一种基于响应面法优化酶辅助提取三叶青总三萜的方法

技术领域

本发明涉及中药活性成分分离技术领域，特别涉及一种基于响应面法优化酶辅助提取三叶青总三萜的方法。

背景技术

畲药三叶青(Terastigma hemsleyamm Diels et Gilg)又名金线吊葫芦、蛇附子、石抱子，为葡萄科三叶崖爬藤属蔓生植物，是我国特有药用植物、福建特色畲药，主要以藤叶和地下块根入药，其性凉，味甘微苦，具有清热解毒、祛风除湿、消肿止痛等功效。现代药理研究表明，三叶青具有抗肝损伤、抗肿瘤、抗炎等作用，临床上主要用于治疗肺炎、乙型肝炎、急性支气管炎等疾病。三叶青化学成分丰富，主要含有黄酮、酚酸、三萜类等，其中三萜类化合物是三叶青重要的次生代谢产物，其具有降胆固醇、止咳、抗癌等显著药理活性。

现有技术存在三叶青中三萜化合物的相关报道，如刘东等从三叶青中分离鉴定蒲公英萜醇、蒲公英赛醇等；许阿娟等，采用UV-Vis法测定三叶青药材中总三萜含量。现有充足的证据证明药材中的成分常包裹在植物细胞壁内，采用传统提取方法难以释放，提取率低，效率低(王云洁等，酶法在中药提取中的应用进展)。近年来，酶辅助提取法广泛应用于植物中黄酮、酚酸的提取工艺研究。纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶等专属性酶可选择性破坏植物纤维素、细胞壁等致密结构，使得植物胞内成分更容易溶解、扩散，从而提高中药材中有效成分的溶出率。其中，酶解温度、酶解时间、酶解pH、酶添加量均对三叶青总三萜提取可能存在实质的影响，因此亟需一种基于酶辅助提取三叶青总三萜的优化方法。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺陷，本发明所要解决的技术问题是：提供一种基于响应面法(Box-Behnken)优化酶法辅助提取三叶青总三萜的方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种基于响应面法优化酶辅助提取三叶青总三萜的方法，基于Box-Behnken响应面法，以Sebiferenic acid质量浓度为响应值，选取酶添加量、酶解pH、酶解温度和酶解时间四个响应变量，以单因素实验最优点为中心，围绕所述中心上下各取一个水平值作为响应面水平，对各响应变量数据进行多元回归分析，获得回归方程：

Y＝2.21-6.500E-003A-0.058B-8.333E-003C-0.071D+0.085AB-0.018AC-0.067AD-0.042BC+0.075BD+0.044CD-0.32A

其中，A为酶添加量，B为酶解pH，C为酶解时间，D为酶解温度，Y为总三萜提取率。

本发明的有益效果在于：本发明在单因素试验考察酶添加量、酶解pH、酶解温度、酶解时间的基础上，采用Box-Behnken响应面法优化酶辅助的三叶青总三萜提取工艺。经过多项方程拟合，结果表面拟合方程显著，确定的酶辅助三叶青总三萜的最佳提取条件：以纤维素酶进行酶解，酶添加量为1.99％、酶解pH为4.82、酶解温度为42.56℃、酶解时间为88.62min。在此提取条件下，三叶青提取率的预测值为2.23％，经放大验证试验，三叶青总三萜提取率为2.18％±0.07％，RSD为2.24，与模型接近。

附图说明

图1所示为酶种对三叶青总三萜提取率的柱状图；

图2所示为纤维素酶酶添加量(酶的用量)对总三萜提取率的折线图；

图3所示为纤维素酶酶解pH对总三萜提取率的折线图；

图4所示为纤维素酶酶解时间对总三萜提取率的折线图；

图5所示为纤维素酶酶解温度对总三萜提取率的折线图；

图6所示为三叶青总三萜提取率对酶添加量、酶解pH、酶解时间和酶解温度的响应面图示；

图7所示为在具体实施方式中Sebiferenic acid MS质谱图谱(ESI-)。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。

