一种利用组织培养技术繁殖光皮桦无菌苗的方法

技术领域

本发明属于植物无性繁殖技术领域，具体涉及一种利用组织培养技术繁殖光皮桦无菌苗的方法。

背景技术

光皮桦(Betula luminifera)又名亮叶桦、亮皮树、桦角，为桦木科桦木属落叶高大乔木，是我国特有的优良速生材树种。光皮桦分布广，生长快，适应性强，材质优良，用途广泛，其木材已被国家列入一类材名录，可用于家具、人工板材及生态防护林营造等领域，是一种优良的经济、速生、阔叶树种，不仅生长周期短且材质优良，完全可以满足我国市场的需求，同时还可解决造林树种单一、杉松比例过大等一系列问题，具有广阔的应用前景。自20世纪80年代起，国际市场对桦木木材的需求一直持续上升。如今，随着我国经济的快速发展，木材的需求量也大幅度增加，但林木生长周期长，产生了供需紧张这一严重问题。对此，选择光皮桦的优良材料，利用组织培养技术进行无性繁殖，简便、迅速且繁殖速度快，既可以保持苗木的优良遗传特性，还可以大规模生产，对光皮桦的良种快繁于推广具有重要意义。

目前已有一些针对光皮桦进行组培繁殖的研究，如申请号为CN201410173069.4的专利文件公开了一种光皮桦植物组织培养方法及其培养基，其是采用10年生以上的光皮桦作为母树，在母树的基部选择健壮的萌芽，剪取其2-3cm长的幼嫩芽叶作为外植体，进行诱导培养后得到诱导芽，再转入增殖培养基中培养得到增殖芽，最后转入生根培养基中培养即得到生根苗。此专利是以叶芽为外植体进行组织培养，而本申请以种胚及带腋芽茎段为外植体，取材更为方便，更不容易受限于生长季节。

发明内容

本发明为解决上述问题，提供了一种利用组织培养技术繁殖光皮桦无菌苗的方法。

具体是通过以下技术方案来实现的：

一种利用组织培养技术繁殖光皮桦无菌苗的方法，包括以下步骤：

1、外植体采集：于晴天收集成熟种子、剪取长势良好的光皮桦带腋芽嫩茎。

2、外植体消毒：

a.将采集的嫩茎剪成4-5cm的茎段，种子剥去种皮，置于洁净的烧杯中，用洗洁精水浸泡30～45min，再用流水冲洗干净；

b.冲洗后的茎段和茎段以PEF进行处理，其中，茎段处理时间为10-20s，种子处理时间为15-30s；

c.将处理后的茎段和种子置于超净工作台上，先用75％酒精浸泡30～45s，用无菌水漂洗3～5次，后用0.1％升汞浸泡12～15min，无菌水漂洗5次，每次1.5min。

进一步，所述的PEF处理，其电场强度为10-15Kv/cm，脉冲宽度为30-40μs，脉冲频率为600-800Hz。

3、配制培养基

(1)不定芽诱导培养基：其组成为：MS+BA 1.0～2.0mg/L+2,4-D 0.05～0.15mg/L+NAA 0.1～0.5mg/L+琼脂6.5g/L+蔗糖25～30g/L；pH条件为5.8～6.0；于121℃101KPa灭菌20min制得。

(2)增殖培养基：其组成为：MS+2,4-D 2.0～4.0mg/L+NAA 1.0～2.0mg/L+IAA1.0～2.0mg/L+琼脂6.5g/L+蔗糖25～30g/L；pH条件为5.8～6.0；于121℃101KPa灭菌20min制得。

(3)种子萌发诱导培养基，其组成为：MS+BA 2.0～4.0mg/L+NAA 0.2～0.5mg/L+GA3 1.0～3.0mg/L+琼脂6.5g/L+蔗糖25～30g/L；pH条件为5.8～6.0；于121℃101KPa灭菌20min制得。

