一种检测猪伪狂犬病病毒的扩增引物对、试剂盒

技术领域

本发明涉及一种动物病毒的检测方法，尤其涉及一种检测猪伪狂犬病病毒的扩增引物对、试剂盒，属于分子生物学检测技术领域。

背景技术

伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的以发热和急性脑脊髓炎症为主要特征的急性、热性传染病。具有易感动物多、传播途径多、潜伏期感染持续排毒等多种特征。因其主要症状类似狂犬病，故称为伪狂犬病。猪是PR的主要传染源和天然宿主。健康猪群直接接触患病猪、带毒猪即可直接感染伪狂犬病。该病在导致妊娠母猪出现流产、死胎、木乃伊胎等繁殖机能障碍的同时，可引起断奶仔猪和育肥猪出现呼吸道症状，初生仔猪表现为腹泻及神经症状，感染率和死亡率可达100％，给猪养殖业带来了严重的经济损失。快速、准确地检测患病猪与带毒猪对于生猪养殖业健康发展具有重要意义。

当前，欧美发达国家通过使用gE缺失疫苗和DIVA(Differentiating Infectedfrom Vaccinated Animals)策略已净化了该病。我国也已将猪伪狂犬病列入需净化疫病的行列，并通过gE缺失疫苗有效遏制了猪伪狂犬病蔓延。然而，近年来PRV野毒株已发生新变异，毒力显著增强。目前国内外临床上均有人感染PRV的病例报道，主要表现为视网膜炎或眼内炎，严重者可表现为急性脑炎，甚至发展为神经系统症状，证实存在PRV跨物种感染人类的可能性。

根据目前已公开的专利或文献中猪伪狂犬病病毒检测方法包括病毒分离培养、基于免疫学的检测技术(酶联免疫吸附试验、免疫层析技术、荧光微球免疫检测方法)和基于核酸的检测技术(常规PCR、定量PCR、数字PCR、基于PCR的衍生技术、环介导等温扩增、重组酶聚合酶扩增以及重组酶介导核酸等温扩增技术)。但是，这些方法均有着各自的局限性，如病毒分离培养操作繁琐、耗时较长(通常需要3～5天)。免疫学检测方法容易受到抗原抗体交叉反应影响，存在潜在的误判性。基于PCR的检测方法要么需使用存在潜在安全威胁的琼脂糖凝胶电泳、要么检测试剂和仪器成本高，难以大规模推广应用。同时，等温扩增技术目前在引物设计、反应体系成熟度、结果可重复性、灵敏度、特异性等方面仍有待改良和优化。

发明内容

发明目的：本发明的第一目的是提供了一种猪伪狂犬病病毒的特异性片段。本发明的第二目的是提供一种能够快速、准确检测出上述猪伪狂犬病病毒特异性片段的扩增引物对。本发明的第三目的是提供一种检测猪伪狂犬病病毒的试剂盒。本发明的第四目的是提供一种检测猪伪狂犬病病毒的检测方法。

技术方案：本发明所述的一种猪伪狂犬病病毒的特异性片段，所述特异性片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。

本发明所述的一种检测猪伪狂犬病病毒的扩增引物对，所述扩增引物对包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

进一步地，所述引物对的正向引物和反向引物的5’端分别标记有标记物，所述标记物包括生物素、地高辛、氨基、羧基、巯基或荧光基团中的一种或几种。

进一步地，所述引物对的有效浓度为0.1～1.0μM。

本发明所述的扩增引物对在制备检测猪伪狂犬病病毒的试剂或试剂盒中的应用。

本发明所述的一种检测猪伪狂犬病病毒的试剂盒，所述试剂盒含有上述的扩增引物对。

进一步地，所述扩增产物纯化试剂为磁珠分散液，所述磁珠为由具有超顺磁性的铁氧体纳米粒子为核、硅基氧化物/修饰层为壳构成的微球，所述磁珠的尺寸为0.1μm-10μm。

进一步地，所述铁氧体纳米粒子为Fe

进一步地，所述试剂盒为荧光检测试剂盒。

进一步地，使用试剂盒进行PCR荧光检测时的程序为：94℃预变性5分钟后开始扩增循环，每个循环的程序为：94℃变性20秒，61℃退火20秒，72℃延伸25秒，共40个循环；循环结束后，72℃延伸8分钟。

判定条件为：当荧光信号值≥257时，则待测液中含有猪伪狂犬病病毒；当荧光信号值＜257时，则待测液中没有猪伪狂犬病病毒。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下突出的显著优点：本发明提供的扩增引物对在检测猪伪狂犬病病毒时灵敏度高，特异性强。使用本发明提供的试剂盒进行检测时，检测用时短，操作简单、快速、安全，且能够有效防止假阳性结果，灵敏度可达到1.1×10

