一种基于级联反应的志贺氏菌核酸检测试纸

技术领域

本发明属于分析检测技术领域，涉及检测志贺氏菌的可视化试纸，具体涉及一种基于级联反应的志贺氏菌核酸检测试纸。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

志贺氏菌的检测方法包括常规培养法、免疫学方法和分子微生物学方法等，然而，常规培养法对志贺氏菌的检测存在检验步骤繁琐、费时费力等问题，无法满足市场上的检测需要；采用免疫学方法对志贺氏菌检测时，影响检测结果因素很多，假阳性率也比较高；采用PCR法分子微生物学方法等对志贺氏菌检测时，存在一些假阴性、假阳性等问题。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种基于级联反应的志贺氏菌核酸检测试纸，本发明提供的试纸能够对志贺氏菌进行高特异性的检测。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：

一方面，一种基于级联反应的志贺氏菌核酸检测试纸，包括第一试纸条和第二试纸条，第一试纸条与第二试纸条的一端交叠排列，交叠排列外的第二试纸条均位于第一试纸条的同侧；第一试纸条设置镀金区和扩散区，扩散区交叠排列部分区域，所述镀金区设置纳米金颗粒；所述第二试纸条设置检测线，检测线上设置第一探针和第二探针，第一探针和第二探针均为两端平齐的DNA发夹结构，第一探针的两端和第二探针的两端均连接荧光团和猝灭团，所述猝灭团能够将荧光团猝灭，第一探针的DNA序列分为11区域和12区域，第二探针的DNA序列分为21区域和22区域，11区域能够与志贺氏菌核酸互补杂交，12区域能够与21区域互补杂交，22区域能够与11区域互补杂交。

本发明设置第一试纸条用于预负载裂解液和提取试剂，裂解细菌提取核酸，通过镀金区设置纳米金颗粒可以增加纸纤维的粗糙度，增强过滤效果，避免其他东西进入第二试纸条。由于第一试纸条用于预负载裂解液和提取试剂，存在较多纳米材料和细菌碎片，容易引起假阳性，因而本发明将第一试纸条与第二试纸条交叠排列设置，通过交叠排列，能够避免第一试纸条上的纳米材料和细菌碎片等物质进入第二试纸条干扰反应，从而避免假阳性。同时，第一试纸条与第二试纸条的一端交叠排列，交叠排列外的第二试纸条均位于第一试纸条的同侧，能够保证交叠面积具有一致性，从而保证传质面积固定，实现定量控制。

本发明在第二试纸条设置第一探针和第二探针，由于第一探针和第二探针均为发夹结构，猝灭团靠近荧光团，使荧光团猝灭。当存在志贺氏菌核酸时，志贺氏菌核酸与第一探针的11区域互补杂交，破坏第一探针的发夹结构，使得第一探针的猝灭团远离荧光团，从而使得第一探针的荧光团挥发荧光，同时，通过第一探针12区域与第二探针的21区域，破坏第二探针的发夹结构，使得第二探针的猝灭团远离荧光团，从而使得第二探针的荧光团挥发荧光，即通过第一探针与第二探针的级联反应，实现荧光信号的放大，从而实现对志贺氏菌核酸的检测。

另一方面，一种志贺氏菌的检测试剂盒，包括上述基于级联反应的志贺氏菌核酸检测试纸和缓冲液。

第三方面，一种检测志贺氏菌的方法，提供上述基于级联反应的志贺氏菌核酸检测试纸，将待测含有志贺氏菌的样品加入至缓冲溶液中制备成样品溶液，将样品溶液滴加至所述检测试纸的镀金区，溶液从两条试纸交叠排列处进入第二试纸条，流过检测区，在激发灯照射下拍照测试荧光强度。

本发明的有益效果为：

1.本发明通过设置两个交叠排列的试纸条，能够避免第一试纸条上的纳米材料和细菌碎片等物质进入第二试纸条干扰反应，从而避免假阳性。

2.本发明通过在第二试纸条设置第一探针和第二探针，在避免假阳性的基础上，通过级联反应，实现荧光信号的放大，从而实现对志贺氏菌核酸的试纸可视化检测。

经过实验表明，本发明提供的基于级联反应的志贺氏菌核酸检测试纸能够对志贺氏菌进行高特异性的检测,即设计所得的H1只能够识别志贺菌靶标核酸，而无法识别并捕获其他细菌的靶标核酸。如图3所示，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、幽门螺旋杆菌、志贺菌浓度均为500nM，含有志贺菌靶标核酸的溶液的荧光信号值相较于含有其他细菌靶标高。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例中不同浓度志贺菌靶标DNA的标准溶液测定的工作曲线；

