可无损操控和监测细胞球内部信号的立体培养装置及方法

技术领域

本发明涉及三维细胞培养技术领域，涉及一种细胞球培养装置及操控、监测细胞球内部信号的方法，尤其涉及一种可无损操控和监测细胞球内部信号的立体培养装置及方法。

背景技术

在神经科学与脑科学研究中，神经网络是非常热门的研究方向。传统方法是将神经细胞培养在微电极阵列上，记录细胞的电信号，研究分析神经细胞间的连接。然而大脑是三维的，体内的神经细胞都处在三维的环境中，所以为了更好的模拟体内的环境，越来越多的研究开始关注三维细胞球培养，三维类脑器官等。

然而，传统的三维细胞球培养方法，如在水凝胶上培养细胞，很难对细胞球进行转移的操作，在移液枪进行吸取和释放的过程中，很容易对细胞球造成伤害，甚至破裂；同时，细胞球内部的信号不能被记录到，如果强行间探针插入细胞球内部，则会对细胞造成不可逆的损伤；传统培养方法中，细胞球的中心缺氧不可避免，随着细胞球直径的增大，内部细胞供养不足会大量死亡，影响神经细胞球的内部连接。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种可无损操控和监测细胞球内部信号的立体培养装置及方法，该装置及方法不仅能实现对细胞球的培养，而且可以极为方便地实现对细胞球的操控，以及对细胞球内、外部信号的监测，整个过程不会对细胞球造成损伤。

本发明采用的技术方案如下：

第一方面，本发明实施例的一种可无损操控和监测细胞球内部信号的立体培养装置，包括：

超低吸附细胞球培养腔室；所述腔室呈竖立管状，管内下段为琼脂糖固体培养基；

至少一根金属丝导线；所述导线除两端外表面包裹绝缘层并留出中间一定长度表面完全裸露；所述导线贯穿所述腔室且使得所述导线中间的裸露段恰好位于琼脂糖固体培养基上表面；

固定支架；所述固定支架用于固定所述腔室及所述导线。

上述技术方案中，进一步地，所述超低吸附细胞球培养腔室包括两端开口的超低吸附管和琼脂糖，所述超低吸附管上粗下细，琼脂糖位于超低吸附管的下段。

进一步地，所述的金属丝导线为铂线、金线、钨丝、银线或铜线。

进一步地，所述超低吸附细胞球培养腔室的管内径为2-12mm，具体可以根据所希望培养的细胞球的大小来决定，一般最适内径为目标细胞球直径的5倍左右。

进一步地，所述金属丝导线的直径为25-200μm，具体可以根据所希望培养的细胞球的大小来决定，一般最适直径为目标细胞球直径的1/10左右。

进一步地，所述导线的裸露段的长度为5-100μm，具体可以根据所希望培养的细胞球的大小来决定，一般最适长度为目标细胞球直径的1/50左右。

第二方面，本发明实施例提供上述任一种立体培养装置的制备方法，包括：

制作超低吸附细胞球培养腔室：先将琼脂糖加热至呈清澈透明液体，利用超低吸附管吸取液体至管体中段，室温下放置使琼脂糖凝固；

对金属丝导线进行绝缘处理：用胶带将金属丝两端固定在基片上，均匀涂抹上光刻胶，利用光刻技术掩膜、光照并用显影液处理后，在金属丝中间部分形成一段裸露段，其余部分包裹光刻胶；

培养装置组装：将所述超低吸附管竖立固定在支架上，用导线穿过超低吸附管，用固定夹上下夹住导线两端并拉直，使导线在所述超低吸附管正中央，且使裸露段恰好位于琼脂糖上表面。

第三方面，本发明实施例提供一种培养、操控细胞球和监测内部信号的方法，采用上述任一种立体培养装置，方法包括：

将细胞悬液沿导线加入超低吸附细胞球培养腔室中，随后将整个装置放入培养箱内；

每天换半液，5～10天形成细胞球并将导线包裹住；

将超低吸附细胞球培养腔室浸没到培养液中，缓缓抽出导线，细胞球即可随之被带出；

将导线携带细胞球放到平面电极上，即可记录细胞球外部的信号；

将导线两端连接至信号采集器，即可记录细胞球内部的信号。

上述技术方案中，进一步地，所述立体培养装置中导线设有多根，用于记录细胞球内部不同位置的信号。

本发明的有益效果是：

相比于传统的三维细胞培养方法，本发明的立体培养装置至少具有如下优势：①可以无损的将导线植入到细胞球内部，方便对细胞球位置进行操控；

②可以方便的利用导线直接记录细胞球内部信号，不会对细胞球造成伤害；

③制作简单，拓展性强，可以大批量生产。

附图说明

图1为本发明中立体培养装置的一种具体结构示意图；

图2为本发明采用立体培养装置培养的细胞球在相机下及显微镜下的照片；

图3为本发明所培养细胞球的内部、外部信号。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步地详细说明。

