GRPEL1突变基因、检测其的引物、试剂盒和方法以及其用途

技术领域

本发明涉及疾病相关突变基因，具体涉及GRPEL1突变基因、检测其的引物、试剂盒和方法以及其用途。

背景技术

在所有遗传性代谢疾病中，线粒体疾病的发病率最高。线粒体主要负责氧化磷酸化产生三磷酸腺苷。线粒体疾病的发病机制涉及两种不同的基因组：核基因组和母体遗传的16.6kb线粒体基因组。线粒体疾病可由这些基因组中的任何一个突变引起的。核DNA(nDNA)的缺陷会导致诸如呼吸链复杂结构、翻译和线粒体DNA(mtDNA)修复缺陷等问题。在儿童时期诊断的线粒体疾病中，大约25％是由于线粒体DNA异常引起的，而其余75％是由于nDNA缺陷引起的。严重的新生儿或婴儿起病的线粒体疾病通常会导致出生后一年内死亡，婴儿致死性线粒体疾病(lethal infantile mitochondrial disease,LIMD)约占儿童期起病线粒体疾病病例的8.5％，但LIMD的分子遗传诊断率很低，大多数LIMD病例是在受试者死亡后通过生物化学和遗传方法才得到诊断。因此，当父母再次怀孕时，这类新生儿发病的严重线粒体疾病由于诊断不及时，还有可能再次发生。虽然已发现近千种核基因组基因与线粒体的功能有关，仅仅有少部分确定与LIMD的发生有关，提示存在新的LIMD致病基因有待挖掘。

发明内容

本发明的目的在于提供一种与婴儿致死性线粒体疾病有关的GRPEL1突变基因、检测其的引物、试剂盒和方法以及其用途。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种突变GRPEL1基因或突变GRPEL1蛋白，所述突变GRPEL1基因与人类基因组参考序列GRCh37相比具有以下突变中的至少一种：

4号染色体物理位置为7064181的碱基由G突变为A、4号染色体物理位置为7062820的碱基由A突变为C；

所述突变GRPEL1基因的cDNA序列与SEQ ID NO.1的序列相比具有如下突变中的至少一种：

c.238C>T、c.423T>G；

所述突变GRPEL1蛋白的序列与SEQ ID NO.2的序列相比具有以下突变中的至少一种：

p.Arg80Ter(80位精氨酸突变为终止密码子)、p.Tyr141Ter(141位酪氨酸突变为终止密码子)。

GRPE-LIKE 1,MITOCHONDRIAL(线粒体GRPE样蛋白1，GRPEL1)基因位于4号染色体4p16.1位置，该基因含有4个外显子，其编码的GRPEL1蛋白有217个氨基酸，分子量约为24KDa。GRPEL1是线粒体PAM复合物的重要组成部分，该复合物用于将含有转运肽的蛋白质以ATP依赖的方式从内膜转移到线粒体基质中，GRPEL1控制线粒体HSP70与底物蛋白以核苷酸依赖结合。目前GRPEL1与疾病的相关性未见报道。

野生型GRPEL1基因在Ensemble数据库(www.ensembl.org)中的基因编码为ENSG00000109519，该基因位于4号染色体。发明人在大量正常人和LIMD患者家系中利用遗传学研究筛选发现GRPEL1基因发生基因突变可以导致婴儿致死性线粒体疾病。本发明提供了新的致病基因的致病突变位点，为该疾病的早期分子筛查提供了新的分子生物学基础。

上述第一种突变、第二种突变均位于翻译区，其中第一种突变的物理位置为7064181，碱基G突变为A；RNA水平：GRPEL1基因的cDNA序列第238位碱基由C突变为T；蛋白水平：GRPEL1基因编码蛋白第80位氨基酸由精氨酸突变为终止密码子。

第二种突变的物理位置为7062820，碱基由A突变为C，RNA水平：GRPEL1基因的cDNA序列第423位碱基由T突变为G；蛋白水平：GRPEL1基因编码蛋白第141位氨基酸由酪氨酸突变为终止密码子。

一种检测突变GRPEL1基因或突变GRPEL1蛋白的方法，所述方法用于非诊断目的，所述方法包括检测GRPEL1基因或GRPEL1蛋白中是否存在突变位点；突变位点为如下至少一种：

