牙鲆卵原干细胞培养液及牙鲆卵原干细胞体外培养方法及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种牙鲆卵原干细胞培养液及牙鲆卵原干细胞体外培养方法及应用。

背景技术

鱼类卵原干细胞(Oogonia stem cells，OSCs)是存在于卵巢中的生殖干细胞，具有自我更新和分化能力，最终通过分化产生的卵子将遗传信息传递给下一代。卵原干细胞存在鱼类整个发育周期，但随着性腺发育，其数量有所减少。获得较大数量和较高比例的卵原干细胞不仅有利于开展生殖相关基因的机理研究，而且有助于通过“借腹生子”技术产生雌鱼的子代，达到种质资源保护和良种选育的目的。

虽然部分鱼类卵原细胞相关研究见诸文献报道，但是从新鲜组织中分离出来的卵原细胞的量有限，限制了其更广泛的应用。如果在体外建立稳定卵原干细胞系，进行扩大培养，不仅可为生殖干细胞移植提供大量的供体来源的细胞，有效提高生殖干细胞移植成功率，而且还可以为鱼类基因组学和病毒学的研究提供一个良好的平台。

然而，卵原干细胞的体外培养相关研究非常少，在海水鱼中也仅建立了几个以体细胞为主的卵巢细胞系。因此，有必要研发一种卵原干细胞长期体外培养方法。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种牙鲆卵原干细胞培养液及牙鲆卵原干细胞体外培养方法及应用。本发明通过摸索牙鲆卵原干细胞的体外培养条件，提供了适于卵原干细胞的培养液并建立了卵原干细胞体外稳定传代的培养方法，最终获得了比例较高的卵原干细胞，并提供了全方面鉴定卵原干细胞的方法，同时本发明开展了卵原干细胞在外源基因表达研究、病毒感染或种质资源保护等方面的应用。

本发明提供的技术方案如下：

在一个方面，本发明提供了一种牙鲆卵原干细胞培养液，所述培养液包含以下成分：10％-15％(v/v)的FBS，0.9％-1.2％(v/v)的牙鲆血清，80-120μmol/L的β-巯基乙醇，380-450U/mL的青霉素，0.35-0.50mg/mL的链霉素，0.8-1.3μg/mL的两性霉素B，1.5-2.5ng/mL的bFGF以及1.5-2.5ng/mL的LIF。

在一个实施方案中，所述培养液还包含缓冲液，所述缓冲液选自HEPES、NaHCO

在一个实施方案中，所述培养液中的基础培养基包括L15、M199、MEM、DMEM、DMEM/F12，优选L15。

本发明摸索优化了卵原干细胞的体外培养液，通过在L15或M199或MEM或DMEM或DMEM/F12基础培养基中添加10％-15％(v/v)的FBS，0.9％-1.2％(v/v)的牙鲆血清，80-120μmol/L的β-巯基乙醇，380-450U/mL的青霉素，0.35-0.50mg/mL的链霉素，0.8-1.3μg/mL的两性霉素B，1.5-2.5ng/mL的bFGF以及1.5-2.5ng/mL的LIF作为原代培养液，使得本发明的培养液更加适合用于进行卵原干细胞的原代培养。

在另一个方面，本发明提供了一种牙鲆卵原干细胞体外培养方法，所述方法包括以下步骤：

(a)卵原干细胞的原代培养：将经分离纯化获得的牙鲆卵原干细胞接种于前述培养液的培养瓶中进行原代培养；

(b)卵原干细胞的传代培养：当所述培养瓶中细胞长满全瓶后，吸弃旧培养液，按照1：2-3的比例加入传代培养液进行传代；

(c)分离获得纯化的卵原干细胞系并进行鉴定。

本发明的方法建立了可持续传代的牙鲆卵原干细胞系，成功率高、细胞增殖传代能力强的优点。

在一个实施方案中，步骤(b)中，所述传代培养液包括以下成分：12％-18％(v/v)的FBS，0.9％-1.2％(v/v)的牙鲆血清，80-120μmol/L的β-巯基乙醇，90-110U/mL的青霉素，0.08-0.12mg/mL的链霉素，0.2-0.3μg/mL的两性霉素B，1.5-2.5ng/mL的bFGF、1.5-2.5ng/mL的LIF以及8-11mmol/L的HEPES缓冲液。

