判别不同仪器测定烟碱油水分配系数差异程度的t检验法

技术领域

本发明属于检测技术领域，具体涉及一种判别不同仪器测定烟碱油水分配系数差异程度的t检验法。

背景技术

研究表明烟碱可以保护神经，改善人体中枢神经系统退变疾病症状，对部分炎症也有一定疗效。如：烟碱对阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)、帕金森综合症(parkinson disease，PD)、妥瑞氏综合症(Tourette Syndrome)、精神分裂症、癫病、溃疡型结肠炎都具有积极影响。另外，烟碱还可改善记忆、提高学习力和注意力。

油水分配系数是指当化合物在油相和水相溶解并达到平衡时，其在油相的浓度和在水相的浓度之比P，通常以常用对数lgP表示。通过体外试验求得的某化合物油水分配系数则称为该化合物的表观油水分配系数lgP

药物在生物体内的溶解、吸收、分布、转运与药物的油水分配系数有关。由于药物吸收需要其具备适宜的脂溶性和水溶性；适当的脂溶性，有利于药物的扩散并透过生物膜；而水溶性有利于药物在体液内转运，达到作用部位与受体结合，从而产生药物效应；因而，药物需要具有适当的油水分配系数，以便能透过生物膜脂质双分子层。研究表明，过低的油水分配系数(lgP<-2)，药物不能穿过脂质膜；相反，过高的油水分配系数(lgP>3)，药物因为脂溶性强而很难从细胞另一侧的膜释放出来，进入附近的血管或淋巴管，所以吸收更加困难。药物的最佳油水分配系数为-1

体外测定药物油水分配系数，是为了模拟生物体内药物在水相和生物相之间的分配情况。许多有机溶剂曾被用来模拟生物相，如氯仿、橄榄油和正辛醇等。鉴于正辛醇的结构和理化性质更近似生物相，目前多以正辛醇作为有机相(油相)以模拟生物相。

测定药物表观油水分配系数的仪器分析方法，需根据药物结构特征、挥发性、仪器条件加以选择，多为高效液相色谱法、超高效液相色谱法、气相色谱法、紫外-可见光谱法等。如果药物具有挥发性或半挥发性，其表观油水分配系数的仪器分析方法往往有多种选择。为理性地选择测定药物表观油水分配系数的仪器分析方法，提高测定结果的精准性，需将不同仪器分析方法检测结果进行比对。目前，许多比对研究，仅通过简单折线图或数据直观分析得出大致结论，无法将仪器条件改变对表观油水分配系数测定结果的影响与试验误差带来的波动进行区分，影响结果和推断的准确性。

因此，如何克服现有技术的不足，高效、经济、准确地将不同仪器分析方法测定的烟碱表观油水分配系数进行比对是本领域亟需解决的问题。

目前为止，在国内外未见关于采用独立样本t检验判别超高效液相色谱法与气相色谱-质谱法测定烟碱表观油水分配系数差异是否显著的公开报道。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，采用对照试验设计，分别以超高效液相色谱(UPLC)法与气相色谱-质谱(GC-MS)法测定烟碱表观油水分配系数，并通过独立样本t检验，建立了“判别不同仪器测定烟碱油水分配系数差异程度的t检验方法”，从而保证判别、推断的可靠性及科学性；为传统烟草制品及新型烟草制品的研究及开发提供数据支撑和理论指导。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

判别不同仪器测定烟碱油水分配系数差异程度的t检验方法，包括如下步骤：

步骤①，试验指标选择：选择烟碱表观油水分配系数作为试验指标；

步骤②，试验因子及其水平确定：试验因子为仪器分析方法，其水平分别为超高效液相色谱(UPLC)法和气相色谱-质谱(GC-MS)法两水平；

步骤③，试验方案编制：在步骤②选择的试验因子及水平的基础上，选用对照试验设计编制试验方案；

步骤④，样品制备：以正辛醇为油相，碱性磷酸盐缓冲溶液为水相，采用摇瓶法平行进行11次油水分配试验，以制备各试验对应的油相样品和水相样品；

步骤⑤，试验数据收集：按步骤③编制的试验方案，分别采用超高效液相色谱(UPLC)法和气相色谱-质谱(GC-MS)法就步骤④各分配试验制备的油相和水相样品中烟碱含量进行检测和计算，结果通过求比值、求常用对数得到各试验对应的步骤①所选择试验指标数据，即各试验对应的烟碱表观油水分配系数；