Chr4(GRCh37):g.7064181G>A，cDNA序列发生c.238C>T，p.Arg80Ter(80位精氨酸突变为终止密码子)；

Chr4(GRCh37):g.7062820A>C，cDNA序列发生c.423T>G，p.Tyr141Ter(141位酪氨酸突变为终止密码子)。

在一些实施方案中，本发明中所述的非诊断疾病的目的包括但不限于研究SNP分布和多肽性，用于家族演化研究。这样的应用是本领域技术人员可以理解的。

有些个体携带本发明的突变GRPEL1基因但不患LIMD，例如仅一条染色体携带所述突变的杂合基因型。对这部分人群的检测可以不涉及任何诊断疾病的目的，因为这些个体本身并不患病。但对于他们进行检测的结果可以作为有用的信息使用，例如作为育前检查的重要指标，指导生育，或者用于突变携带者筛查，或者作为SNP分布和多态性研究的工具或者追踪基因突变或家族演化。这样的应用也是本领域技术人员可以理解的。因此，本发明提供的检测突变GRPEL1基因或突变GRPEL1蛋白的方法涉及检测杂合突变。

但本发明提供的检测突变GRPEL1基因或突变GRPEL1蛋白的方法也包括检测纯合突变。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述检测突变GRPEL1基因或突变GRPEL1蛋白的方法包括利用如下至少一组引物进行PCR扩增的步骤：

GRPEL1_E3F:CCGTTTTCCAATCAAGCTCGC(SEQ ID NO:3)和

GRPEL1_E3R:CACTTCCGTATGCATGGCCT(SEQ ID NO:4)；

GRPEL1_E4F:CGTGCTCCCTGGGTGACTT(SEQ ID NO:5)和

GRPEL1_E4R:GGTGACGGGCTAAATACGC(SEQ ID NO:6)。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述采用引物进行扩增的PCR反应程序包括：94-100℃，1-10min；94-95℃，3-5min，95-96℃，25-30s，58-60℃，25-30s，循环30-40次，70-72℃，1-10min。