附图说明

图1为猪伪狂犬病病毒备选引物扩增猪伪狂犬病病毒核酸质控品琼脂糖凝胶电泳图，(其中，泳道1为引物对F1/R1，泳道2为引物对F2/R2，泳道3为引物对F3/R3)；

图2为猪伪狂犬病病毒优选引物反应温度测试琼脂糖凝胶电泳图，(其中，泳道1为58℃，泳道2为59℃，泳道3为60℃，泳道4为61℃)；

图3为猪伪狂犬病病毒核酸质控品PCR产物荧光试纸检测结果图；

图4为阴性对照(无酶水)PCR产物荧光试纸检测结果图；

图5为猪伪狂犬病病毒核酸质控品和阴性对照(无酶水)PCR产物荧光试纸暗场成像结果图；

图6为猪伪狂犬病病毒核酸质控品PCR产物纯化后荧光试纸检测结果图；

图7为阴性对照(无酶水)PCR产物纯化后荧光试纸检测结果图；

图8为猪伪狂犬病病毒核酸质控品和阴性对照(无酶水)PCR产物纯化后荧光试纸暗场成像结果图；

图9为猪伪狂犬病病毒荧光试纸检测方法的灵敏度结果图；

图10为猪伪狂犬病病毒荧光试纸检测方法的特异性结果图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。

以下实施例中所用扩增引物均由南京擎科生物科技有限公司进行合成，猪伪狂犬病病毒核酸质控品(购自普道(北京)标准技术有限公司，货号：PD-N-PRV-01)。

实施例1猪伪狂犬病病毒扩增引物的筛选

根据美国生物技术信息中心基因序列数据库GenBank中已公开的猪伪狂犬病病毒基因组序列(登录号：KU360259、KT983811、OP376823、MW893682、MW560175、MT949536)，使用BLASTn、DNASTAR、Mega 5.0等多序列分析工具进行基因组序列比对分析，以筛选猪伪狂犬病毒特异性保守基因。根据猪伪狂犬病病毒野毒株特异性基因gE的保守序列区域(SEQ IDNO：7，5’-ggaacccgtacggccggacgacgcccgggcggctgtttgtg ctggcgctgggctccttcgtgatgacgtgcgtcgtcgggggggccatctggctctgcgtgctgtgctcccggcgccgggcggcctcgcggccgttccgggtgccgacgcgggcgcggacgcacatgctctctccggtgtacaccagcctgcccacgcacgaggactactacgacggcgacgacgacgacgacgaggaggcgggcgtcatccgccggcggcccgcctcccccagcggagacagcggctacgaggggccgtacgcgagcctggaccccgaggacgagttcagcagcgacgaggacgacgggctgtacgtgcgccccgaggaggcgccccgctccggcttcgacgtctggttccgcgatccggagaaaccggaagtgacgaatggacccaactatggcgtgaccgccaaccgcct-3’)利用Primer Premier 5.0、Oligo 6.0、NUPACK(http://www.nupack.org/)等引物设计及分析工具进行等温扩增引物的设计。所设计引物进一步通过BLASTn和Primer-BL AST进行特异性验证，备选引物信息如表1(基于猪伪狂犬病病毒野毒株基因组特异性基因保守区域设计的备选等温扩增引物，其中，正向引物5’端标记生物素(Bio)，反向引物5’端标记地高辛(Dig))：

表1

以猪伪狂犬病病毒核酸质控品(浓度为1.1×10

结果如图1所示，3对引物在56℃退火温度条件下均有非特异性扩增产物出现。其中，第二对(F2/R2)和第三对(F3/R3)目标条带均较弱，且有较强的非特异性扩增产物。而第一对引物(F1/R1)是在第二对引物的基础上，遵循将引物对的核苷酸序列中G、C碱基调整为A、T碱基，或使GC碱基含量在40％～60％之间，且上述调整应避开3’端的末端的3个碱基的原则，将F1和R1引物序列中各1个G碱基调整为T碱基，以使F1和R1引物序列GC含量分别为60％和52.2％，因而目标条带较为明亮，可见该对引物目标产物为主要扩增产物。因此，选择第一对引物(F1/R1)作为后续实验的引物对。

实施例2猪伪狂犬病病毒扩增反应温度的优化

以猪伪狂犬病病毒核酸质控品(浓度为1.1×10

结果如图2所示，随着退火温度的升高，非特异性扩增产物逐渐减少、目标产物带条逐渐增强。因此，选择61℃作为优选的扩增反应退火温度。

实施例3猪伪狂犬病病毒PCR产物荧光检测方法的建立

以猪伪狂犬病病毒核酸质控品(浓度为1.1×10

结果如图3和图4所示，当PCR产物直接使用荧光试纸检测时，阳性对照(猪伪狂犬病病毒核酸质控品)和阴性对照(无酶水)扩增产物均有较强的荧光的信号。图5所示试纸暗场成像结果与荧光信号值相符，阳性对照(猪伪狂犬病病毒核酸质控品)和阴性对照(无酶水)扩增产物的试纸检测线均显示出明亮的条带。