(4)愈伤组织诱导培养基：其组成为：MS+BA 1.0～3.0mg/L+NAA 0.2～0.5mg/L+TDZ 0.5～1.0mg/L+琼脂6.5g/L+蔗糖25～30g/L；pH条件为5.8～6.0；于121℃101KPa灭菌20min制得。

(5)丛生芽诱导培养基：其组成为：WPM+BA 2.0～5.0mg/L+NAA 1.0～3.0mg/L+ZT1.0～3.0mg/L+琼脂6.5g/L+蔗糖25～30g/L；pH条件为5.8～6.0；于121℃101KPa灭菌20min制得。

(6)生根培养基：其组成为：(1/2～1)MS+50～150mg/L维生素C或50～100mg/LAgNO3+琼脂6.5g/L+蔗糖20g/L；pH条件为5.8～6.0；于121℃101KPa灭菌20min制得。

4、诱导培养：可采用光皮桦带腋芽段及种子进行不定芽诱导，还可以用种子进行萌发诱导培养；

(1)采用光皮桦带腋芽段及种子进行不定芽诱导：

a.接种：将消毒后的嫩茎、种子放入事先准备好的无菌培养皿中，用无菌滤纸吸干材料上残留的水分，再用无菌手术剪刀将茎段剪成2.5～3.0cm长的带腋芽段，接种到不定芽诱导培养基中诱导不定芽；种子直接吸干水分后直接接种于不定芽诱导培养基中；

b.诱导管理：培养室温度24～26℃，湿度70～80％，光照强度1800～2000lx，每天光照时间10～12h，5d后可见不定芽萌发，10-15d即可长成长度大于1.0cm的不定芽，待不定芽长到2～2.5cm左右高时，转入增殖培养基中培养；

c.增殖培养：将不定芽苗切成1.5cm左右长的小段，接种于不定芽增殖培养基中诱导增殖。接种时将茎段竖直插入培养基中，达0.5～1.0cm，使之与培养基充分接触。培养室温度24～26℃，湿度70～80％，光照强度1800～2000lx，每天光照时间10～12h，培养至第7天时添加浓度为20-25％的海藻糖溶液7-12ml，同时以超声波辐射处理10-15s，培养15d后，可见大量丛生芽长出；

d.生根培养：将丛生芽切成3cm左右高的单株，经浸泡处理后接种到生根培养基中诱导生根，15-20d后即可得光皮桦无菌苗。其中，培养室温度24～26℃，湿度70～80％，先暗培养10天再转入光培养，光照强度1800～2000lx，每天光照时间10～12h。

(2)采用种子进行萌发诱导培养：

a.接种：将消毒后的种子放入事先准备好的无菌培养皿中，用无菌滤纸吸干材料上残留的水分，然后接种到种子萌发诱导培养基中诱导种子萌发；

b.诱导管理：培养室温度24～26℃，湿度70～80％，光照强度1800～2000lx，每天光照时间10～12h，15d以后可见种子萌发，长出2片子叶；待子叶长高到1cm左右时，转入愈伤组织诱导培养基中培养；

c.愈伤组织诱导培养：用无菌刀片将种子萌发产生的子叶以及膨大的胚组织分别切成长度为0.5cm左右，然后接种到愈伤组织诱导培养基中诱导愈伤组织分化。培养室温度24～26℃，湿度70～80％，光照强度1800～2000lx，每天光照时间10～12h。4-6d以后可见绿色、紧密的愈伤组织，10-12d可长为1.0cm左右；待愈伤组织长大到1.5～2cm左右时，即可转入丛生芽诱导培养基中培养；

d.丛生芽诱导培养：用无菌刀片将愈伤组织切成0.5cm×0.5cm左右，接种到丛生芽诱导培养基中诱导不定芽。其中，培养室温度24～26℃，湿度70～80％，光照强度1800～2000lx，每天光照时间10～12h。7-13d左右可丛生芽萌发；待丛生芽长高到3cm左右时，即可转入生根培养基中培养；

e.生根培养：将丛生芽切成3cm左右高的单株，将切好的丛生芽直立插入装有150～200mg/L的IBA无菌溶液中浸泡15～20min(插入深度为0.5～1.0cm)，经浸泡处理后接种到生根培养基中诱导生根，接种时将茎段的下端插入培养基中达0.5～1.0cm。12-26d后即可得光皮桦无菌苗。其中，培养室温度24～26℃，湿度70～80％，先暗培养8天再转入光培养，光照强度1800～2000lx，每天光照时间10～12h。