检测突变GRPEL1基因的方法包括如下步骤：

(1)建立LIMD患者家系临床与遗传资源库，收集LIMD家系的临床信息与血液样本，提取基因组DNA；

(2)设计覆盖GRPEL1基因全外显子序列的扩增和测序引物进行测序；

(3)比对正常人和LIMD患者家系样本的测序结果。

在其中一种实施方式中，上述序列测定是Sanger序列测定。

在其他实施方式中，上述检测突变GRPEL1基因的方法还可以选自如下的技术进行：

电泳、核酸杂交、原位杂交、PCR、逆转录酶链反应和变性高效液相色谱。

在其他实施方式中，还涉及检测GRPEL1基因外显子和外显子/内含子边界突变的方法，其包括如下步骤：

(1)从受试者提取DNA样本；

(2)对上述DNA样品的外显子组和所有外显子/内含子边界序列进行测序得到测序片段；

(3)将上述测序片段与参考序列比对，得到基因外显子和外显子/内含子边界突变。

一种检测突变GRPEL1基因的试剂，所述试剂为核酸检测探针或引物；

所述核酸检测探针与突变GRPEL1基因互补；所述突变GRPEL1基因与人类基因组参考序列GRCh37相比具有以下突变中的至少一种：

4号染色体物理位置为7064181的碱基由G突变为A、4号染色体物理位置为7062820的碱基由A突变为C；

所述突变GRPEL1基因的cDNA序列与SEQ ID NO.1的序列相比具有如下突变中的至少一种：

c.238C>T、c.423T>G；

所述核酸检测探针与突变GRPEL1基因互补的区域包括选自如下至少一种的物理位置或cDNA序列位置：

物理位置第7064181位、第7062820位；cDNA序列第238位、第423位；

所述引物为具有如下序列的至少一组引物：

GRPEL1_E3F:CCGTTTTCCAATCAAGCTCGC(SEQ ID NO:3)和

GRPEL1_E3R:CACTTCCGTATGCATGGCCT(SEQ ID NO:4)；

GRPEL1_E4F:CGTGCTCCCTGGGTGACTT(SEQ ID NO:5)和

GRPEL1_E4R:GGTGACGGGCTAAATACGC(SEQ ID NO:6)。

核酸检测探针通过与突变GRPEL1基因的互补区核酸配对从而实现突变GRPEL1基因的检测。

在其他实施方式中，检测突变GRPEL1基因的试剂还包括缓冲液，酶，无机盐。

采用检测突变GRPEL1基因的引物对模板DNA进行扩增，通过测序或凝胶电泳对扩增产物进行突变鉴定。

一种检测突变GRPEL1基因的试剂盒，它包括所述的试剂。

在其他实施方式中，上述检测突变GRPEL1基因的试剂盒还包括缓冲液、使用说明书。

一种检测突变GRPEL1基因或突变GRPEL1蛋白的试剂在制备婴儿致死性线粒体疾病检测试剂中的应用；

所述婴儿致死性线粒体疾病检测试剂为基因芯片用试剂、DNA扩增用试剂、反转录扩增用试剂、限制性内切酶酶切方法用试剂或测序用试剂。

基因芯片用试剂可以是cDNA芯片用探针。

DNA扩增用试剂可以是引物，探针。

反转录扩增用试剂可以是反转录扩增引物，反转录扩增缓冲液。

限制性内切酶酶切方法用试剂可以是含限制性内切酶位点的引物，无缝克隆缓冲液。

测序用试剂可以是引物，检测缓冲液。

一种检测突变GRPEL1基因的试剂在婴儿致死性线粒体疾病早期分子筛查中的应用，该应用为非疾病的诊断目的。

一种检测突变GRPEL1基因的试剂盒在婴儿致死性线粒体疾病早期分子筛查中的应用，该应用为非疾病的诊断目的。

较之现有技术而言，本发明的优点在于：

本发明提供了一种GRPEL1突变基因、检测其的试剂、引物、试剂盒和方法以及其用途，创造性的挖掘出一种LIMD致病基因GRPEL1，并提供了GRPEL1突变基因位点，这为婴儿致死性线粒体疾病的早期分子筛查、家族遗传研究、遗传咨询提供了重要的依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为家系图；

图2为GRPEL1突变序列的高通量测序图。

图3为GRPEL1突变序列的Sanger测序图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例对多个婴儿致死性线粒体疾病(lethal infantile mitochondrialdisease,LIMD)患者的家系进行全外显子组高通量测序检测，其包括如下依次进行的步骤：

(1)样本收集和基因组DNA的提取。

收集家系成员的临床资料以及血液样本(EDTA抗凝)，样本为送检至福瑞医学检验实验室有限公司的血液样本。

根据血液DNA提取试剂盒(Magen,HiPure Blood&Tissue DNA Kit)的说明书步骤提取家系各成员的血液基因组DNA。使用Nanodrop one测量DNA的纯度，所得基因组DNA的OD260nm/OD280nm均位于1.7-2.0之间，使用Nanodrop one测量DNA的浓度，所得基因组DNA的浓度为50-100ng/μL，总量为5-10μg。置于-20℃保存。

(2)外显子组测序和生物信息学分析。

为了找到LIMD其他的致病基因，我们应用外显子组测序筛选1个LIMD家系中潜在的遗传变异(家系图参照图1所示)，而从现有已知的LIMD致病基因检测中并没有发现病理变异。

外显子组测序是在先证者身上进行。简而言之，将基因组DNA片段化，并通过使用KAPA公司的试剂盒(KAPA HyperPlus Library Preparation Kit)对基因组DNA进行酶切片段化、末端修复、3'末端加A、链接接头和PCR扩增；采用IGT公司的文库构建试剂盒(xGenExome Research Panel v2)捕获外显子区域。在Novaseq测序仪(Illumina，圣地亚哥，CA，美国)上对文库进行测序(测序深度为150X)。使用Novocraft NovoAlign将NGS测序结果和人类参考基因组UCSC NCBI37/hg19进行比对，获得比对到基因组上的唯一比对序列。利用VarScan mpileup2snp和VarScan mpileup2indel检测确定靶区域的变异。利用Remove RunCommon Variants和Remove Global Common Variants软件用来去除dbSNP和ExAC数据库中的常见变异。然后利用Interactive Biosoftware Alamut Batch对变异进行注释。注释用到的数据库包括：dbSNP、ExAC、1000g、ClinVar、OMIM等。利用filterAlamut.py将注释后的变异按照High，Medium，Low排序。在High和Medium分组中，给予变异一个优先级值和分级理由。所有的变异最初都在Low组别中，当一个变异符合某些标准时，则可以被划分为更高级别的变异。并利用FATHMM、FATHMMMKL、METALR、METASVM、MUTATIONASSESSOR、MUTATIONTASTERAGVGD、AGVGD、LRT,PROVEAN、SIFT软件进行SNP功能预测。

通过对图1中的1个LIMD家系GRPEL1基因的全外显子测序和生物信息学分析后，我们发现了先证者携带2个复合杂合突变，突变测序结果的BAM文件参照图2所示，所述的GRPEL1基因在Ensemble数据库(www.ensembl.org)中的基因编码为ENSG00000109519，其中突变GRPEL1 p.Arg80Ter，物理位置为7064181的碱基由G突变为A；RNA水平：GRPEL1基因编码RNA第238位碱基由C突变为T；蛋白水平：GRPEL1基因编码蛋白第80位氨基酸由精氨酸突变为终止密码子；突变GRPEL1 p.Tyr141Ter，物理位置为7062820的碱基由A突变为C；RNA水平：GRPEL1基因编码RNA第423位碱基由T突变为G；蛋白水平：GRPEL1基因编码蛋白第141位氨基酸由酪氨酸突变为终止密码子；并未发现其他可疑的致病基因的突变位点。