在一个实施方案中，步骤(b)中，所述传代培养液包括以下成分：14％-16％(v/v)的FBS，1％-1.1％(v/v)的牙鲆血清，90-110μmol/L的β-巯基乙醇，95-105U/mL的青霉素，0.09-0.11mg/mL的链霉素，0.25-0.35μg/mL的两性霉素B，1.8-2.2ng/mL的bFGF、1.8-2.2ng/mL的LIF以及9-10mmol/L的HEPES缓冲液。

本发明通过在L15或M199或MEM或DMEM或DMEM/F12基础培养基中添加12％-18％的FBS，0.9％-1.2％的牙鲆血清，80-120μmol/L的β-巯基乙醇，90-110U/mL的青霉素，0.08-0.12mg/mL的链霉素，0.2-0.3μg/mL的两性霉素B，1.5-2.5ng/mL的bFGF、1.5-2.5ng/mL的LIF以及8-11mmol/L的HEPES缓冲液作为传代培养液，获得目标牙鲆卵原干细胞率高，卵原干细胞比例比现有技术达到了较高的水平。

在一个实施方案中，所述培养方法的培养温度为11-29℃，优选15-25℃，最优选23℃。

在一个实施方案中，步骤(a)中，分离纯化的方法包括加入包含0.25％(m/m)Trpsin、0.055％(m/m)DNaseI、5％(v/v)FBS的胰酶消化工作液消化3h，经过Percoll梯度离心获得纯度60％以上的卵原干细胞悬液。

在一个实施方案中，所述鉴定包括对获得的细胞进Vasa免疫荧光分析、卵原干细胞分子鉴定分析、卵原干细胞染色体核型分析中的一种或多种。

在另一个方面，本发明提供了前述体外培养方法制备得到的卵原干细胞系在作为转基因宿主细胞、扩增病毒和/或种质资源的保存方面中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

现有的培养条件未建立长期体外培养卵原干细胞的方法，随着传代的次数，卵母细胞逐渐消失；本发明在通过卵原细胞分离纯化方法获得比例较高的卵原干细胞的基础上，通过不同的培养的条件摸索和优化，建立了适合卵原干细胞稳定传代的培养液体系和培养条件，并开展了基因转染和病毒感染的研究，为卵原干细胞的广泛应用提供了可靠的技术支撑；本发明还提供了全面及系统的卵原干细胞系鉴定方法；

本发明提供的体外培养方法使得卵原干细胞能够完全稳定的进行传代，能够连续稳定传代达100代以上。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1示出了不同浓度FBS细胞生长测定方法(其中①-⑥分别表示5％、10％、15％、20％、25％、30％的FBS浓度)；

图2示出了不同培养基细胞生长测定方法(其中①-⑥分别表示L15自制、L15成品、MEM、DMEM、DMEM/F12、M199培养基)；

图3示出了一定温度下细胞生长测定方法(其中①表示相同温度下4个重复)；

图4示出了不同营养成分培养基细胞生长测定方法(其中①-③分别表示FM、FMBL、FMBLS培养基；FM包含15％FBS，100μmol/Lβ-巯基乙醇；FMBL包含15％FBS，2ng/ml bFGF，2ng/ml LIF，100μmol/Lβ-巯基乙醇；FMBLS包含5％FBS，2ng/ml bFGF，2ng/ml LIF，100μmol/Lβ-巯基乙醇，1％(v/v)鱼血清)；

图5为本发明卵原干细胞原代培养(其中(A)Percoll纯化后的卵原细胞悬液；(B)40h后部分体细胞先贴壁，卵原干细胞尚未贴；(C)卵原干细胞6代光学观察；标尺为50μm)；