步骤⑥，对试验数据进行样本独立性检验：对步骤⑤收集到的试验数据进行样本独立性检验；

步骤⑦，对试验数据进行正态分布检验：对步骤⑤收集到的试验数据进行正态分布检验；

步骤⑧，对试验数据进行独立样本t检验：对步骤⑤收集到的试验数据进行独立样本t检验；

步骤⑨，根据检验结果判别采用超高效液相色谱法与气相色谱-质谱法测定烟碱表观油水分配系数是否有显著差异。

进一步，优选的是，所述的用作水相的碱性磷酸盐缓冲溶液pH值为7.40。

进一步，优选的是，所述的油水分配试验之正辛醇与缓冲溶液的体积比为2.2mL/2.2mL。

进一步，优选的是，所述的油水分配试验之平衡温度为(37±1)℃。

进一步，优选的是，所述的油水分配试验之平衡时间为30mi n。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

A.根据独立样本t检验结果判别分别采用超高效液相色谱法与气相色谱-质谱法测定烟碱表观油水分配系数的差异是否显著，能够保证判别、推断的可靠性及科学性。

B.为判别分别采用超高效液相色谱法与气相色谱-质谱法测定药物表观油水分配系数的差异是否显著提供了一种科学可行的系统方法。

C.能够用于指导选择测定烟碱表观油水分配系数的仪器分析方法，为传统烟草制品及新型烟草制品的研究及开发提供数据支撑和理论指导，经济效益显著。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的技术方案进行详细的说明，以下的实施例仅是示例性的，仅能用来解释和说明本发明的技术方案，而不能解释为是对本发明技术方案的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

为理性地选择测定烟碱表观油水分配系数的仪器分析方法，提高测定结果的精准性，选用pH 7.40的磷酸盐缓冲溶液为水相，正辛醇为油相，仪器分析方法为试验因子，其水平分别为超高效液相色谱(UPLC)法和气相色谱-质谱(GC-MS)法两水平，并采用摇瓶法平行进行多次分配试验，然后分别采用超高效液相色谱(UPLC)法和气相色谱-质谱(GC-MS)法就各试验对应的油相和水相样品中烟碱含量进行检测和计算，结果通过求比值、求常用对数得到各试验对应的烟碱表观油水分配系数；试验数据采用独立样本t检验，建立了判别不同仪器测定烟碱油水分配系数差异程度的t检验方法。

超高效液相色谱(UPLC)条件：

进样量：10μL；流速：0.4mL/mi n；柱温：30℃；进样器温度：20℃；检测波长：259nm；流动相A：10mmo l/L的甲酸铵水溶液；流动相B：甲醇；梯度洗脱条件：0～2.0mi n，流动相A的占比为90％vo l；2.0～4.0mi n，流动相A的占比为90％vo l～60％vo l；4.0～6.0mi n，流动相A的占比为60％vo l～10％vo l；6.0～8.0mi n，流动相A的占比为10％vo l～90％vo l。

气相色谱-质谱(GC-MS)条件：

进样口温度：250℃；进样量：1μL；分流进样；分流比：40:1；载气：氦气；载气流速：1.0mL/mi n；柱箱升温程序：初始温度为100℃，保持时间3mi n，以10℃/mi n速率升至260℃，保持3mi n，总运行时间22mi n；检测器：质谱检测器；电离模式：EI；电离能：70eV；离子源温度：230℃；传输线温度：280℃；扫描方式：选择离子检测(SIR)；溶剂延迟：8mi n。

应用于超高效液相色谱(UPLC)的烟碱储备液的配制：

准确称取烟碱标准品100mg于100mL棕色容量瓶中，用去离子水稀释定容至刻度，摇匀，得到浓度为1mg/mL的烟碱储备液。溶液于0℃～4℃条件下避光保存。

应用于超高效液相色谱(UPLC)法的烟碱标准工作溶液的配制：

分别移取0.020mL、0.550mL、1.100mL、1.650mL、2.200mL浓度为1mg/mL烟碱储备液于5个不同的10mL棕色容量瓶中，依次加入去离子水稀释定容至刻度，摇匀，得到5个不同浓度的烟碱标准工作溶液：2.0mg/L、55.0mg/L、110.0mg/L、165.0mg/L、220.0mg/L。各溶液于0℃～4℃条件下避光保存。