图2为本发明实施例中基于级联反应的志贺氏菌核酸检测试纸对样品的检测情况图，(a)为检测试纸的结构示意图，(b)为实际图片，(c)为5张试纸条的色度值；

图3为本发明实施例中进行高特异性检测不同靶标DNA的荧光信号。

图4为本发明实施例中H1与H2进行级联反应的原理图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

鉴于现有检测志贺氏菌存在假阳性、特异性较差等问题，本发明提出了一种基于级联反应的志贺氏菌核酸检测试纸。

本发明的一种典型实施方式，提供了一种基于级联反应的志贺氏菌核酸检测试纸，包括第一试纸条和第二试纸条，第一试纸条与第二试纸条的一端交叠排列，交叠排列外的第二试纸条均位于第一试纸条的同侧；第一试纸条设置镀金区和扩散区，扩散区交叠排列部分区域，所述镀金区设置纳米金颗粒；所述第二试纸条设置检测线，检测线上设置第一探针和第二探针，第一探针和第二探针均为两端平齐的DNA发夹结构，第一探针的两端和第二探针的两端均连接荧光团和猝灭团，所述猝灭团能够将荧光团猝灭，第一探针的DNA序列分为11区域和12区域，第二探针的DNA序列分为21区域和22区域，11区域能够与志贺氏菌核酸互补杂交，12区域能够与21区域互补杂交，22区域能够与11区域互补杂交。

本发明所述的级联反应，一个靶标通过第一探针和第二探针诱发多个反应，通过信号分子的堆叠来实现信号增强。交叠排列即将第二试纸条的一端与第一试纸条叠放。

在一些实施例中，所述第一试纸条与第二试纸条交叠排列成直角。当进行直角交叠排列时，能够保证交叠面积具有一致性，即传质面积固定，从而便于定量控制。

在一些实施例中，所述荧光团为碳量子点。以碳量子点作为荧光团，能够实现更明显的荧光效果。

在一种或多种实施例中，所述碳量子点的制备方法为：硼酸在乙二胺与水的混合溶液中，进行溶剂热反应获得。所述溶剂热反应是指在密闭体系中，在有机溶剂中进行加热使反应体系产生高于环境大气压的条件下进行的反应。

在一种或多种实施例中，所述溶剂热反应的温度为150～170℃，反应时间为10～14h。

在一种或多种实施例中，乙二胺与水的体积比为1:0.9～1.1。

在一种或多种实施例中，硼酸与乙二胺的投入比为1:9～11，g：mL。

在一些实施例中，所述第一探针如SEQ ID NO.1所示；所述第二探针如SEQ IDNO.2所示。采用该探针组合能够更好的实现志贺氏菌的试纸可视化检测。

在一些实施例中，所述第二试纸条包括质检区，所述质检区设置质检探针，所述质检探针为两端平齐的DNA发夹结构，质检探针的配对区间碱基数目与第一探针、第二探针相同，质检探针的两端均连接荧光团和猝灭团。序列不能被靶标(志贺氏菌核酸)打开，故不会发出荧光。当质检探针可以被非特异性因素打开时，表示质检探针失效，此时，需要更换新的试纸进行检查。质检探针如SEQ ID NO.3所示。

在一些实施例中，第一试纸条和第二试纸条均为硝酸纤维素膜。扩散系数远低于普通滤纸(预滴涂后不扩散)，保证荧光信号的检测。

本发明的另一种实施方式，提供了一种志贺氏菌的检测试剂盒，包括上述基于级联反应的志贺氏菌核酸检测试纸和缓冲液。

本发明的第三种实施方式，提供了一种检测志贺氏菌的方法，提供上述基于级联反应的志贺氏菌核酸检测试纸，将待测含有志贺氏菌的样品加入至缓冲溶液中制备成样品溶液，将样品溶液滴加至所述检测试纸的镀金区，溶液从两条试纸交叠排列处进入第二试纸条，流过检测区，在激发灯照射下拍照测试荧光强度。