上述GRPEL1基因的突变p.Arg80Ter、p.Tyr141Ter未被gnomAD等正常人群数据库收录，将导致先证者GRPEL1蛋白功能的完全丧失，严重影响GRPEL1蛋白的生理功能。根据已知生物学功能结果，与先证者LIMD的临床症状高度相符。

根据我们所设计的筛选流程，借助于高通量深度测序及生物信息学分析，我们成功发现GRPEL1基因为LIMD新致病基因，突变p.Arg80Ter、p.Tyr141Ter为该疾病新的致病位点。

(3)Sanger测序验证，鉴定突变基因。

Sanger测序用于验证外显子测序检测出的GRPEL1基因的2个突变：c.238C>T、c.423T>G(参照图3所示)。采用Primer 3引物设计软件设计引物序列SEQ ID NO.3～SEQ IDNO.6，该引物序列扩增包含GRPEL1基因突变位点在内的基因组DNA片段。

PCR扩增体系(20μl)包括：PCR 5×buffer mix 10μl，正向引物(10μmol)1μl，与正向引物对应的反向引物(10μmol)1μl，ddH

综上，本发明鉴定出的突变GRPEL1基因可用于LIMD患者早期临床筛查，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 福州福瑞医学检验实验室有限公司

<120> GRPEL1突变基因、检测其的引物、试剂盒和方法以及其用途

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 654

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 1

atggcggctc agtgcgtgag gttggcgcgg cgcagtcttc ctgctttggc gttgtctctc 60

aggccatctc cccggttgtt gtgcacagcc acgaaacaaa agaacagtgg ccagaacctg 120

gaagaggaca tgggtcagag tgaacagaag gcagatcctc ctgctacaga gaagaccctc 180

ctggaagaga aggtcaagtt ggaggaacag ctgaaggaga ctgtggaaaa atataaacga 240

gctttggcag acactgagaa cttacggcag aggagccaga aattggtgga ggaggcaaaa 300

ttatacggca ttcaagcctt ctgcaaggac ttgttggagg tggcagacgt tctggagaag 360

gcaacacagt gtgttccaaa agaagaaatt aaagacgata accctcacct gaagaacctc 420

tatgaggggc tggtcatgac tgaagtccag atccagaagg tgttcacaaa gcatggcttg 480

ctcaagttga accctgtcgg agccaagttc gacccttatg aacatgaggc cttgttccac 540

acaccggttg aggggaagga gccaggcaca gtggccctag ttagcaaagt ggggtacaag 600

ctgcatgggc gcactctgag acccgccctg gtgggggtgg tgaaggaagc ttag 654

<210> 2

<211> 217

<212> PRT

<213> 人(human)

<400> 2

Met Ala Ala Gln Cys Val Arg Leu Ala Arg Arg Ser Leu Pro Ala Leu

1 5 10 15

Ala Leu Ser Leu Arg Pro Ser Pro Arg Leu Leu Cys Thr Ala Thr Lys

20 25 30

Gln Lys Asn Ser Gly Gln Asn Leu Glu Glu Asp Met Gly Gln Ser Glu

35 40 45

Gln Lys Ala Asp Pro Pro Ala Thr Glu Lys Thr Leu Leu Glu Glu Lys

50 55 60

Val Lys Leu Glu Glu Gln Leu Lys Glu Thr Val Glu Lys Tyr Lys Arg

65 70 75 80

Ala Leu Ala Asp Thr Glu Asn Leu Arg Gln Arg Ser Gln Lys Leu Val

85 90 95

Glu Glu Ala Lys Leu Tyr Gly Ile Gln Ala Phe Cys Lys Asp Leu Leu

100 105 110

Glu Val Ala Asp Val Leu Glu Lys Ala Thr Gln Cys Val Pro Lys Glu

115 120 125

Glu Ile Lys Asp Asp Asn Pro His Leu Lys Asn Leu Tyr Glu Gly Leu

130 135 140

Val Met Thr Glu Val Gln Ile Gln Lys Val Phe Thr Lys His Gly Leu

145 150 155 160

Leu Lys Leu Asn Pro Val Gly Ala Lys Phe Asp Pro Tyr Glu His Glu

165 170 175

Ala Leu Phe His Thr Pro Val Glu Gly Lys Glu Pro Gly Thr Val Ala

180 185 190

Leu Val Ser Lys Val Gly Tyr Lys Leu His Gly Arg Thr Leu Arg Pro

195 200 205

Ala Leu Val Gly Val Val Lys Glu Ala

210 215

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccgttttcca atcaagctcg c 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cacttccgta tgcatggcct 20

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgtgctccct gggtgactt 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggtgacgggc taaatacgc 19