图6为不同FBS浓度下细胞的生长状态；

图7为不同基础培养基下细胞生长状态；

图8为不同温度条件细胞生长状态；

图9为不同营养成分培养基细胞生长状态(FM包含15％FBS，100μmol/Lβ-巯基乙醇；FMBL包含15％FBS，2ng/ml bFGF，2ng/ml LIF，100μmol/Lβ-巯基乙醇；FMBLS包含5％FBS，2ng/ml bFGF，2ng/ml LIF，100μmol/Lβ-巯基乙醇，1％(v/v)鱼血清)；

图10为不同营养成分培养基细胞生长状态(其中(A)培养4天后卵原干细胞状态；(B)培养11天后卵原干细胞状态；(C)培养15天后卵原干细胞状态；Ⅰ、Ⅳ、Ⅶ用FM培养基；Ⅱ、Ⅴ、Ⅷ用FMBL培养基；Ⅲ、Ⅵ、Ⅸ用FMBLS培养基；FM包含15％FBS，100μmol/Lβ-巯基乙醇；FMBL包含15％FBS，2ng/ml bFGF，2ng/ml LIF，100μmol/Lβ-巯基乙醇；FMBLS包含5％FBS，2ng/ml bFGF，2ng/ml LIF，100μmol/Lβ-巯基乙醇，1％(v/v)鱼血清；标尺表示50μm)；

图11为只有20％FBS的培养基不同代数卵原干细胞生长状态(其中，(A)卵巢组织原代培养；(B)4代卵巢细胞培养状态；(C)8代卵巢细胞培养状态；

图12为卵原干细胞鉴定分析(其中(A)卵原细胞86代；(B)密度较低时的卵原细胞88代细胞形态；(B’)为B图方框的放大图；(C)卵原细胞20代Vasa免疫荧光；(D)细胞核型分析，I为细胞分裂相，Ⅱ为97个细胞分裂相染色体数目统计；(E)nanos1、dazl、dnd、ifitm3、foxl2基因mRNA的表达，M为marker，P31、P56、P87分别表示31代、56代、87代卵原干细胞，N表示空白；标尺为50μm)；

图13为卵原干细胞冻存复苏培养8天后细胞形态(其中(A)为冻存复苏8天后细胞状态，(B)为(A)中蓝色方框放大图)；

图14为外源基因转染与表达(其中(A)脂质体(Genejammer)法转染获得EGP蛋白表达；(B)慢病毒法转染获得ZsGreen蛋白表达；标尺为50μm)；

图15为卵原干细胞感染病毒细胞病变效应及病毒基因RT-PCR检测(其中(A)细胞感染HIRRV后病变效应；(B)细胞感染LCDV病变效应；(C)细胞感染BIV后病变效应；(D)细胞感染GSIV后病变效应；(E)对照组；(F)对病变细胞进行病毒RT-PCR检测)；

图16为生殖干细胞移植(其中(A)2龄雄鱼牙鲆生殖细胞凋亡组织学切片观察；(B)PKH26染色后的卵原细胞；(C)卵原细胞移植50天后在受体性腺中增殖情况；标尺为50μm)。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1.卵原干细胞稳定细胞系的建立

1.1卵原干细胞原代培养

1.1.1培养液的准备与配制

L-15漂洗液的配制：青霉素工作浓度为100U/ml，链霉素工作浓度为0.1mg/ml，两性霉素B工作浓度为0.25μg/ml；

原代培养液的配制：含15％胎牛血清(FBS)，1％牙鲆血清，2ng/ml bFGF，2ng/mlLIF，青霉素工作浓度为400U/ml，链霉素工作浓度为0.4mg/ml，两性霉素B工作浓度为1μg/ml，HEPES缓冲液10mmol/L，β-巯基乙醇(β-ME)100μmol/L。