具体地，将裂解液和核酸纯化试剂滴涂于所述检测试纸的镀金区，然后滴加样品溶液。在细菌加样后即可完成裂解和提取，由于镀金区域的过滤限制，反应后仅有分子溶液可以通过扩散进入后续区域。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例

碳量子点的合成方式为：2.0g硼酸和20mL乙二胺加入20mL的去离子水中，置于水热反应釜中，160℃烘箱中加热12h。标记物的修饰方法为：先活化核酸链氨基端。将0.2μM的NHS与退火后10μM的NH

NH

NH

NH

NH

NH

H0：

NH

志贺氏菌靶标链：5’-CCGCAGCACGTTCTTGCTTATGCAT-3’，见SEQ ID NO.4。均由南京金斯瑞生物科技有限公司生产。

目标分子检测。将目标分子样品的终浓度设置为0.01μM、0.1μM、0.25μM、0.5μM、0.75μM，通过扫描信号后绘制出标准工作曲线。如图1所示，此工作曲线用来检测特定浓度范围内的未知浓度目标分子样品。

过滤和提取核酸。首先将目标分子溶液滴加于第一试纸条的镀金区，此区域修饰有纳米金颗粒，纳米金用于增加纸纤维的粗糙度，增强过滤效果，以便第二条试纸能够进行纯分子反应。此试纸条预负载裂解液和提取试剂，裂解志贺氏菌以便提取核酸。

纸上检测。探针的制备过程为：使用修饰有碳量子点的H0(即质控线探针)、H1、H2，用缓冲液(含有0.2M氯化钠和1mM氯化镁)各配制成终浓度为500nM的探针溶液，放入恒温加热器中进行退火。从95℃至35℃，以手动梯度降温的形式，间隔5℃，恒温持续7分钟。志贺氏菌靶标按相同方式退火，退火完毕后用上述缓冲液配制成0nM、10nM、50nM、250nM、500nM，5个不同的浓度。将修饰有碳量子点的500nM的H1+H2以直线均匀涂抹于第二条试纸上作为检测线，并将修饰有碳量子点的H0涂抹于第二条试纸的另一端作质控线，如图2a所示。将目标分子溶液滴加于试纸镀金区，溶液则从两条试纸交叠处进入第二条试纸，样品溶液流过检测区，在激发灯照射下拍照测试荧光强度，检测结果图2b、2c所示，图2b为紫外照射下的试纸可视化检测结果，从1至5靶标浓度依次增大，信号有显著差异；图2c为色度分析图(指每个样品检测后可视化结果的RGB数值)，随着靶标浓度的增大，信号不断增强，蓝色成分增加，表明颜色在发生量化的变化。图3表明采用本实施例的检测试纸能够对志贺氏菌进行高特异性检测。H1与H2进行级联反应为杂交链式反应，其机理如图4所示，仅由目标分子引发若干种自身稳定的DNA发夹结构发生级联反应产生具有切口的长链DNA结构，每一个起始目标分子可以触发一个杂交链式反应形成一个超长链DNA，运用杂交链式反应可以实现目标分子的信号放大。

溶液相检测。探针的制备过程为：分别取一定量的H0、H1、H2、靶标，加入缓冲液(含有0.2M氯化钠和1mM氯化镁)放入恒温加热器中进行退火。从95℃至35℃，以手动梯度降温的形式，间隔5℃，恒温持续7分钟。取上述退火完毕后的探针，配制出H0、H1、H2终浓度为500nM，靶标终浓度为0.01μM、0.1μM、0.25μM、0.5μM、0.75μM，5个不同的浓度，并将0.01μM的靶标依次加入H0、H1+H2两管溶液中，其余浓度靶标同0.01μM的靶标操作，共配置10管溶液置于-4℃冰箱中孵育1小时。孵育结束后进行荧光检测。如图1所示，在靶标DNA浓度与荧光信号在浓度10nmol/L～500nmol/L(150μg/L～7500μg/L)范围内有良好的线性关系，拟合线性曲线为Y＝4.45212X+808.65，R

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。