一种菌种组合物、神曲的制备方法及其应用

技术领域

本申请涉及一种菌种组合物及其应用、神曲的制备方法及其应用，属于生物制品技术领域。

背景技术

六神曲(massa medicata fermentata，MMF)又名神曲、六曲，入药始载于唐代甄权所著的《药性论》：“化水谷宿食，癥结积滞，健脾暖胃”。现多由面粉、麦麸、赤小豆、青蒿、苍耳草、辣蓼、苦杏仁按一定比例发酵制成，是一味传统的消食类发酵中药，具有“消食调中、健脾和胃”的功效。神曲是中药成方制剂中的常用中药，具有广泛的临床应用。2015年版《中国药典》收载以神曲为主药治疗积食(胃肠道疾病)的成方制剂有41个，部颁标准中此类成方制剂更是多达104个。现如今市场上的神曲质量参差不齐，不同产地或同一产地不同厂家的神曲质量不稳定

单菌纯种发酵或多菌株协同发酵，经过菌种控制，降低了有害菌以及有毒的代谢产物，提高了六神曲的安全性和质量。马维维等以枯草芽孢杆菌与赛氏曲霉为发酵菌种优化六神曲协同发酵工艺，提高了产品蛋白酶和淀粉酶活力。自然发酵过程中微生物的种类和数量不易控制，造成产品批次间差异大，同时杂菌会产生有害的代谢产物，如黄曲霉素等。

发明内容

根据本申请的一个方面，提供一种菌种组合物，所述菌种组合物安全无害、均具有产蛋白酶和淀粉酶活力，可以共生，且可提高神曲酶活力，与已有的协同发酵使用的曲霉属真菌相比，酵母属真菌避免了真菌毒素的产生，更加安全。

一种菌种组合物，所述菌种组合物包括：扣囊腹膜孢酵母和枯草芽孢杆菌。

可选地，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌枯草亚种。

可选地，所述扣囊腹膜孢酵母和所述枯草芽孢杆菌的菌数比例为0.3～10:0.1～5。

可选地，所述扣囊腹膜孢酵母和所述枯草芽孢杆菌的菌数比例为0.3～5:0.2～2.5。

可选地，所述扣囊腹膜孢酵母和所述枯草芽孢杆菌的菌数比例为0.3～1：0.2～0.5。

根据本申请的另一个方面，提供上述任一项所述的菌种组合物在制备神曲中的应用。

根据本申请的另一个方面，提供一种神曲的制备方法，本申请针对神曲的传统发酵质量和安全性难以控制方面，提供了一种提高其安全性和质量的控制菌种协同发酵方法。扣囊腹膜孢酵母和枯草芽孢杆菌两个菌种均属于商品神曲中的有益菌、安全无害、均具有产蛋白酶和淀粉酶活力，与已有的协同发酵使用的曲霉属真菌相比，酵母属真菌避免了真菌毒素的产生，更加安全。