传代培养液配制：含15％FBS，1％牙鲆血清，2ng/ml bFGF，2ng/ml LIF，青霉素工作浓度为100U/ml，链霉素工作浓度为0.1mg/ml，两性霉素B工作浓度为0.25μg/ml，HEPES缓冲液10mmol/L，β-巯基乙醇100μmol/L。

1.1.2实验鱼

来自中国水产科学研究院北戴河中心实验站1龄雌鱼，全长39cm，体重381.0g。

1.1.3分离纯化及原代培养

将实验鱼体用酒精喷洒消毒，在无菌环境下进行操作。

先将性腺取出，用漂洗液清洗三次，将结缔组织和血细胞去除，称量300mg性腺组织，移入含3ml L15漂洗液的小培养皿(直径30mm)中，用剪刀剪碎成1mm

采用本发明团队先前已研发的牙鲆卵原细胞分离纯化方法(专利号：201810283741.3)加入3ml胰酶消化工作液(胰酶消化工作液包含0.25％Trpsin(m/m)、0.055％DNaseI(m/m)、5％FBS(v/v))，一并转入小培养皿(直径30mm)中消化3h，最终经过Percoll梯度离心获得纯度60％左右的卵原干细胞悬液，移入六孔板中进行培养。待培养40h后，大部分支持细胞贴壁后，将含有生殖干细胞的细胞悬液转移至新的培养孔进行原代培养。

1.2卵原干细胞传代培养和冻存

待原代培养15天长满后，将旧的培养液吸弃。按照1：2或1：3的比例进行传代。每隔5代冻存一次。先用0.25％的胰酶消化细胞，瓶内细胞呈现雾状后，将胰酶消化液吸出，然后加入冻存液(培养基：FBS：DMSO＝7：2：1)2ml，反复吹散细胞，按照一定降温程序降温后，移入液氮永久保存。待保存11天后，从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～38℃水浴中，使其融化，低速离心10min，去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。观察细胞复苏情况。

实施例2.卵原干细胞生长条件分析

2.1不同培养条件比较

(1)细胞浓度测定方法

首先，按照CCK-8试剂盒使用说明制作细胞浓度与相应的OD值的标准曲线。测定不同培养条件下细胞的浓度时，取对数生长期的牙鲆卵原干细胞，用0.25％胰酶消化计数后制备成细胞悬液，按照100μl/孔接种于96孔板中，细胞密度均为2×10

当培养1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d时，向孔中加入10μl CCK-8检测试剂，在细胞培养箱内继续孵育4h后，用酶标仪测定在450nm的吸光值。通过吸光值的大小，按照标准曲线转换为细胞数后，比对不同处理方法下的细胞增长率。

(2)设置6组培养条件实验

1)不同浓度FBS对细胞生长的影响：设置6个FBS浓度梯度，即：5％、10％、15％、20％、25％、30％。铺设7个相同的96孔板，每一板中不同FBS浓度梯度均设置4个重复，按照CCK-8试剂盒测定细胞的生长特征。如图1示出了不同浓度FBS细胞生长测定方法。

2)不同基础培养基对细胞生长的影响：分析6个基础培养基，均添加相同的生长因子。基础培养基分别为L15自制(L15粉末加水自制)、L15成品、MEM、DMEM、DMEM/F12、M199，铺设7个相同的96孔板，每一板中不同基础培养基均设置4个重复，按照CCK-8试剂盒测定细胞的生长特征。如图2示出了不同培养基细胞生长测定方法。

3)不同培养温度对细胞生长的影响：设置4个温度梯度，分别为11℃、17℃、23℃、29℃。每一温度下铺设7个相同的96孔板，每一板中设置4个重复，按照CCK-8试剂盒测定细胞的生长特征。如图3示出了一定温度下细胞生长测定方法。

4)不同营养成分对细胞生长的影响：配制了3种不同营养成分组合培养基，即FM、FMBL、FMBLS，铺设7个相同的96孔板，每一板中不同培养基均设置4个重复，按照CCK-8试剂盒测定细胞的生长特征。