综上所述，本发明的有益效果在于：本发明利用组织培养技术繁殖光皮桦无菌苗，并在传统方法的基础上进行改进，通过对外植体进行消毒处理、在培养过程中进行促分化处理，使得短期内即可获得大量性状一致、脱毒的光皮桦无菌苗，还可分别采用嫩茎和种子进行培养，充分对光皮桦进行利用，并极大限度的保持了母本的特性，在为光皮桦资源保护、良种选育以及产业发展提供科技支撑。

其中，对采集的外植体先采用洗洁精水进行浸泡，冲洗干净后采用PEF进行处理，可有效刺激植物细胞，提高细胞全能性，同时还可破坏外植体表面的微生物细胞膜，有效提高杀菌消毒的效果，减少试剂的使用及浸泡时间，保证培养得到的光皮桦苗均为脱毒苗，稳定性好，移栽后病虫害少，进而保证了光皮桦的存活率。

现有技术中针对光皮桦的组织培养都是采用芽叶、茎段进行培养，而本申请中还可采用种子进行培养，并针对性的制备了种子萌发诱导培养基，与传统的种子育苗相比缩短了发芽时间，提高了出苗效率；和组织培养法相比，充分利用了光皮桦资源，同时采用种子和嫩茎进行组培，提高了培养出苗的数量，可规模化种植，解决种苗来源这一瓶颈。

在增殖培养至7天时添加海藻糖溶液，同时辅以超声处理，可有效加快光皮桦细胞的分化速度，缩短组培时间，相比现有采用芽叶进行光皮桦组织培养的技术而言，培养时间由4-7个月缩短至3-4个月。

附图说明

图1为实施例1中以光皮桦带芽腋段进行不定芽诱导培养的光皮桦茎段于不定芽诱导培养基中培养15天的长势图。

图2为实施例2中以光皮桦带芽腋段进行不定芽诱导培养的光皮桦茎段于不定芽诱导培养基中培养17天的长势图。

图3为实施例2中以种子萌发诱导培养的光皮桦于生根培养基中培养24天的长势图。

图4为实施例3中以种子萌发诱导培养的光皮桦于生根培养基中培养30天的长势图。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，但本发明并不局限于这些实施方式，任何在本实施例基本精神上的改进或代替，仍属于本发明权利要求所要求保护的范围。

实施例1

一种利用组织培养技术繁殖光皮桦无菌苗的方法，包括以下步骤：

1、外植体采集：于晴天收集成熟种子、剪取长势良好的光皮桦带腋芽嫩茎。

2、外植体消毒：

a.将采集的嫩茎剪成4cm的茎段，种子剥去种皮，置于洁净的烧杯中，用洗洁精水浸泡30min，再用流水冲洗干净；

b.冲洗后的茎段和茎段以电场强度为10Kv/cm，脉冲宽度为35μs，脉冲频率为700Hz的PEF进行处理，其中，茎段处理时间为15s，种子处理时间为22s；

c.将处理后的茎段和种子置于超净工作台上，先用75％酒精浸泡45s，用无菌水漂洗5次，后用0.1％升汞浸泡13min，无菌水漂洗5次，每次1.5min。

3、配制培养基

(1)不定芽诱导培养基：其组成为：MS+6-BA 1.0mg/L+2,4-D 0.05mg/L+NAA0.2mg/L+琼脂6.5g/L+蔗糖25g/L；pH条件为5.8；于121℃101KPa灭菌20min制得。