一种基于响应面法优化酶辅助提取三叶青总三萜的方法，基于Box-Behnken响应面法，以Sebiferenic acid质量浓度为响应值，选取酶添加量、酶解pH、酶解温度和酶解时间四个响应变量，以单因素实验最优点为中心，围绕所述中心上下各取一个水平值作为响应面水平，对各响应变量数据进行多元回归分析，获得回归方程：

Y＝2.21-6.500E-003A-0.058B-8.333E-003C-0.071D+0.085AB-0.018AC-0.067AD-0.042BC+0.075BD+0.044CD-0.32A

其中，A为酶添加量，B为酶解pH，C为酶解时间，D为酶解温度，Y为总三萜提取率。

其中，Sebiferenic acid(2α,3β-dihydoxytarxer-14-en-28-oic acid，结构如式A所示)在三叶青内已被发明人首次提取得到。

具体的，在三叶青内提取以及确定Sebiferenic acid的方法如下：将室温干燥48h的三叶青块根(3.2kg)，粉碎过40目筛，用甲醇浸提3天，之后进行减压浓缩，得到棕色粗提物(300g)，将粗提物用粒径为200～300nm的柱层层析硅胶填料(厂家：青岛海洋化工有限公司，批号：0120308)进行真空液相色谱分离，柱压为-0.6Mpa，用环己烷/二氯甲烷50：1，等份收集，每份约250mL,共35份；二氯甲烷/乙酸乙酯10：1，等份收集，每份约250mL,共45份；乙酸乙酯/甲醇5：1，等份收集，每份约250mL,共30份，进行梯度洗脱。共收集110个亚组分。将亚组分样品以薄层分析重组(硅胶GF

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对于以Sebiferenic acid作为三叶青中三萜化合物的对照主要原因在于Sebiferenic acid在三叶青中提取量较高，因此能够以其作为三叶青总三萜提取率的指标，以Sebiferenic acid的提取率反应三叶青总三萜的提取率，即在酶添加量、酶解pH、酶解温度和酶解时间四个响应变量下以Sebiferenic acid的质量浓度所对应的提取率反应它们与三叶青总三萜提取率之间的相关性。对于三叶青总三萜提取率所使用的提取方法(超声法、温浸法、回流法)经由发明人考察比较，最终回流法提取率优于超声法和温浸法，故在本文中选用回流法对酶辅助三叶青总三萜提取工艺进行考察。

1 仪器与材料

1.1 仪器

DK-S24电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)；KQ-500DE数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；UV-1800紫外分光光度计(日本岛津)；Milli-Q Direct16纯水机(美国Millipore公司)；AR224CN电子天平(奥豪斯仪器(常州)有限公司)；奥斯特ST2100/F pH计(北京明宸中寰科技有限公司)。

1.2试剂

Sebiferenic acid(上海源叶生物科技公司，批号T12Y9J27405)；纤维素酶(50U/mg，上海源叶生物科技公司)；果胶酶(40U/mg，北京索莱宝科技有限公司)；半纤维素酶(10U/mg，北京雷根生物技术有限公司)；中性蛋白质酶(50U/mg，上海麦克林生化科技有限公司)；木瓜蛋白酶(10U/mg，上海源叶生物科技公司)；柠檬酸、柠檬酸钠、无水乙醇、高氯酸、冰乙酸、香草醛均为国产分析纯。

1.3试药

三叶青药材，为福建优选品种“闽选一号”，经福建中医药大学药学院药用植物实验室范世明高级实验师鉴定，为葡萄科植物三叶青(Tetrastigma hemsleyanum Diels etGilg)的干燥块根，样品存放于福建中医药大学药学院标本室。

2 方法与结果

2.1 三叶青药材的预处理

三叶青块根室温干燥48h后，粉碎，过40目筛，备用。

2.2标准曲线的绘制与总三萜提取率的计算

精密称取Sebiferenic acid对照品适量，置于量瓶中，加入纯甲醇定容至刻度线，充分溶解，即得0.224mg/mL Sebiferenic acid对照品溶液。精密量取对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL分别置10mL具塞试管中，水浴挥干，分别加入新鲜配制的5％香草醛-冰醋酸溶液0.2mL，高氯酸0.8mL，60℃水浴加热15min，取出，冰浴冷却4min后，移液管吸取5.0mL冰醋酸至具塞试管中，混匀。以相应试剂为空白对照(5％香草醛-冰醋酸溶液0.2mL，高氯酸0.8mL，以冰醋酸补齐至等体积)，在最大吸收波长544nm下测定吸光度值，重复实验3次，取平均值。以吸光度A为纵坐标，Sebiferenic acid质量浓度(μg/mL)为横坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程为：A＝0.0461C+0.0391(r＝0.9996)，其线性范围3.6～16.75μg/mL。