所述制备方法包括以下步骤：

将菌种组合物在基质中发酵，获得所述神曲；

所述菌种组合物选自上述任一项所述的菌种组合物。

可选地，所述制备方法包括以下步骤：

将含有扣囊腹膜孢酵母的菌种液I和含有枯草芽孢杆菌的菌种液II接种于所述基质，发酵，获得所述神曲。

可选地，所述基质包括以下组分：

A:赤小豆粉；

B:苦杏仁粉；

C:面粉；和

D:青蒿、辣蓼和苍耳草的水煎液。

可选地，所述A:B:C:D的比例为：

24～92g:24～92g:600～2400g:200～800mL。

可选地，所述青蒿、辣蓼和苍耳草的水煎液的制备步骤如下：

在含有青蒿干品、辣蓼干品和苍耳草干品的混合物I中加入水，煎煮，得到所述青蒿、辣蓼和苍耳草的水煎液。

可选地，所述青蒿干品、所述辣蓼干品和所述苍耳草干品的质量比为1:1:1；

所述水与所述混合物I质量比为的8～12:1；

所述煎煮为煮沸10～20min。

可选地，将煎煮得到的液体浓缩至所加入水的体积的50～60％，获得所述青蒿、辣蓼和苍耳草的水煎液。

可选地，所述发酵的条件包括：发酵温度为30～35℃。

可选地，所述发酵温度为33～35℃。

可选地，所述发酵温度为30～33℃。

可选地，所述发酵的条件包括：发酵湿度为70～80％，发酵时间为4天以上。

可选地，所述发酵湿度为75～80％。

可选地，所述发酵时间为4～6天。

可选地，所述菌种液I的OD

所述菌种液I和所述菌种液II的体积比为1～10:1～10。

可选地，所述菌种液I的OD

可选地，所述菌种液I的OD

所述菌种液II的OD

可选地，所述菌种液I和所述菌种液II的体积之和与所述基质质量的比值为0.2～0.5mL/g。

可选地，所述菌种液I和所述菌种液II的体积之和与所述基质质量的比值上限选自0.3、0.4或0.5；下限选自0.2、0.3或0.4。

根据本申请的另一个方面，提供一种神曲，所述神曲根据上述任一项所述的制备方法制备得到。

根据本申请的另一个方面，提供根据上述任一项所述的制备方法制备得到的神曲或上述任一项所述的神曲中的至少一种在制备消食产品中的应用。

根据本申请的另一个方面，提供一种消食产品，所述消食产品包括上述任一项所述的制备方法制备得到的神曲或上述任一项所述的神曲中的至少一种。

可选地，所述消食产品的剂型选自胶囊剂、丸剂、片剂、散剂或液体制剂中的任一种。

可选地，所述消食产品选自药品、保健食品或食品中的任一种。

为实现本申请的目的，本申请采用的技术方案如下：

1.配制培养基：取酵母浸出粉胨葡萄糖肉汤培养基(胨1％，酵母浸出粉0.5％，葡萄糖2％)3.5g加去离子水配成100mL；取酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基(胨1％，酵母浸出粉0.5％，葡萄糖2％，琼脂1.4％)4.9g加去离子水配成100mL；取营养肉汤(胨1％，牛肉浸出粉0.3％，氯化钠0.5％)1.8g加去离子水配成100mL；取营养琼脂(蛋白胨1％,氯化钠0.5％，牛肉膏粉0.3％，琼脂1.5％)3.3g加去离子水配成100mL。

2.接种两菌菌种：

本申请的发明人经过实验研究，扣囊腹膜孢酵母和枯草芽孢杆菌枯草亚种协同发酵可以共生，且提高神曲酶活力，这也是本申请的关键之一。

能够实现本发明目的的菌株有：

(1)扣囊腹膜孢酵母Saccharomycopsis fibuligera(编号：33177，购于中国工业微生物菌种保藏管理中心)

(2)枯草芽孢杆菌枯草亚种Bacillus subtilis subsp.Subtilis(编号：24341，购于中国工业微生物菌种保藏管理中心)。

3.将固体培养基灭菌后趁热倒入无菌培养皿中，冷却后密封备用，之后30℃和37℃分别复融冻存的两个液体菌种，在两个温度下培养24h，培养湿度为75％RH。

4.将液体培养基灭菌后，接入上述固体菌种，于30℃和37℃分别以130rpm/min振荡培养，优选培养时间约为10h，过程中动态监测菌液的OD值：扣囊腹膜孢酵母达到0.5，枯草芽孢杆菌达到0.3备用。

5.固体基质的制备：

(1)取赤小豆、苦杏仁粗粉各48g，与面粉1200g混匀。

(2)加入青蒿、辣蓼、苍耳草水煎液，搅拌均匀。制成握之成团、掷之即散的软材。

青蒿、辣蓼、苍耳草水煎液水煎液的制备：青蒿、辣蓼、苍耳草均为干品，各27.6g，加入8倍量的水(662.4mL)煎煮，待煮沸10min后，滤液浓缩至约400mL。

(3)将制成的软材分装至小烧杯中，压实，进行高压灭菌，灭菌后备用。

6.发酵神曲

将菌液撒在灭菌好的基质上，用封口膜封好，置于33℃，75％RH恒温恒湿箱中培养。优选培养时间为4天以上。

7.将发酵后的神曲置于表明皿中，与烘箱中55℃低温烘干，贮存，备用。

用上述方法制备的神曲或其粗提取物，可以按照常规的药物制备工艺，直接制成各种制剂，例如：胶囊剂，丸剂，片剂或液体制剂等，用于药品、保健药品、和食品添加剂等领域。制备制剂时，可以加入常规的赋形剂，矫味剂等。