(2)增殖培养基：其组成为：MS+2,4-D 2.0mg/L+NAA 1.5mg/L+IAA1.0mg/L+琼脂6.5g/L+蔗糖25g/L；pH条件为6.0；于121℃101KPa灭菌20min制得。

(3)种子萌发诱导培养基，其组成为：MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L+GA3 1.0mg/L+琼脂6.5g/L+蔗糖25g/L；pH条件为6.0；于121℃101KPa灭菌20min制得。

(4)愈伤组织诱导培养基：其组成为：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L+TDZ 1.0mg/L+琼脂6.5g/L+蔗糖25g/L；pH条件为5.9；于121℃101KPa灭菌20min制得。

(5)丛生芽诱导培养基：其组成为：WPM+6-BA 3.0mg/L+NAA2.0 mg/L+ZT 2.0mg/L+琼脂6.5g/L+蔗糖25g/L；pH条件为5.8；于121℃101KPa灭菌20min制得。

(6)生根培养基：其组成为：1/2MS+100mg/L维生素C+琼脂6.5g/L+蔗糖20g/L；pH条件为5.8；于121℃101KPa灭菌20min制得。

在此实施例中，不定芽诱导和种子萌发诱导所采用的生根培养基相同。

4、诱导培养：

(1)采用光皮桦带腋芽段及种子进行不定芽诱导：

a.接种：将消毒后的嫩茎、种子放入事先准备好的无菌培养皿中，用无菌滤纸吸干材料上残留的水分，再用无菌手术剪刀将茎段剪成2.5cm长的带腋芽段，接种到不定芽诱导培养基中诱导不定芽；种子直接吸干水分后直接接种于不定芽诱导培养基中；

b.诱导管理：培养室温度25℃，湿度75％，光照强度1900lx，每天光照时间11h，5d后可见不定芽萌发，不定芽诱导率为65％；13d即可长成长度大于1.0cm的不定芽，待不定芽长到2cm左右高时，转入增殖培养基中培养；

c.增殖培养：将不定芽苗切成1.5cm左右长的小段，接种于不定芽增殖培养基中诱导增殖。接种时将茎段竖直插入培养基中，达1.0cm，使之与培养基充分接触。培养室温度25℃，湿度75％，光照强度1900lx，每天光照时间11h，培养至第7天时添加浓度为23％的海藻糖溶液10ml，同时以频率为25kHz的超声波辐射处理12s，培养15d后，可见大量丛生芽长出，且不定芽长势良好，粗细均匀，增值率为40.9％；

d.生根培养：将丛生芽切成3cm左右高的单株，然后直立插入装有150mg/L的IBA无菌溶液中浸泡20min，插入深度为1.0cm，再接种至生根培养基中培养，接种时将茎段的下端插入培养基中达1.0cm，使之与培养基充分接触。17d后即可得光皮桦无菌苗，生根率为75.5％。其中，培养室温度25℃，湿度75％，先暗培养10天再转入光培养，光照强度1900lx，每天光照时间11h。

(2)采用种子进行萌发诱导培养：

a.接种：将消毒后的种子放入事先准备好的无菌培养皿中，用无菌滤纸吸干材料上残留的水分，然后接种到种子萌发诱导培养基中诱导种子萌发；

b.诱导管理：培养室温度25℃，湿度75％，光照强度1900lx，每天光照时间11h，15d以后可见种子萌发，长出2片子叶，种子萌发率为85.0％；待子叶长高到1cm左右时，转入愈伤组织诱导培养基中培养；

c.愈伤组织诱导培养：用无菌刀片将种子萌发产生的子叶以及膨大的胚组织分别切成长度为0.5cm左右，然后接种到愈伤组织诱导培养基中诱导愈伤组织分化。培养室温度2℃，湿度75％，光照强度1900lx，每天光照时间11h。5d以后可见绿色、紧密的愈伤组织，11d可长为1.0cm左右，出愈率为65.8％；待愈伤组织长大到2cm左右时，即可转入丛生芽诱导培养基中培养；

