亡，因此，可用于治疗和/或预防肝癌。所述哺乳动物为人或非灵长类动物，如猫、狗、马、牛等。

另一方面，本发明提供一种m1A甲基转移酶TRMT10C在筛选用于治疗和/或预防肝癌的药物中的用途。RNA甲基转移酶包括METTL3、METTL14、METTL2、METTL16、METTL8、METTL6、TRMT6、TRMT61A、TRMT61B和TRMT10C，本发明预料不到的发现m1A甲基转移酶TRMT10C被抑制可促进c-FOS的表达，显著逆转脂质代谢的失调并抑制血管生成，引起肝癌细胞凋亡。因此，发明人认为m1A甲基转移酶TRMT10C可作为抗肝癌药物的筛选靶点筛选得到具有治疗和/或预防肝癌的活性物质。

药物组合物

本发明还提供一种用于治疗和/或预防肝癌的药物组合物，所述药物组合物包含有效量的m1A甲基转移酶TRMT10C的抑制剂作为活性成分，以及药学上可接受的载体。其中，所述m1A甲基转移酶TRMT10C的抑制剂选自：(a1)抑制m1A甲基转移酶TRMT10C活性的物质；(a2)抑制编码m1A甲基转移酶TRMT10C的基因转录和/或翻译的物质。

本发明所述的药物组合物中包含有效量的本发明所述的抑制m1A甲基转移酶TRMT10C活性的物质或根据本发明提供的方法筛选出的物质。所述活性物质可以单独给予，或者联合本领域常规药物共同给与，一般情况下，所述活性物质与药物载体等一同给予。所述“有效量”是指治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。针对某一用药对象的有效量取决于该对象的体型、健康状况、病症的性质和程度，以及选择给予方式。

本发明所述的“药学上可接受的载体”是指用于制备药物的载体或赋形剂，可作为药学上可接受的载体或赋形剂包括糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；乳化剂，如Tween等；润湿剂，如月桂基硫酸钠等。还包括着色剂、调味剂、抗氧化剂、防腐剂等。

本发明所述的抑制m1A甲基转移酶TRMT10C活性的物质或根据本发明提供的方法筛选出的物质还可以和其它药剂联合使用。给药途径包括经口、经外用、直肠、胃肠外、局部、吸入方式使用。也可经由控释或缓释胶囊系统及其它药物输送技术给药。

筛选药物的方法

本发明还提供一种筛选用于治疗和/或预防肝癌的药物的方法，所述方法包括：(1)使候选药物与肝癌细胞接触；(2)鉴定m1A甲基转移酶TRMT10C在所述细胞中的表达水平，并与未接触候选药物的细胞中的m1A甲基转移酶TRMT10C表达水平相比较；(3)选出使细胞内m1A甲基转移酶TRMT10C表达水平降低的物质作为治疗和/或预防肝癌的药物。其中，肝癌细胞可选自Huh7或MHCC97H。

下面结合具体实施例进一步阐述本发明技术方案，应理解，具体实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

本发明实施例涉及的材料和方法如下：

细胞系和试剂：所有细胞系均来自复旦大学(中国上海)中山医院癌症研究所。人肝癌癌症细胞系Huh7和MHCC97H在Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM；GNM12800-2，GENOM，中国浙江)中培养，培养基中含有10％FBS(Sigma，圣路易斯，MO，美国)和1％青霉素-链霉素(GNM 15140，GENOM)。细胞保持在37℃潮湿的ThermoForma培养箱(Thermo FisherScientific，Waltham，MA，USA)中，在5％CO

DSF(NSC 190940)和THA(K17)购自Selleck(Selleck Chemicals，Huston，USA)。TRMT10C多克隆抗体(Ab)(29087-1-AP)来自Proteintech(Proteintech Group，股份有限公司，Chicago，USA)，(sc-515289)来自SANTA CRUZ BIOTTECHNOLOGY(SANTA CRUZBIOTTECTION，California，USA)；c-FOS单克隆抗体(ab222699)来自Abcam(Abcam，Cambridge，UK)，PCSK9单克隆抗体(EM1701-26)购自HUABIO(HUABIO，Massachusetts，USA)，β-肌动蛋白单克隆抗体(AC026)购自ABclone(ABclone，Wuhan，China)Lamin B1(12987-I-AP)购自Proteintech(Proteintech Group股份有限公司，Chicago，USA)。兔(A0208)和小鼠(A0216)辣根过氧化物酶偶联的次级Ab来自Beyotime Biotechnology。