本申请中，“协同发酵”，是指使用两种及以上的菌种进行发酵；

“OD

本申请能产生的有益效果包括：

1)本申请所提供的菌种组合，安全无害、均具有产蛋白酶和淀粉酶活力，可以共生，且可提高神曲酶活力，与已有的协同发酵使用的曲霉属真菌相比，酵母属真菌避免了真菌毒素的产生，更加安全。

2)本申请所提供的神曲的制备方法，通过选用恰当的菌种组合协同发酵，同时，结合适宜的培养温度，可以获得高质量的神曲。

3)本申请所提供的神曲，具有消食，改善胃肠功能紊乱，调节肠道菌群以及肠道微生态的作用，与传统自然发酵神曲相比，经过菌种控制提高了神曲的安全性和质量，具有良好的作为消食产品的应用前景。

具体实施方式

下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。

如无特别说明，本申请的实施例中的原料均通过商业途径购买。

实施例1

(1)制备平板：

培养基I：取酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基(胨1g，酵母浸出粉0.5g，葡萄糖2g，琼脂1.4g)4.9g加去离子水配成100mL；

培养基II：取营养琼脂(蛋白胨1g，氯化钠0.5g，牛肉膏粉0.3g，琼脂1.5g)3.3g加去离子水配成100mL。

以上两种培养基高压蒸汽灭菌(100kPa，121℃，20min)。灭菌后的培养基在超净台趁热倒入无菌的平板培养皿中，密封冷却，备用。

(2)培养基I和培养基II制备得到的两种平板培养基分别接种扣囊腹膜孢酵母(Saccharomycopsis fibuligera)，保藏号为CICC No.33177；枯草芽孢杆菌枯草亚种(Bacillus subtilis subsp.Subtilis)，保藏号为CICC No.24341。接种后分别于30℃，75％RH培养24h。

(3)液体菌液培养液：

培养液I：取酵母浸出粉胨葡萄糖肉汤培养基(胨1g，酵母浸出粉0.5g，葡萄糖2g)3.5g加去离子水配成100mL；

培养液II：取营养肉汤(胨1g，牛肉浸出粉0.3g，氯化钠0.5g)1.8g加去离子水配成100mL。两个培养基高压蒸汽灭菌(121℃，20min)，冷却备用。

(4)用接种环将(2)中的菌刮下接种到(3)中的培养液中，其中培养液I接种扣囊腹膜孢酵母，培养液II接种枯草芽孢杆菌枯草亚种，分别于30℃和37℃以130rpm/min振荡培养，培养时间为10h，过程中动态监测菌液的OD

(5)固体基质的制备：取赤小豆粗粉、苦杏仁粗粉各48g，与面粉1200g混匀。加入青蒿、辣蓼、苍耳草水煎液，搅拌均匀。制成握之成团、掷之即散的软材。

青蒿、辣蓼、苍耳草水煎液的制备：青蒿、辣蓼、苍耳草均为干品，各27.6g，加入8倍量的水(662.4mL)煎煮，待煮沸10min后，滤液浓缩至约400mL。

将制成的软材分装至小烧杯中，压实，进行高压灭菌，灭菌后备用。

(6)将菌液按照0.4mL/g(菌液体积与基质质量的比值，单位mL/g)的接种量接种量接种，以枯草芽孢杆菌菌液：扣囊腹膜孢酵母菌菌液体积比＝4:1的比例撒在灭菌好的基质上，用封口膜封好，置于33℃，75％RH恒温恒湿箱中培养5d。

(7)将培养物低温50～55℃烘干，制得本发明的协同发酵神曲。

(8)将神曲粉碎至60～100目，作为药品或保健食品的原料。

实施例2

与实施例1区别仅在于：

在步骤(6)中，将菌液按照0.5mL/g(菌液体积与基质质量的比值，单位mL/g)接种量接种，以枯草芽孢杆菌菌液：扣囊腹膜孢酵母菌菌液体积比＝4:1的比例撒在灭菌好的基质上，用封口膜封好，置于33℃，75％RH恒温恒湿箱中培养5d。