如图6(阳性对照)和图7(阴性对照)所示，当PCR产物经纯化后，阳性对照(猪伪狂犬病病毒核酸质控品)扩增产物仍显示较强的荧光信号，而阴性对照(无酶水)产物的荧光信号已降低至200以下(荧光曲线峰靠近x轴)。图8所示试纸暗场成像结果与荧光信号值相符，阳性对照(猪伪狂犬病病毒核酸质控品)扩增产物的试纸检测线显示出明亮的条带，而阴性对照(无酶水)扩增产物的试纸检测线无肉眼可见条带。结果表明，PCR产物纯化方案可有效降低阴性样品扩增产物导致的假阳性荧光信号，有利于实际应用。

实施例4猪伪狂犬病病毒荧光检测方法参考值的确定

以阴性对照(无酶水)为模板，20μL反应体系包括：10μL的2×PrimeSTAR GCBuffer(Mg

结果表2所示，通过对阴性对照(无酶水)进行10次扩增测试，阴性对照的扩增产物荧光信号均相对稳定(变异系数约为0.09)，有利于实际应用。同时，根据阴性对照的扩增产物荧光信号值计算出cutoff值(阴性对照扩增产物的荧光信号均值加上3倍的标准偏差)为257。

表2

*CV表示变异系数。

实施例5猪伪狂犬病病毒荧光检测试剂盒的敏感性测试

将猪伪狂犬病病毒核酸质控品从1.1×10

以梯度稀释的猪伪狂犬病病毒核酸质控品为模板，20μL反应体系包括：10μL的2×PrimeSTAR GC Buffer(Mg

检测结果如图9所示，荧光扩增曲线对应的猪伪狂犬病病毒核酸质控品模板浓度分别约为1.1×10

实施例6猪伪狂犬病病毒荧光检测试剂盒的特异性测试

使用猪伪狂犬病病毒核酸质控品(浓度为1.1×10

以上述病毒DNA(cDNA)为模板，分别制备20μL反应体系：10μL的2×PrimeSTAR GCBuffer(Mg

结果如图10所示，仅猪伪狂犬病病毒核酸质控品显示出特异性荧光曲线(荧光信号值大于257)，而猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪圆环病毒3型(PCV3)、猪细小病毒(PPV)、非洲猪瘟病毒(ASFV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)均无可见的荧光曲线峰(荧光信号值小于257)。结果表明，本发明快速荧光检测方法的特异性好，具有较高的检测应用价值。

实施例7检测试剂盒的组装

使用无酶水将正向引物(F1)和反向引物(R1)均稀释成10μM，等体积混合后得到检测引物。使用委托南京擎科生物科技有限公司合成的含有目标扩增片段(SEQ ID NO：7，5’-gcgctgggctccttcgtgatgacgtgcgtcgtcgggggggccatctggctctgcgtgctgtgctcccggcgcc gggcggcctcgcggccgttccgggtgccgacgcgggcgcggacgcacatgctctctccggtgtacaccagcctgcccacgcacgaggactactacgacggcgacgacgacgacgacgaggaggcgggcgtcatccgccggcggcccgcctcccccagcggagacagcggctacgaggggccgtacgcgagcctggaccccgaggacgagttcagcagcgacgaggacgacgggctgtacgtgcgccccgaggaggcgccccgctccggcttcgacgtctggttccgcgatccggagaaaccggaagtgacgaatggacccaactatggcg-3’)的质粒DNA(浓度为1×10

将以上所涉试剂和产品共同包装，再配以产品使用说明书(包括产品保存条件、反应体系配制方法、反应程序设置和结果判定方法等)，组装成本发明所述的基于核酸等温扩增的沙门氏菌荧光法快速检测试剂盒。

实施例8临床样本检测验证

用实施例3的方法对采集自江苏农林职业技术学院所属梅山猪和枫泾猪保种场的103份临床样本和17份疑似猪伪狂犬病病例的核酸样品(由扬州加农畜牧科技有限公司惠赠)进行检测，同时与PCR方法进行比较验证。PCR反应体系为20μL，包括：10μL的2×PrimeSTAR GC Buffer(Mg

表3

结果如表3所示，本发明提供的检测方法检出13份疑似病例核酸样品为猪伪狂犬病毒阳性，检测结果与PCR方法一致。同时，本发明方法检测猪伪狂犬病病毒可在1.5小时内完成(常规PCR需2个小时)，操作简单、快速、安全，无需使用存在安全威胁的琼脂糖凝胶电泳，且支持数字化判读，具有显著优势。验证结果表明，本发明所建立的检测方法具有较好的临床应用价值。