菌落形成测定：进行集落形成测定以确定HCC细胞的增殖能力。综上所述，单元格(1-3×10

动物实验：BCLB/C背景雄性4-6周龄小鼠产自Charles River(中国上海)，研究中使用的所有动物均在无特定病原体的设施中饲养。所有动物护理和实验方案均由复旦大学中山医院机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准。将Huh7细胞以107的细胞计数皮下接种到小鼠中以形成肿瘤。肿瘤形成后，将小鼠随机分为四组(a、b、c、d)。a组给予生理盐水(18mg/kg.ip，qod)，b组给予DSF(50mg/kg.po，qod)。

蛋白质印迹分析：在应用RIPA裂解缓冲液(WB0101，WellBio Technology Co.，Ltd，Shanghai，China)的培养物中从HCC细胞获得总蛋白质，并在10％SDS/PAGE上分离，然后转移到聚偏二氟乙烯(PVDF；ISEQ00010，Merck Millipore有限公司，Darmstadt，Germany)膜上。用西方阻断缓冲液(P0252，Beyotime Biotechnology)阻断15分钟后，在4℃下使用初级Ab探测膜过夜，然后与相应的次级Ab孵育1h。最后，Chemistar检测到这些条带

定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)：使用RNA快速纯化试剂盒(ES-RN001，易山生物技术有限公司，中国上海)从HCC细胞中提取总RNA。用Tissue RNA Purification KitPlus(ES-RN002plus，YISHAN BIOTECHNOLOGY CO.，LTD.，Shanghai，China)提取动物组织的RNA。使用PrimeScript RT Master Mix(RR036A，TaKaRa，大连，中国)获得互补DNA。然后使用SYBR Green试剂盒(11202ES08，Yeasen，Shanghai，China)在ABIPrism 7500序列检测系统(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)上进行qRT-PCR。条件设定如下：初始变性为95℃持续5最小值，95℃循环10次40s和60℃持续30s。2-ΔC采用T法计算基因表达变化，以β-肌动蛋白为内标化。

慢病毒介导的转染：为了过表达或敲低TRMT10C和c-FOS，使用购自Genomedicech有限公司的慢病毒将质粒转染到HCC细胞中。

流式细胞术检测细胞凋亡：Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒(C1062L，BeyotimeBiotechnology，Shanghai，China)用于通过FITC和PerCP-Cy5.5荧光通道检测HCC细胞的凋亡水平。

CCK-8和EdU增殖测定：细胞计数试剂盒-8(CCK-8)(40203ES80，Yeasen，中国上海)和EdU(C10310-1，RiboBio，中国广州)根据制造商的说明进行测定。简言之，在加入DSF和/或THA后，或感染c-FOS、TRMT10C腺病毒后，将HCC重新接种到96孔板中(5000个细胞/孔用于测试后或500个细胞/孔用于连续细胞增殖测定)，然后培养不同的天。然后，将HCC与每孔10μl CCK-8溶液在37℃下再孵育2小时，并使用微孔板读数器(Synergy H4；BioTekInstruments，股份有限公司，USA)在450nm处检测吸光度值(OD)。在EdU测定中，将HCC与EdU混合物(50μM)孵育2小时，用4％多聚甲醛固定，用2mg/ml甘氨酸脱色，用0.5％TritonX-100渗透，并用PBS洗涤三次。然后，将HCC与100μl 1×Apollo孵育30分钟，并用100μl 1×Hoechst 33342(1:100稀释)再染色10分钟。在荧光显微镜中观察EdU阳性HCC。

甲基化RNA免疫沉淀测序：甲基化RNA免疫沉淀测序(MeRIP-seq)服务由CloudseqBiotech股份有限公司(中国上海)提供。简言之，在感染对照慢病毒或TRMT10C敲低慢病毒后，从HCC中提取>100ug的总RNA。然后，分离polyA+RNA的总RNA(Invitrogen)并进行定量。注意，保留500ng预片段化mRNA作为RNA-seq的输入对照，然后将5μg片段化mRNA与5μg抗m1A抗体在4℃的免疫沉淀缓冲液中孵育2小时。然后加入蛋白A/G珠(Thermo-Fisher)，并在4℃下孵育2小时。然后，用TRIzol试剂洗脱并提取结合的mRNA。纯化的信使核糖核酸用于文库生成；输入和免疫沉淀样品用于RNA-seq。对峰进行鉴定，并通过基因本体论(GO)对差异甲基化峰进行计数和分析。

信使核糖核酸稳定性和半衰期的检测：将对照慢病毒和TRMT10C敲低慢病毒感染的HCC(5×10

交联免疫沉淀(CLIP)：根据推荐说明书，CLIP试剂盒(RQ015，ruqi.bio，Guangzhou，China)用于处理TRMT10C抗体紫外线作用后的交联Huh7细胞。简言之，在4℃下裂解HCC并用特异性或对照IgG抗体免疫沉淀过夜，然后进行RNA纯化。最后，通过RT-qPCR对免疫沉淀的RNA进行分析。将靶RNA c-FOS切割成5个片段，并设计了5个引物，详细信息如下：