实施例3

与实施例1区别仅在于：

在步骤(6)中，将菌液按照0.2mL/g(菌液体积与基质质量的比值，单位mL/g)接种量接种，以枯草芽孢杆菌菌液：扣囊腹膜孢酵母菌菌液体积比＝4:1的比例撒在灭菌好的基质上，用封口膜封好，置于33℃，75％RH恒温恒湿箱中培养5d。

实施例4

与实施例1区别仅在于：

在步骤(6)中，将菌液按照0.4mL/g(菌液体积与基质质量的比值，单位mL/g)接种量接种，以枯草芽孢杆菌菌液：扣囊腹膜孢酵母菌菌液体积比＝5:1的比例撒在灭菌好的基质上，用封口膜封好，置于33℃，75％RH恒温恒湿箱中培养5d。

实施例5

与实施例1区别仅在于：

在步骤(6)中，将菌液按照0.4mL/g(菌液体积与基质质量的比值，单位mL/g)接种量接种，以枯草芽孢杆菌菌液：扣囊腹膜孢酵母菌菌液体积比＝1:5的比例撒在灭菌好的基质上，用封口膜封好，置于33℃，75％RH恒温恒湿箱中培养5d。

实施例6

与实施例1区别仅在于：

在步骤(6)中，将菌液按照0.4mL/g(菌液体积与基质质量的比值，单位mL/g)接种量接种，以枯草芽孢杆菌菌液：扣囊腹膜孢酵母菌菌液体积比＝1:1的比例撒在灭菌好的基质上，用封口膜封好，置于33℃，75％RH恒温恒湿箱中培养5d。

实施例7

与实施例1区别仅在于：

在步骤(6)中，将菌液按照0.4mL/g(菌液体积与基质质量的比值，单位mL/g)，以枯草芽孢杆菌菌液：扣囊腹膜孢酵母菌菌液体积比＝4:1的比例撒在灭菌好的基质上，用封口膜封好，置于30℃，75％RH恒温恒湿箱中培养5d。

实施例8

与实施例1区别仅在于：

在步骤(6)中，将菌液按照0.4mL/g(菌液体积与基质质量的比值，单位mL/g)接种量接种，以枯草芽孢杆菌菌液：扣囊腹膜孢酵母菌菌液体积比＝4:1的比例撒在灭菌好的基质上，用封口膜封好，置于35℃，75％RH恒温恒湿箱中培养5d。

实施例9

与实施例1区别仅在于：

步骤(6)中将菌液按照0.4mL/g(菌液体积与基质质量的比值，单位mL/g)的接种量接种量接种，以枯草芽孢杆菌菌液：扣囊腹膜孢酵母菌菌液体积比＝4:1的比例撒在灭菌好的基质上，用封口膜封好，置于33℃，75％RH恒温恒湿箱中培养4d。

实施例10

与实施例1区别仅在于：

步骤(6)中将菌液按照0.4mL/g(菌液体积与基质质量的比值，单位mL/g)的接种量接种量接种，以枯草芽孢杆菌菌液：扣囊腹膜孢酵母菌菌液体积比＝4:1的比例撒在灭菌好的基质上，用封口膜封好，置于33℃，75％RH恒温恒湿箱中培养6d。

实施例11

与实施例1区别仅在于：

步骤(3)中，取酵母浸出粉胨葡萄糖肉汤培养基(胨2g，酵母浸出粉2g，葡萄糖1g)5g加入加去离子水配成100mL；

取营养肉汤培养基(胨1g，牛肉浸出粉0.5g，氯化钠0.5g)2g加入去离子水配成100mL。

实施例12

与实施例1区别仅在于：

步骤(8)中，将10神曲粉碎成细粉，再加入20mL45％乙醇为润湿剂，制成软材，过14目镀锌铁丝筛制粒，湿粒于60℃～70℃干燥。计算片重，加入0.1g硬脂酸镁，充分混匀后压片，作为药品或保健食品。