浓度为1％三乙胺-三氯甲烷溶液的配制：

准确量取1mL三乙胺于100mL棕色容量瓶中，加三氯甲烷定容至刻度，超声混匀得1％三乙胺-三氯甲烷溶液。溶液于0℃～4℃条件下避光保存。

浓度为0.01％三乙胺-三氯甲烷溶液的配制：

准确量取10mL 1％三乙胺-三氯甲烷溶液于1000mL棕色容量瓶中，加三氯甲烷定容至刻度，超声混匀得0.01％三乙胺-三氯甲烷溶液。溶液于0℃～4℃条件下避光保存。

烟碱一级储备液的配制：

准确称取0.400g烟碱，置于100mL棕色容量瓶中，用0.01％三乙胺-三氯甲烷溶液稀释定容至刻度，得4.00mg/mL的一级储备液。溶液于0℃～4℃条件下避光保存。

烟碱二级储备液的配制：

移取10mL浓度为4.00mg/mL的烟碱一级储备液于100mL棕色容量瓶中，用0.01％三乙胺-三氯甲烷溶液稀释定容至刻度，得到浓度为0.400mg/mL的二级储备液。溶液于0℃～4℃条件下避光保存。

应用于气相色谱-质谱(GC-MS)法的烟碱标准工作溶液的配制：

分别移取0.375mL、1.250mL、2.500mL、3.750mL、5.000mL浓度为0.400mg/mL的烟碱二级储备液于5个10mL棕色瓶中，分别加入0.01％三乙胺-三氯甲烷溶液定容至刻度，摇匀，得到5个不同浓度的烟碱标准工作溶液：15.0mg/L、50.0mg/L、100.0mg/L、150.0mg/L、200.0mg/L。溶液于0℃～4℃条件下避光保存。

用于分配的烟碱溶液的配制：

准确称取0.9051g烟碱，置于10mL棕色容量瓶中，用去离子水定容至刻度，摇匀，得到浓度为90.51mg/mL的烟碱溶液，以供油水分配使用。于0℃～4℃条件下避光保存，有效期3个月。

碱性缓冲溶液的配制：

取磷酸二氢钾3.400g，加0.1mo l/L氢氧化钠溶液197.5mL，加水定容至500mL，摇匀，用0.1mo l/L氢氧化钠水溶液或磷酸调节pH至7.40。

试验指标选择：

选择烟碱表观油水分配系数作为试验指标。

试验因子及其水平确定：

试验因子为仪器分析方法，其水平分别为超高效液相色谱法和气相色谱-质谱法两水平。

试验方案编制：

在选择的试验因子及水平的基础上，选用对照试验设计编制试验方案(表1)，其中正辛醇与缓冲溶液的体积比为2.2mL/2.2mL；平衡温度为(37±1)℃；平衡时间为30mi n；每个水平重复11次试验，同时每个水平制备1个空白样品，空白样品与试验样品的区别是空白样品中不加烟碱。

表1对照试验方案

注：a.每个水平重复11次试验。

样品制备：

以正辛醇为油相，碱性磷酸盐缓冲溶液为水相，采用摇瓶法平行进行11次油水分配试验，以制备各试验对应的油相样品和水相样品。具体包括：正辛醇和缓冲溶液预饱和处理、烟碱油水分配试验、油相样品和水相样品的分离制备。

正辛醇和缓冲溶液预饱和处理：

试验前，正辛醇和缓冲溶液需预饱和处理。于1个250mL储液瓶中加入pH为7.40的磷酸盐缓冲溶液及正辛醇各30mL，并置于可控温的振荡器中于平衡温度(37±1)℃下振荡24h。之后，静置，分液，分别得到平衡温度下缓冲溶液饱和的正辛醇(油相溶剂)及正辛醇饱和的缓冲溶液(水相溶剂)，备用。

烟碱油水分配试验：

取11支5mL连盖离心管，并分别将已平衡至(37±1)℃的缓冲溶液饱和的正辛醇(油相溶剂)及正辛醇饱和的缓冲溶液(水相溶剂)按2.2mL/2.2mL进行等体积配比，并加入6μL浓度为90.51mg/mL的烟碱溶液。置于(37±1)℃的恒温振荡器中振荡30mi n。同时制备1个空白样品，空白样品与试验样品的区别是空白样品中不加烟碱。

油相样品和水相样品的分离制备：

上述烟碱油水分配试验结束后，静置，并采用注射器分别吸取1mL左右的上层油相和下层水相于2mL连盖离心管中离心，得到供检测的油相样品和水相样品。在吸取下层水相时，为尽可能避免水相样品中含有痕量的正辛醇，取样时先让注射器充满空气，当通过正辛醇层时，轻轻地排出空气，待针头部分探入水相时，抽取1mL左右的水溶液，然后快速抽出注射器并拆去针头，再将注射器中的水相转移至2mL连盖离心管中离心，得到供检测的水相样品。