3种培养基所含的生长因子成分如下：

①FM：15％FBS，100μmol/Lβ-巯基乙醇；

②FMBL：15％FBS，2ng/ml bFGF，2ng/ml LIF，100μmol/Lβ-巯基乙醇；

③FMBLS：15％FBS，2ng/ml bFGF，2ng/ml LIF，100μmol/Lβ-巯基乙醇，1％(v/v)鱼血清。

如图4示出了含有不同营养成分组合培养基细胞生长测定方法。

5)利用4)中提及的FM、FMBL、FMBLS对卵原细胞生长状态进行定性分析。按照1ml/孔，加入等量的细胞悬液，细胞浓度一样，分别为培养4天、11、15天后观察细胞的生长和形态变化。

6)利用仅含有20％FBS的L15培养基对卵巢细胞进行培养，检查是否能正常传代。

实施例3.卵原干细胞鉴定

3.1Vasa免疫荧光

将卵原干细胞和对照组(脑细胞)移入含有爬片的六孔板中进行爬片培养，第二天去除培养基，用4％多聚甲醛固定20min后，用PBS清洗3次，其中两个爬片进行苏木素-伊红染色并显微观察，另两个爬片进行Vasa免疫荧光分析。对细胞破膜，加入制备的牙鲆Vasa兔多克隆抗体(制备方法如专利号：201810283741.3中所示)，4℃孵育过夜，第2天洗涤甩干切片加入羊抗兔荧光二抗(1:300，阳性绿光)，DAPI染液(谷歌生物，G1012，1：500)复染细胞核，最后脱水封片，细胞爬片扫描观察。

3.2分子鉴定分析

用卵原干细胞细胞特异基因ifitm3和生殖细胞特异基因nanos1、dazl、dnd以及颗粒细胞特异基因foxl2对卵原干细胞系进行分子鉴定。

(1)卵原干细胞RNA的提取与cDNA的合成

分别收集31代、56代、87代的卵原干细胞，做3个重复。利用Trizol试剂提取总RNA；琼脂糖凝胶电泳检测所提取总RNA质量，微量紫外分光光度计(Pultton P100

(2)细胞系的分子鉴定

根据牙鲆全基因组和GenBank数据库中登记的牙鲆ifitm3、nanos1、dazl、dnd、foxl2基因序列，利用Primer Premier 6.0设计引物(表1)，以逆转录cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系：上下游引物各1μl，模板cDNA 1μl，PCR Mix 10μl，加ddH

表1.牙鲆相关基因序列扩增引物信息

3.3卵原干细胞染色体核型分析

参考GB/T 18654.12-2002——养殖鱼类种质检验第12部分：染色体组型分析，进行适当调整，对牙鲆30代卵原干细胞进行染色体核型分析。具体步骤如下：

(1)将传代1天的细胞放置4℃条件下刺激30min后，放回培养箱继续培养；

(2)第2天加入终浓度0.5μg/m L的秋水仙素，培养箱中孵育4h；

(3)收集细胞：洗掉培养液，用无血清的L15漂洗一次，加入胰蛋白酶消化5-10min直至细胞全部消化下来，用含有15％胎牛血清的L15终止胰蛋白酶消化反应，1500rpm离心5min；