2.3三叶青总三萜的提取

精密称取“2.1”项下三叶青块根粉末5.0g，置于100mL磨口锥形瓶中，加入16倍量(质量)纯水，以特定的酶添加量、酶解pH、酶解温度、酶解时间进行酶解提取，酶解结束后，过滤，取滤渣，加入20倍量(质量)80％乙醇，80℃回流提取1次，每次60min，过滤，将水提液和醇提液的抽滤液合并，测定总体积，取上清液80μL置于10mL具塞试管中，按“2.2”项方法测定其吸光度，并根据回归方程计算总三萜浓度，最终得出总三萜提取率。每组试验各重复3次。

2.4单因素试验

2.4.1酶的种类对三叶青总三萜提取率的影响

精密称取“2.1”项下15份三叶青块根粉末5.0g，置100mL磨口锥形瓶中，加入16倍量(质量)纯水，调节pH 5.0，分别加入纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶，使5g底物中含有2500U的酶，均匀分散，45℃下酶解60min后，上述各样品再按“2.3”项方法，计算三叶青总三萜的提取率，考察不同酶对三叶青总三萜提取率的影响，结果见图1(n＝3)。相比选用的五种酶，纤维素酶提取效果最好，故选择纤维素酶辅助提取三叶青总三萜。

2.4.2纤维素酶添加量对三叶青总三萜提取率的影响

精密称取“2.1”项下15份三叶青块根粉末5.0g，置100mL磨口锥形瓶中，加入16倍量(质量)纯水，调节pH 5.0，分别加入占原药材质量(三叶青块根粉末质量)1.0、1.5、2.0、2.5、5.0％的纤维素酶，均匀分散，45℃下酶解60min后，上述各样品再按“2.3”项方法，计算三叶青总三萜的提取率，考察酶添加量对三叶青总三萜提取率的影响，结果见图2(n＝3)。当添加2.0％纤维素酶时，三叶青总三萜提取率最高，因此选择1.5、2.0、2.5％三个水平进行响应面实验设计。

2.4.3纤维素酶酶解pH值对三叶青总三萜提取率的影响

精密称取“2.1”项下15份三叶青块根粉末5.0g，置100mL磨口锥形瓶中，加入16倍量(质量)已调节至pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的纯水，加入占原药材质量(三叶青块根粉末质量)2.5％的纤维素酶，均匀分散，45℃下酶解60min后，上述各样品再按“2.3”项方法，计算三叶青总三萜的提取率，考察pH值对三叶青总三萜提取率的影响，结果见图3(n＝3)。当pH值为5.0时，三叶青总三萜提取率最高，因此选择pH值4、5、6三个水平进行响应面实验设计。

2.4.4纤维素酶酶解时间对三叶青总三萜提取率的影响

精密称取“2.1”项下15份三叶青块根粉末5.0g，置100mL磨口锥形瓶中，加入16倍量(质量)纯水，调节pH 5.0，加入占原药材质量(三叶青块根粉末质量)2.5％的纤维素酶，均匀分散，45℃下分别酶解30、60、90、120、150min后，上述各样品再按“2.3”项方法，计算三叶青总三萜的提取率，考察酶解时间对三叶青总三萜提取率的影响，结果见图4(n＝3)。当酶解时间为60min时，三叶青总三萜提取率最高，因此选择酶解时间60、90、120min三个水平进行响应面实验设计。