试验数据收集：

按编制的试验方案，分别采用超高效液相色谱(UPLC)法和气相色谱-质谱(GC-MS)法就各分配试验制备的油相样品和水相样品中烟碱含量进行检测和计算。结果通过求比值、求常用对数得到各试验对应的试验指标数据，即各试验对应的烟碱表观油水分配系数。

超高效液相色谱(UPLC)法：

取烟碱标准工作溶液在超高效液相色谱(UPLC)条件下进样分析，得到烟碱峰面积，用烟碱浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归以绘制烟碱标准工作曲线，其相关系数的平方R

表2超高效液相色谱(UPLC)法测定烟碱的线性回归方程、检出限及定量限

超高效液相色谱(UPLC)法测定试验样品中烟碱含量：

采用超高效液相色谱(UPLC)法对各试验对应的油相样品和水相样品中烟碱含量进行测定。

采用式1计算所述待测样品中烟碱含量：

C

式1中，

C

C表示由标准工作曲线得出的待测样品中烟碱含量(浓度)，单位为mg/L；

C

∫表示稀释因子；若待测试样中烟碱浓度未超出烟碱标准工作溶液最大浓度，则稀释因子取1；若待测试样中烟碱浓度超出烟碱标准工作溶液最大浓度，则应将待测试样用对应油相溶剂或水相溶剂稀释后再测定，若稀释至2倍，则∫取2，以此类推；本实施例无稀释，∫取1。

以两次平行测量结果的算术平均值为最终测定结果，精确至0.01mg/L。两次平行测量结果的相对平均偏差应小于10％。

将所测油相样品中烟碱浓度记为C

烟碱表观油水分配系数(lgP

各试验对应的检测结果通过求比值、求常用对数(见式2)得到各试验对应的烟碱表观油水分配系数(lgP

将由超高效液相色谱(UPLC)法测得的lgP

lgP

式2中，lgP

表3超高效液相色谱(UPLC)法测定试验指标结果

气相色谱-质谱(GC-MS)法：

以标准样品的保留时间以及多反应监测离子定性。当试样和标样在相同保留时间处(±0.2mi n)出峰，其对应质谱碎片离子的质荷比一致，并且离子的丰度比符合：相对丰度＞50％时，允许±20％偏差；相对丰度20％～50％时，允许±25％偏差；相对丰度10％～20％时，允许±30％偏差；相对丰度≤10％时，允许±50％偏差，此时可定性确证目标分析物。

气相色谱-质谱(GC-MS)法标准工作曲线的制作、检出限及定量限：

取烟碱标准工作溶液在气相色谱-质谱(GC-MS)条件下进样分析，得到烟碱峰面积，用烟碱浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归以绘制烟碱标准工作曲线，其相关系数的平方R

表4气相色谱-质谱(GC-MS)法测定烟碱的线性回归方程、检出限及定量限

气相色谱-质谱(GC-MS)法测定各试验油相样品中烟碱含量：

取烟碱油水分配试验各油相样品600.0μL，分别加入6.0μL浓度为1％三乙胺-三氯甲烷溶液，混合均匀，使各样品中三乙胺-三氯甲烷溶液的浓度为0.01％。

采用气相色谱-质谱(GC-MS)法，对各试验对应的油相样品中烟碱含量进行测定。

采用式3计算所述待测油相样品中烟碱含量：

C

式3中，

C

C’表示由标准工作曲线得出的待测油相样品中烟碱含量(浓度)，单位为mg/L；

C

稀释因子取1.01(注：本实施例因往各油相样品600.0μL中分别加入了6.0μL浓度为1％三乙胺-三氯甲烷溶液，故稀释因子∫’取1.01)；若待测试样溶液的浓度超出混合标准工作溶液最大浓度，则应将待测液用对应油相溶剂稀释后再测定，若稀释至2倍，则∫’取2×1.01，以此类推。