(4)低渗：将收集的细胞离心，去除上清液，往细胞沉淀中加入5mL 0.075mol/LKCl溶液，轻轻吹散细胞，37℃低渗处理40min。

(5)固定：1500rpm离心5min后，去除上清，加入预冷的卡诺氏液，4℃下固定15min。

(6)重复步骤(5)两次。

(7)冷滴片法滴片，并在酒精灯少火烤一下，让染色体分散开。

(8)待载玻片干后，用5％吉姆萨染液染色25min，并用自来水冲洗无细胞的一面，晾干，观察。

实施例4.卵原干细胞应用

4.1.卵原干细胞转基因应用

1)质粒转染

pEGFP-N1质粒含有高效的功能强大的启动子SV40和PCMV，可以使目的基因在增殖的细胞中稳定表达；采用脂质体(Genejammer)法进行转化，质粒脂质复合物是按照Lipofectamine 3000试剂(美国Invitrogen公司)的方案制备。卵原干细胞提前一天在12孔板中，16～20h后待细胞贴壁稳定。转化前，用不含FBS和抗生素的L15培养基将细胞洗2遍，用50μL Opti-MEM培养基(Gibco，USA)稀释pEGFP-N1 1μg质粒和3μL Lipo3000试剂，形成DNA-脂质体混合物，室温孵育15min后将DNA-脂质体混合物逐滴加到培养基表面，振动培养板，使混合物均匀分布在培养基中，加入适量含3％FBS的L-15培养基。于23℃培养12h，在荧光显微镜下观察细胞。

2)EF1-ZsGreen1-Puro Lentivirus转染卵原干细胞

第一天按实验需要将细胞铺板。细胞数以第2天密度约50％为宜。23℃培养过夜。第二天感染前，从-80℃冰箱取出后在冰浴融化病毒，参考相关文献或者根据预实验得到的MOI值用新鲜完全培养基将病毒稀释成所需浓度。将细胞原有培养基吸走，按照MOI稀释好的病毒液加入细胞中。加入Polybrene，终浓度6μg/ml，轻轻摇匀，培养箱孵育过夜。转染48小时后，吸走含慢病毒的培养基，换为新鲜的培养基，加入适量嘌呤霉素(终浓度10μg/ml)，最终筛选出阳性细胞。

4.2.卵原干细胞应用于病毒学研究

测定卵原细胞对4种病毒(牙鲆弹状病毒HIRRV、淋巴囊肿病毒LCDV、玻勒虹彩病毒BIV和大鲵虹彩病毒GSIV)的易感性，检测是否适合应用于病毒扩增。培养至19代细胞接种于六孔板中。当单层膜达到80～90％时，去除完全培养基，用PBS洗涤细胞3次，将1ml病毒悬液接种到培养瓶中的细胞培养液中，吸附1h，吸走病毒悬液。加入含3％FBS的维持培养基，体积为5ml，17℃孵育。对照用1ml L15培养基代替病毒悬液。每天观察细胞病变效应(CPE)的发生，并用显微镜拍照。每个实验重复三次。

此外，在24h时收集未感染的对照细胞和病毒感染的细胞。用Trizol试剂(Invitrogen)提取四种收集病毒感染细胞总RNA，用P100(Pultton)DNA分析仪测定总RNA浓度，1％琼脂糖电泳测定RNA质量。用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒将总RNA逆转录为cDNA。根据NCBI的序列数据，利用Primer Premier 5软件设计用于检测牙鲆弹状病毒HIRRV、淋巴囊肿病毒LCDV、玻勒虹彩病毒BIV和大鲵虹彩病毒GSIV引物(表2)。以逆转录cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系见表3，扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。

表2.检测不同病毒的引物信息

表3.PCR扩增程序

3.卵原干细胞应用于种质资源保护领域

按照发明人课题组开发的促使牙鲆精巢生殖细胞凋亡方法(专利号201910366369.7)进行2龄雄鱼将近60天的性腺生殖细胞凋亡实验，制备无生殖细胞的受体。将培养50代左右的卵原干细胞胰酶消化收集，400G离心5min，去除上清液，加入L15漂洗液，连续清洗两次，去除残留的FBS，然后按照PKH26使用说明书进行细胞染色。最终将带有PKH26荧光标签的卵原干细胞按照1000万/尾剂量移植入受体中，并后期采样观察培养的卵原干细胞在受体性腺中是否嵌合、增殖。

实验结果

1.卵原干细胞的建立

1.1卵原干细胞分离纯化与原代培养

通过酶组合消化和Percoll梯度离心后，获得卵原干细胞占比在60％以上细胞悬液(见图5中A)。将纯化后的细胞悬液移入6孔板进行贴壁培养，待40h后大部分体细胞贴壁时，将未贴壁的卵原细胞吸出来移入新的培养孔中继续培养(见图5中B)。传至6代后，主要以上皮样细胞形态生长(见图5中C)，细胞核较大，有1-2个明显的核仁，推断为卵原干细胞。