d.丛生芽诱导培养：用无菌刀片将愈伤组织切成0.5cm×0.5cm左右，接种到丛生芽诱导培养基中诱导不定芽。其中，培养室温度2℃，湿度75％，光照强度1900lx，每天光照时间11h。10d左右可丛生芽萌发，萌发率为70.5％；待丛生芽长高到3cm左右时，即可转入生根培养基中培养；

e.生根培养：将丛生芽切成3cm左右高的单株，将切好的丛生芽直立插入装有150mg/L的IBA无菌溶液中浸泡20min，插入深度为1.0cm，再接种至生根培养基中培养，接种时将茎段的下端插入培养基中达1.0cm，使之与培养基充分接触。22d后即可得光皮桦无菌苗，生根率为80.2％。其中，培养室温度25℃，湿度75％，先暗培养8天再转入光培养，光照强度1900lx，每天光照时间11h。

实施例2

在与实施例1的相同条件下，将各培养基更换为：

(1)不定芽诱导培养基：其组成为：MS+6-BA 2.0mg/L+2,4-D 0.05mg/L+NAA0.4mg/L+琼脂6.5g/L+蔗糖25g/L；pH条件为5.8；于121℃101KPa灭菌20min制得。

(2)增殖培养基：其组成为：MS+2,4-D 3.0mg/L+NAA 2.0mg/L+IAA 1.0mg/L+琼脂6.5g/L+蔗糖30g/L；pH条件为6.0；于121℃101KPa灭菌20min制得。

(3)种子萌发诱导培养基，其组成为：MS+6-BA 3.0mg/L+NAA 0.25mg/L+GA32.0mg/L+6.5g/L卡拉胶+25g/L蔗糖；pH条件为6.0；于121℃101KPa灭菌20min制得。

(4)愈伤组织诱导培养基：其组成为：MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.5mg/L+TDZ 1.0mg/L+6.5g/L卡拉胶+25g/L蔗糖；pH条件为5.9；于121℃101KPa灭菌20min制得。

(5)丛生芽诱导培养基：其组成为：WPM+BA 2.0mg/L+NAA 1.0mg/L+ZT 3.0mg/L+琼脂6.5g/L+蔗糖25g/L；pH条件为5.8；于121℃101KPa灭菌20min制得。

(6)生根培养基(不定芽诱导)：其组成为：1/2MS+120mg/L维生素C+琼脂6.5g/L+蔗糖20g/L；pH条件为5.8；于121℃101KPa灭菌20min制得。

(7)生根培养基(种子萌发诱导)：其组成为：2/3MS+50mg/L AgNO3+琼脂6.5g/L+蔗糖20g/L；pH条件为5.8；于121℃101KPa灭菌20min制得。

其中，在进行生根培养过程中，是将丛生芽切成3cm左右高的单株，然后直立插入装有180mg/L的IBA无菌溶液中浸泡18min后再接种至生根培养基中进行培养。

各阶段培养结果为：

(1)采用光皮桦带腋芽段及种子进行不定芽诱导：

不定芽诱导率为70.5％，增殖率为46.5％，生根率为85.0％。

(2)采用种子进行萌发诱导培养：

种子萌发率为82.0％，出愈率为70.0％，丛生芽萌发率为70.5％，生根率为83％。

实施例3

在与实施例1的相同条件下，将各培养基更换为：

(1)不定芽诱导培养基：其组成为：MS+6-BA 1.5mg/L+2,4-D 0.1mg/L+NAA 0.3mg/L+琼脂6.5g/L+蔗糖30g/L；pH条件为5.8；于121℃101KPa灭菌20min制得。

(2)增殖培养基：其组成为：MS+2,4-D 4.0mg/L+NAA 1.5mg/L+IAA 2.0mg/L+琼脂6.5g/L+蔗糖25g/L；pH条件为6.0；于121℃101KPa灭菌20min制得。

(3)种子萌发诱导培养基，其组成为：MS+6-BA 4.0mg/L+NAA 0.4mg/L+GA3 3.0mg/L+6.5g/L卡拉胶+25g/L蔗糖；pH条件为6.0；于121℃101KPa灭菌20min制得。