脂质代谢产物检测：TG测定试剂盒(A110-1-1)、TC测定试剂盒、HDL-L测定试剂盒和LDL-L测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。细胞裂解后，通过使用微孔板读取器(Synergy H4；BioTek Instruments，股份有限公司，USA)在510nm(用于TG和TC测试)和546nm(用于HDL-L和LDL-L测试，两次，每次间隔5分钟)处添加试剂来检测吸光率。

m1A甲基转移酶TRMT10C下调诱导c-FOS介导的细胞凋亡

发明人预料达不到的发现，双硫仑(DSF)具有抑制m1A甲基转移酶TRMT10C活性的作用，在本发明的具体实施例中，均使用双硫仑诱导m1A甲基转移酶TRMT10C表达下调。

在DSF的诱导下，TRMT10C在蛋白质水平上显著降低(图1A-B)，说明DSF具有抑制TRMT10C蛋白表达的功能。为了进一步验证TRMT10C和c-FOS之间的关系，我们进行了TRMT10C的过表达和敲除实验。我们观察到，当TRMT10C过表达时，c-FOS基因表达显著降低，而当TRMT10C被敲除时，c-FOS基因表达显著增加，这表明TRMT10C和c-FOS之间存在潜在的相互作用，这一结论在mRNA和蛋白质水平上也得到了证实(图1C-D)。

此外，我们使用RT-PCR来监测放线菌素D在TRMT10C过表达Huh7细胞中转录抑制后不同时间点c-FOS mRNA的转录丰度，以确定c-FOS信使核糖核酸的半衰期，并进一步验证TRMT10C和c-FOS之间的相互作用。TRMT10C过表达增加了c-FOS mRNA的半衰期，而TRMT10C敲除降低了其半衰期(图1E-F)。

使用CLIP-qPCR的定量实验也证实TRMT10C蛋白与c-FOS mRNA的CDS区的第二段结合(图1G)。总之，DSF诱导HCC细胞的甲基化变化，c-FOS受上游m1A甲基转移酶TRMT10C的调节。

TRMT10C的表达变化影响c-FOS对肿瘤细胞的细胞毒性作用

当TRMT10C过表达时，Huh7细胞在DMSO和DSF组中均显示出显著增加的增殖(图1H)，在DSF处理下观察到明显的连续生长趋势(图1J和图2C)。另一方面，不同程度的TRMT10C敲低导致细胞增殖能力显著下降(图1I)，同时持续生长能力显著降低(图1K)。这些结果表明，当TRMT10C过表达时，细胞增殖得到促进，DSF处理增加了细胞增殖能力和耐药性。相反，当TRMT10C被敲除时，细胞增殖减慢。

菌落形成测定也证实了这些发现(图2D-E)。最后，我们进行了一项拯救实验，以进一步验证TRMT10C通过调节c-FOS基因来调节HCC细胞增殖(图3A-E)。总之，研究结果表明，DSF诱导的m1A甲基转移酶TRMT10C的下调促进了c-FOS的表达，从而抑制了HCC细胞的增殖。

TRMT10C甲基化修饰c-FOS，通过CD146影响血管生成

先前的研究结果表明DSF在体外具有抗血管生成的作用。因此，我们进一步研究了TRMT10C调节c-FOS影响血管生成的机制。首先，我们在Huh7和MHCC97H细胞系中筛选了血管生成相关基因，发现DSF和THA的添加导致黑色素瘤细胞粘附分子(MCAM)基因的表达降低(图4A)。MCAM，也称为CD146，是一种促进肿瘤生长和血管生成的跨膜糖蛋白。皮下异种移植物的免疫组织化学实验表明，添加DSF、THA和DSF+THA后，CD146的表达显著降低(图4B)。许多研究已经报道CD146作为肿瘤血管生成的靶点。在Huh7和MHCC97H细胞系中，添加DSF、THA和DSF+THA导致CD146蛋白表达降低(图5A和图4C)。TRMT10C的过表达或敲低导致c-FOS和CD146的蛋白质水平变化(图5B-C)。类似地，c-FOS的过表达或敲低也在蛋白质水平上诱导c-FOS和CD146的改变(图4D-E)。萤光素酶报告基因测定进一步证明了c-FOS对MCAM基因的调节作用(图5D)。这些结果表明，TRMT10C通过c-FOS调节CD146的表达，从而影响肿瘤细胞中的血管生成。此外，我们通过拯救实验验证了TRMT10C、c-FOS和CD146在蛋白质水平上的调节关系(图5E-F)，并通过血管生成测定证实了这些分子对血管生成的影响(图5G-H)。总之，这些发现表明TRMT10C通过c-FOS调节CD146的表达来影响HCC细胞的血管生成。