卵原干细胞生长条件优化：

培养条件实验一：

10％-30％浓度FBS培养条件下，前5天细胞生长总体趋势向上，且FBS浓度越高，生长状况越好，第5天之后细胞量均出现了下降(图6)。而FBS浓度为5％、25％、30％条件下，卵原干细胞生长不太稳定。FBS 5％浓度下，在第3天出现细胞量小幅下降；FBS 30％浓度下，第4天细胞量出现一个小幅的下降后又快速生长了一天；25％浓度下，在3-5天内生长速度也不太稳定。10％-20％FBS条件下，在5天前一直处于相对稳定的生长速度。综合分析，牙鲆卵原干细胞适宜培养的FBS浓度为10％-20％。由于FBS浓度过高，容易导致体细胞生长速度快于生殖干细胞，故最优浓度为10％-15％。

培养条件实验二：

对不同基础培养基下细胞生长状态进行比较发现，L15自制培养基和商业成品培养基下细胞生长状态比其他培养基较好，前3天细胞生长状态一直处于指数上升期；3-7天时细胞生长处于平台期，细胞数量远远高于其他基础培养基。而其他培养基在前3天细胞生长状态与L15培养基差异不明显，但是3天后细胞衰老的速度明显比生长速度快，细胞数量出现断崖式下降，显著低于L15培养基(图7)。

结果表明，卵原干细胞最适合在L15培养基下生长，且L15自制培养基相对于商业成品更优，处于平台期的细胞数量相对比L15商业成品培养基更为稳定。

培养条件实验三：

不同温度条件下细胞生长特征分析发现，11℃细胞培养条件下，卵原干细胞在前4天生长状态非常缓慢，第5天细胞量小幅下降，6-7天又出现缓慢生长，整体生长速度5天前远远落后于其他温度培养下的细胞。17℃、29℃下虽然相较11度生长状态好，但是整体生长速度不太稳定。23℃下，细胞生长状态最好，前4天处于相对稳定的对数增长，4-7天相对平缓进入了平台期。综合分析，11-29℃均能生长，23℃为最适温度。图8示出了不同温度条件细胞生长状态。

培养条件实验四：

不同营养成分组合条件下，只加入15％FBS和β-巯基乙醇的FM培养基中细胞生长是最缓慢的，且在第4-5天出现平台期，5天后细胞量下降，表明此时细胞衰老速度要高于增殖的速度。而FMBL培养基下细胞处于生长状态，但生长速度比FMBLS慢。FMBLS培养基下，细胞生长速度较快。因此，添加了15％FBS、bFGF、LIF、β-ME、鱼血清等生长因子的培养基最适合卵原干细胞生长。图9示出了不同生长因子条件细胞生长状态。

培养条件实验五：

比较分析三种不同营养成分培养基的作用发现，培养89代卵原干细胞4天后，FMBLS培养基中卵原干细胞增殖最快，几乎铺满(图10中A-Ⅲ)，另外两种培养基中的卵原干细胞生长较慢，未铺满(图10中A-I,Ⅱ)。培养11天后，FMBLS培养基更加密集，如同鹅卵石状，死亡细胞较少(图10中B-Ⅵ)，并对FMBLS培养基的细胞进行传代。而另外两种培养基虽然也铺满，但是密度要远低于FMBLS的细胞密度，而且FM培养基中出现了死亡较多的卵原干细胞(图10中B-Ⅳ)，FMBL培养基中死亡的卵原干细胞量次之(图10中B-V)。培养15天后，FMBLS培养基中的细胞在传代4天后又长满，死亡的卵原干细胞微乎其微(图10中C-Ⅸ)，细胞密度跟FM、FMBL培养基中未传代的密度相似，而FM培养基依然存在最多的死亡细胞，FMBL培养基也出现相对较少的死亡细胞。鉴于此，培养基FMBLS中的营养成分组合最适于卵原干细胞培养。