(4)愈伤组织诱导培养基：其组成为：MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.3mg/L+TDZ0.75mg/L+6.5g/L卡拉胶+30g/L蔗糖；pH条件为5.9；于121℃101KPa灭菌20min制得。

(5)丛生芽诱导培养基：其组成为：WPM+BA 5.0mg/L+NAA 3.0mg/L+ZT 1.0mg/L+琼脂6.5g/L+蔗糖30g/L；pH条件为5.8；于121℃101KPa灭菌20min制得。

(6)生根培养基(不定芽诱导)：其组成为：1/2MS+120mg/L维生素C+琼脂6.5g/L+蔗糖20g/L；pH条件为5.8；于121℃101KPa灭菌20min制得。

(7)生根培养基(种子萌发诱导)：其组成为：MS+100mg/L AgNO3+琼脂6.5g/L+蔗糖20g/L；pH条件为5.8；于121℃101KPa灭菌20min制得。

其中，在进行生根培养过程中，是将丛生芽切成3cm左右高的单株，然后直立插入装有190mg/L的IBA无菌溶液中浸泡17min后再接种至生根培养基中进行培养。

各阶段培养结果为：

(1)采用光皮桦带腋芽段及种子进行不定芽诱导：

不定芽诱导率为70.0％，增殖率为51.2％，生根率为88.0％。

(2)采用种子进行萌发诱导培养：

种子萌发率为82.3％，出愈率为72.0％，丛生芽萌发率为73.5％，生根率为86.0％。

需说明的是，在本申请中所使用的MS培养基，其成分均如下表所示：

MS基本成分表

一、筛选对比实验

1.1实验材料

实验1：本实验在与实施例1的同等条件下，在对外植体进行消毒时所采用的PEF电场强度为25Kv/cm，脉冲宽度为50μs，脉冲频率为1000Hz；

实验2：本实验在与实施例1的同等条件下，不进行PEF处理；

实验3：本实验在与实施例1的同等条件下，在进行促分化处理时将海藻糖溶液浓度更换为40％，其余条件与实施例1相同；

实验4：本实验在与实施例1的同等条件下，在进行促分化处理时将海藻糖溶液的添加量更换为25ml，其余条件与实施例1相同；

实验5：本实验在与实施例1的同等条件下，在进行促分化处理时不辅以超声波处理；

实验6：本实验在与实施例1的同等条件下，在进行促分化处理时将超声波的频率改为40kHz。

1.2实验方法

记录实验1-6组培各阶段的状态，统计各阶段时间，并与实施例1-3进行比较，其中，采用光皮桦带腋芽段及种子进行不定芽诱导的结果记录在表1中，采用种子进行萌发诱导培养的结果记录在表2中。

1.3实验结果

表1

由表1可知，实验1由于PEF处理参数过高，将光皮桦的细胞也一同破坏，导致无法进行组培。实验2在生根培养阶段的生根率较实施例低，且时间长，这可能是由于消毒时不够彻底从而影响其生根率。实验3将海藻糖溶液浓度增大后对植物细胞的渗透压造成了很大的破坏，导致生根率低，且培养至10天后再没有新的丛生芽生根。实验4将海藻糖溶液的添加量增大后，导致培养基液体过多，丛生芽易漂浮，无法与培养基充分接触，从而导致生根率较低且所需时间较长。实验6将超声波频率增大，导致细胞被破坏，几乎没有丛生芽生根，生根的丛生芽其根长也不超过5mm。

表2

注：由于采用种子进行萌发诱导培养的方法不进行促分化处理，因此在实验中无需进行实验3-6。

由表2可知，实验1由于PEF处理参数过高，将光皮桦的细胞也一同破坏，种子胚乳流出，导致无法发芽。实验2在可能由于消毒不够彻底，对种子的萌发率有影响，且在组培的各阶段生长速度均较慢。