2.4.5纤维素酶酶解温度对三叶青总三萜提取率的影响

精密称取“2.1”项下15份三叶青块根粉末5.0g，置100mL磨口锥形瓶中，加入16倍量(质量)纯水，调节pH 5.0，加入占原药材质量(三叶青块根粉末质量)2.5％的纤维素酶，均匀分散，分别在25、35、45、55、65℃下酶解60min后，上述各样品再按“2.3”项方法，计算三叶青总三萜的提取率，考察酶解时间对三叶青总三萜提取率的影响，结果见图5(n＝3)。当酶解温度为45℃时，三叶青总三萜提取率最高，因此选择酶解温度35、45、55℃三个水平进行响应面实验设计。

2.5星点设计-响应面优化三叶青总三萜提取工艺

2.5.1.三叶青块根三萜提取量的响应面试验设计

在单因素试验的基础上，以酶解pH值、酶解温度、酶解时间、酶添加量为考察因素，因素与水平见表1，采用Box-Benhken的响应面设计试验优选提取工艺，响应面试验安排与结果见表2，利用Design-Expert 8.0.6软件对二次回归方程进行方差分析，结果见表3。

表2

表3

注：*代表0.01＜P＜0.05，**代表P＜0.01

利用Design-Expert 8.0.6软件对实验数据进行多元回归分析，得到4个响应因素(A:酶添加量，B:酶解pH值，C:酶解时间，D:酶解温度)与Y(三萜提取率)的回归方程如下：

Y＝2.21-6.500E-003A-0.058B-8.333E-003C-0.071D+0.085AB-0.018AC-0.067AD-0.042BC+0.075BD+0.044CD-0.32A

2.5.2响应面分析

对该模型进行分析，模型P＜0.0001，达到极显著的水平，失拟项P＝0.2930＞0.05，不显著，表明回归方程模拟的比较好，三萜总决定系数R

由表3可以看出，F值的大小可以判断各因素对三萜类物质提取率影响的强弱。F值越大，影响作用越强，在影响酶提取三叶青总三萜的四个响应因素中，其主次顺序为，酶解温度(D)＞酶解pH值(B)＞酶解时间(C)＞酶添加量(A)，四个响应因素大多达到显著水平，且从因素间交互作用的数据可以看出，各个因素之间的交互作用均达到显著水平。

根据回归方程做出的响应面曲图，分析各个响应因素交互作用对三叶青中三萜提取量的影响，响应面越陡峭，交互作用越明显，曲面越平缓，则交互作用不显著，结果如图6所示。最终，响应面设计所得出的最优参数为酶添加量(A)为1.99％、酶解pH值(B)为4.82、酶解温度(D)为42.56℃、酶解时间(C)为88.62min，盐肤木根三萜提取率理论值为2.23％。

2.6验证实验

称取3份三叶青块根粉末(“2.1”项下)5.0g，按响应面试验优化的最佳工艺条件进行验证试验3次，计算得到总三萜平均含量为2.18％±0.07％，RSD为3.55％，表明本实验所得到的二项式拟合方程可较好的描述所测指标(自变量)与因素(因变量)之间的关系，所建立的数学模型预测性良好，优选的提取工艺条件重现性好，真实性强。

综上所述，本发明在酶法提取三叶青总三萜的工艺考察方面，首先进行单因素试验考察，比较了不同种类酶对提取三叶青总三萜的影响，发现纤维素酶的总三萜提取率最高，与无酶组及其他四种酶比较均有显著差异，因此，选择纤维素酶辅助提取三叶青中的总三萜；其次选择了酶解pH值、酶解温度、酶解时间和酶加入量作为4个响应因素，得到每个响应因素下三叶青总三萜提取率影响较高的3个水平(响应面水平)，进而采用Box-Benhken法设计响应面试验优化酶提取工艺。在优选工艺方案中，影响三叶青中提取的主次因素为：酶解温度(D)＞酶解pH值(B)＞酶解时间(C)＞酶添加量(A)，确定了三叶青总三萜的最佳工艺参数为：酶添加量(A)为1.99％、酶解pH值(B)为4.82、酶解温度(D)为42.56℃、酶解时间(C)为88.62min。在此工艺条件下，经放大验证试验，总三萜提取率达到2.18％±0.07％，与模型预测值相比，RSD为3.55％，结果表明，最优条件下的工艺简单实用、提取率高、重现性好，是三叶青获得总三萜的有效方法，可为进一步的工业化生产提供参考依据。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。