以两次平行测量结果的算术平均值为最终测定结果，精确至0.01mg/L。两次平行测量结果的相对平均偏差应小于10％。

气相色谱-质谱(GC-MS)法中水相样品烟碱含量的计算：

因气相色谱-质谱(GC-MS)法不适用于水相样品的检测，需根据式4计算水相样品中烟碱含量(浓度)，记为C

C

式4中，C

烟碱表观油水分配系数(lgP

令

P

将式4代入式5可得式6，

P

则

lgP

按式6及式7计算各分配试验的烟碱表观油水分配系数P

表5气相色谱-质谱(GC-MS)法测定试验指标结果

对试验数据进行样本独立性检验：

在独立样本均值检验中，样本的独立性是前提条件之一。对收集到的试验数据(表3对应lgP

表6独立性检验结果

b,121个单元(100.0％)的期望频数小于5，最小的期望频数为0.09；

c,若显著性概率Asymp.Sig.(2-sided)>0.05，判定样本相互独立。

表6中给出了皮尔逊卡方检验，似然比检验和列联表检验结果，这些检验所得显著性概率Asymp.Sig.(2-sided)均大于0.05，所以能够判定样本1和样本2之间相互独立。

对试验数据进行正态分布检验：

为了将仪器分析方法变化引起的试验结果间的差异与误差引起的试验结果间的差异区分开来，需对收集到的试验数据(表3对应lgP

表7正态性检验结果

注：d.采用Lilliefors检验(Kolmogorov-Smirnov检验修正版)进行显著性检验；

e.*，真实显著性下限。

表7中，由于显著性概率Sig.大于0.05(Sig.>5％)，故试验指标数据呈正态分布。

对试验数据进行独立样本t检验：

因样本1数据和样本2数据服从正态分布，所以能够通过独立样本t检验判别比较不同仪器分析方法测得的烟碱表观油水分配系数之间是否有显著差异。独立样本t检验结果见表8。

表8独立样本t检验结果

表8中，样本方差齐性检验的显著性概率Sig.大于0.05，说明样本方差齐。选取方差齐对应的t检验结果，能够判别烟碱初始浓度对烟碱表观油水分配系数的影响是否显著。

由于等均值t检验的双尾显著性检验概率Sig.(2-tailed)小于0.05，所以判定分别采用超高效液相色谱(UPLC)法与气相色谱-质谱(GC-MS)法测定的烟碱表观油水分配系数之间有显著差异。

根据检验结果判别采用超高效液相色谱法与气相色谱-质谱法测定烟碱表观油水分配系数是否有显著差异：

根据上述样本独立性检验、正态分布检验、方差齐性检验、独立样本t检验结果，能够判定：分别采用超高效液相色谱(UPLC)法与气相色谱-质谱(GC-MS)法测定的烟碱表观油水分配系数之间有显著差异。

一方面，因超高效液相色谱(UPLC)法既可以检测油相样品中烟碱含量，又可以检测水相样品中烟碱含量，方法简便。

另一方面，因气相色谱-质谱(GC-MS)法不能直接用于水相样品中烟碱含量的检测，其数值需经过式4计算得到。这就导致水相样品中烟碱含量计算值(C

再者，气相色谱-质谱(GC-MS)法仅适用于挥发性或半挥发性物质的分析检测，适用范围有限。

基于本发明建立的判别不同仪器测定烟碱油水分配系数差异程度的t检验方法，结合超高效液相色谱(UPLC)法及气相色谱-质谱(GC-MS)法各自特点及其适用范围，得出结论：采用超高效液相色谱(UPLC)法测定烟碱表观油水分配系数较为理想。

结果应用：

因药物的油水分配系数被定义为药物在正辛醇和水之间的分配系数的对数，通常被用作表征药物亲脂性的参数。药物的亲脂性是药物的一种重要理化性质，它与药物在生物体内的药代动力学过程(包括吸收、分布、代谢、排泄和毒理学，甚至和血脑屏障渗透性及药物的清除等)都有重要的关系。所以药物在生物体内的溶解、吸收、分布、转运与药物的油水分配系数有关。研究表明，适合人体吸收的药物表观油水分配系数lgP

在对传统烟草制品(如：中式卷烟、混合型卷烟、雪茄烟等)进行研究及开发时，尤其在对新型烟草制品(如：电子烟、电加热不燃烧卷烟、袋装口含型无烟气烟草制品、烟碱含片、烟碱硬质糖、烟碱口胶剂、烟碱吸入剂、烟碱喷鼻剂、烟碱贴剂等)进行烟碱剂型设计、剂量设计、产品配伍和工艺设计，以及质量控制时，采用超高效液相色谱(UPLC)法测定产品中烟碱的表观油水分配系数较为理想。

以上内容，显示并描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的内容只用于说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。