实施例13

与实施例1区别仅在于：

步骤(8)中：取神曲5g，粉碎成细粉，过九号筛作为散剂。

实施例14

1、蛋白酶活力的测定

(1)测定样品：采用实施例1的方法制备得到的神曲(批次为I～VI)、购买于北京太阳树康中药饮片厂(批次为s1-s6)的神曲。

(2)测定方法：福林酚比色法

福林酚工作液:由COOLABER(酷来搏)生产，产品货号SL1090-50mL。

蛋白酶活力是指：以每分钟每克六神曲样品中酶催化作用下产生的酪氨酸的质量表示,即μg·min

粗酶液制备：称取粉碎过18目筛神曲粉末2.5g置于50mL具塞锥形瓶中，加水25mL，在40℃下摇床(110rpm·min

蛋白酶活力测定：采用福林酚比色法。粗酶液及酪蛋白溶液于40℃分别预热5min，各吸取1mL至10mL离心管中，40℃精确保温反应10min，立即加入10％三氯乙酸2.5mL，40℃保温30min以终止反应，使残余蛋白质沉淀后离心(12000rpm·min

(3)结果分析：

标准曲线的绘制：精密称取酪氨酸0.01994g，加入1mL10％HCl使溶解，加水定容至100mL，得到酪氨酸标准溶液。取6只10mL具塞比色管，分别加入0、1、2、4、6、7mL酪氨酸标准溶液，加水至刻度(10mL)，获得不同浓度的酪氨酸溶液，另取6只10mL离心管，编号1-6，依次加入上述不同浓度的酪氨酸溶液1mL，再分别加0.4mol·L

将上述得到的OD值通过标准曲线计算其蛋白酶活力。

北京太阳树康中药饮片厂(批次为s1-s6)的神曲蛋白酶活力范围为：51.521～223.630ug/min/g，采用本申请实施例1的方法制备的神曲(批次为I～VI)的蛋白酶活力范围为：1107.669～1134.935ug/min/g。具体结果详见表1。

表1商品神曲和自制神曲不同批次蛋白酶活力(n＝3)

由上结果可知，本申请所提供的神曲的制备方法，得到的神曲的酶活力始终保持在1000ug/min/g以上，且批次间酶活力稳定。

本申请所提供的神曲的蛋白酶活力远高于商品神曲的蛋白酶活力，具有良好的消食产品的应用前景。

2、淀粉酶活力测定

测定样品：采用实施例1的方法制备得到的神曲(批次为I～VI)

测定方法：DNS比色法

DNS试剂：由Solarbio(索莱宝)生产，产品货号D7800-100mL。

淀粉酶活力是指：以每分钟每克六神曲样品中酶催化作用下产生的麦芽糖的质量表示,即mg·min

粗酶液制备：称取粉碎过18目筛神曲粉末2.5g置于50mL具塞锥形瓶中，加水25mL，在40℃下摇床(110rpm·min

淀粉酶活力测定：采用DNS比色法。取2支20mL具塞试管，编号1～2，每支试管加入0.4mL粗酶液。1号试管加入DNS试剂0.8mL，之后将2支试管和1％淀粉溶液分别置于40℃恒温水浴保温10min，之后每支试管加入1％淀粉溶液0.4mL，40℃水浴下准确保温反应5min，冰水浴2min终止反应，取出，在2号中加入DNS试剂0.8mL，摇匀各试管，置沸水浴中煮沸5min，取出后迅速冷却，加水至20mL，摇匀。各吸取200μL反应液于96孔酶标板，在540nm波长处测定光密度OD值。重复点3个孔，取平均值，计算酶活力。1号试管为对照。

结果分析：

标准曲线的绘制：精密称取麦芽糖0.10000g，加水使之溶解，继续加水定容至100mL容量瓶中，得到麦芽糖标准溶液(1mg·mL

将上述得到的OD值通过标准曲线计算其淀粉酶活力。

采用本申请实施例1的方法制备的神曲(批次为I～VI)的淀粉酶活力范围为6.015～6.722mg/min/g，具体结果详见表2，表明本申请所提供的神曲的制备方法，所得的产品淀粉酶活性高，且批次间酶活稳定，得到的神曲的淀粉酶活力始终保持在6mg/min/g以上。

表2自制神曲不同批次淀粉酶活力(n＝3)

以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。