培养条件实验六：

利用组织块贴壁法进行卵巢组织原代培养，做了3个重复。1天后细胞开始贴壁，6天后已经开始从组织块周围开始了增殖(图11中A)，22天后开始传代，随着传代次数增加，细胞逐渐增长缓慢，4代细胞多以纤维样细胞为主(图11中B)，8代细胞几乎不再增殖，细胞变大变薄，逐渐衰老脱落。此实验证明只有20％FBS的培养基无法建立卵原干细胞系。

1.2卵原干细胞传代培养、鉴定及冻存复苏

细胞在最优的培养条件下生长速度较快，平均3-4天传1代，从原代到目前的100代，一直维持上皮样形态生长，细胞密度较高时细胞趋于圆形(见图12中A)；细胞密度较低时，细胞呈现多边形(见图12中B)，与体内生殖干细胞特征一致：细胞核较明显，核内有1-2个明显的核仁(见图12中B’)。对30代左右的卵原干细胞进行核型分析，统计97个分裂相细胞的染色体数目，发现染色体数目为48条的分裂相占比高达42.3％，说明该细胞系并未分化，表现为正常的干细胞二倍性(图12中D)。通过分析31代、56代、87代细胞的相关基因表达情况，生殖干细胞特异基因nanos1、dazl、dnd、ifitm3均出现了不同程度的表达，而卵巢颗粒细胞特异基因foxl2无表达(见图12中E)，进一步说明所培养的细胞为卵原干细胞。

秉承“慢冻速融”的原则，对76代卵原干细胞细胞进行冻存，冻存11天后复苏，复苏成活率为70％以上，一星期内即可长满全瓶，并可以正常传代，目前细胞冻存前后无形态差异(见图13)。

1.3卵原干细胞应用

1.3.1卵原干细胞转基因应用

Lipo3000试剂将pEGFP-N1质粒转染细胞12h后，荧光观察发现有表达GFP外源基因的细胞，统计100个细胞，其中能表达GFP的阳性细胞占比约为15％(图14中A)。而EF1-ZsGreen1-Puro Lentivirus转染卵原干细胞48h后，荧光观察发现有表达ZsGreen的细胞，统计100个细胞，其中表达ZsGreen的阳性细胞占比约为50％(图14中B)，随着利用嘌呤霉素多次筛选，可以获得占比80％以上的阳性细胞。此实验说明外源基因可以在卵原干细胞中启动表达。

1.3.2卵原干细胞应用于病毒相关研究

4种病毒感染后，HIRRV、BIV、GSIV感染的细胞出现明显的细胞病变效应(图15中A、C、D)，LCDV病毒引起的细胞病变效应不明显(图15中B)，推测主要由于LCDV病毒并不是致死病毒的原因。通过对相应病毒基因检测发现，4种病毒相关基因均有表达(图15中F)，进一步说明卵原干细胞易感染这4种病毒，可用来扩增相关病毒量。

1.3.3卵原干细胞应用于种质资源保护研究

通过将近2个月的性腺生殖细胞凋亡实验，获得精小囊中无生殖细胞的短暂不育受体(见图16中A)。将培养的卵原干细胞进行PKH26荧光染色，使其带上红色荧光标签(见图16中B)，并按照每尾鱼移植1000万个细胞量通过生殖孔注射到雄鱼受体中。待移植50天后，采集移植后鱼的精巢进行冰冻切片，并在荧光显微镜下观察发现，培养的卵原干细胞已经嵌合到受体性腺中，并开始了增殖。通过该实验结果说明。可以在体外进行大批量的扩增卵原干细胞，然后通过生殖干细胞移植技术达到保护种质资源的目的。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国水产科学研究院北戴河中心实验站

<120> 牙鲆卵原干细胞培养液及牙鲆卵原干细胞体外培养方法及应用

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