c-FOS通过调节PCSK9逆转HCC中甘油三酯(TG)的积累

我们之前的研究结果表明，DSF可以降低脂质代谢水平。随后，通过对脂质代谢组学结果的KEGG富集分析(图6A)，我们发现DSF诱导的脂质代谢变化主要富集在类固醇合成、鞘脂代谢和癌症相关途径的改变中(图6B)。差异丰富的脂质代谢产物的富集分析显示，DSF处理后Huh7细胞的脂质水平发生了显著变化，TG(17:0-18:0-22:5)是水平下降最显著的脂质代谢物(图7A-B)。在DSF处理下，Huh7和MHCC97H细胞系的TG浓度均降低(图7C)。通过TG(17:0-18:0-22:5)代谢产物与差异表达基因之间的相关性分析，我们确定PCSK9是最呈正相关的脂质代谢基因(图7D)。此外，在DSF处理下，Huh7和MHCC97H细胞系中PCSK9的基因和蛋白表达水平均降低(图7E和图6C-D)。为了验证PCSK9的表达确实是由DSF诱导的TRMT10C-c-FOS轴介导的，我们检测了c-FOS和TRMT10C的过表达或敲低。结果显示，c-FOS的过表达或敲低导致PCSK9基因和蛋白质表达的减少或增加(图7F-G和图6E-F)。TRMT10C的过表达或敲低也导致下游c-FOS和PCSK9基因表达的变化(图8A-F)。TRMT10C、c-FOS和PCSK9在蛋白质水平上的拯救实验也验证了上述结果(图7H-I)。此外，荧光素酶基因测定也证明了c-FOS对PCSK9的调节作用(图7J)。

此外，我们测量了不同条件下皮下肿瘤组织和HCC肿瘤细胞中脂质代谢产物，即TG、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白蛋白胆固醇(LDL-C)的浓度。在DSF处理下，动物组织中TG、TC和LDL-C的浓度显著降低(图9A)，Huh7细胞中TC和LDL-C的浓度明显降低(图9B)，而MHCC97H细胞中LDL-C显著降低(图9C)。当c-FOS过表达时，Huh7细胞中TG、TC、HDL-c和LDL-c的浓度均显著降低(图9D)。相反，c-FOS被敲低，Huh7细胞中TG、TC、HDL-c和LDL-c的浓度显著增加(图9E)。这些结果表明，c-FOS影响脂质代谢产物的浓度。总之，DSF诱导的HCC细胞脂质代谢的显著变化是通过TRMT10C-c-FOS轴调节PCSK9实现的，TG(17:0-18:0-22:5)是水平下降最显著的脂质代谢产物。

c-FOS受上游TRMT10C调节，并影响下游PCSK9的表达

在发现并验证TRMT10C-c-FOS-PCSK9轴的调节机制后，我们还检测了其成分在人类HCC和邻近癌旁组织中的表达(图10A，比例尺分别为200μm和20μm)。结果表明，在癌组织中，TRMT10C和PCSK9的表达水平高于邻近的癌旁组织，而c-FOS表现出相反的模式。基于TRMT10C、c-FOS和PCSK9在中心肿瘤区域的表达以及Kaplan-Meier总生存率(OS)生存分析(n＝104)，我们发现TRMT10C和PCSK9在肿瘤组织中的高表达与不良预后显著相关；肿瘤组织中c-FOS的低表达也与不良预后显著相关(图10B-D)。我们还研究了TRMT10C+c-FOS、c-FOS+PSK9和TRMT10C+c-FOS+PSK9与预后的关系。结果表明，当TRMT10C弱表达而c-FOS高表达时，观察到最佳预后(图10E)；当c-FOS弱表达而PCSK9高表达时(图10F)；当TRMT10C弱表达时，c-FOS高表达，PCSK9弱表达(图10G)。这些发现不仅证实了TRMT10C、c-FOS和PCSK9表达与预后的相关性，而且验证了TRMT10C-FOS-PCSK9轴的调节机制。最后，我们通过响应实验验证了上述结果(图11A-G)。总之，我们的发现表明，在铜离子载体的诱导作用下，m1A甲基转移酶TRMT10C下调导致c-FOS基因上调。一方面，c-FOS抑制CD146的表达，从而抑制血管生成，另一方面，c-FOS抑制PCSK9的表达，导致脂质代谢产物，特别是TG的变化，最终导致肿瘤细胞脂质代谢的显著改变(图10H)。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。