本发明提供一种可无损操控和监测细胞球内部信号的立体培养装置及方法，一方面是可以培养三维细胞球并无损地操控其到达目标位置，如孔板，电极，抑或是将两个细胞球放在距离很近的位置，观察它们之间的信号交流，另一方面是可以记录细胞球外部信号，也可在不损坏细胞球形态的情况下，记录到细胞球内部的电信号，研究细胞球内部的连接，并与外部记录的信号做比较。

本发明是利用超低吸附表面和琼脂糖基底，使细胞无法贴壁，从而形成细胞球；并预先设置好导线，诱导细胞球将导线包裹住，从而能够实现细胞球的无损转移以及球内信号记录。

立体培养装置包括：

超低吸附细胞球培养腔室；所述腔室呈竖立管状，管内下段为琼脂糖固体培养基；

至少一根金属丝导线；所述导线除两端外表面包裹绝缘层并留出中间一定长度表面完全裸露；所述导线贯穿所述腔室且使得所述导线中间的裸露段恰好位于琼脂糖固体培养基上表面；

固定支架；所述固定支架用于固定所述腔室及所述导线。

其中，超低吸附管可以直接购得，也可以自制得到，优选超低吸附管为上粗下细型，琼脂糖固体培养基位于超低吸附管的下段；导线可以是铂线、金线、钨丝、银线或铜线；超低吸附细胞球培养腔室的管内径可以根据所希望培养的细胞球的大小来决定，一般最适内径为目标细胞球直径的5倍左右；金属丝导线的直径可以根据所希望培养的细胞球的大小来决定，一般最适直径为目标细胞球直径的1/10左右；导线的裸露段的长度可以根据所希望培养的细胞球的大小来决定，一般最适长度为目标细胞球直径的1/50左右。

根据本发明的一种具体实例，如图1所示，本发明的立体培养装置包括：导线固定装置，具有中间裸露段的导线，两端开口的中空玻璃管，琼脂糖，玻璃管固定架。

玻璃管和琼脂糖组成超低吸附细胞球培养腔室，导线穿过玻璃管，导线固定装置包含一个固定架和两个鳄鱼夹，上下夹住导线两端并拉直；

中间裸露的导线会被细胞球包裹住，通过牵引导线控制细胞球的移动，同时可以记录细胞球内部的信号。

该实例中各组件的预先加工：

为了抑制细胞贴壁，玻璃管需要为超低吸附玻璃管(以下简称玻璃管)：将玻璃管浸泡在“anti-adhesion solution”(即防黏连溶液)里12小时以上，拿出并用气枪吹干。此时玻璃管表面变成超低吸附，细胞无法贴壁。

为了记录细胞球内部信号，需要中间裸露的导线(以下简称导线)：取一根极细的金属丝(直径100um的铂线)，用胶带将其两端固定在硅片上，均匀涂抹上光刻胶SU8 2010，并用旋涂机将其厚度控制在10微米左右。用光刻技术，在金属丝中间部分留下一段约10um的缺口(即裸露段)，并用显影液将其去除。通过这种方法，只要把裸露的部分放在细胞球内部，就可以记录到细胞球内部的信号。其他部分由于光刻胶的阻隔，不会记录到信号，并且大大降低了噪音。

本实施例中装置搭建及实验操作：

配置2％质量分数的琼脂糖，加热至100℃直至溶液变的清澈透明。

用玻璃管吸取琼脂糖至1/3处，室温下放置一分钟待其微微凝固，固定到架子上。其中“用玻璃管吸取琼脂糖”具体可采用橡胶管和注射器配合实现吸取：将橡胶管一端连接玻璃管，一端连接注射器，抽注射器来吸取琼脂糖至所需位置处(如管1/3处)，保持一分钟左右待琼脂糖微微凝固再移除橡胶管。

用导线穿过玻璃管，用固定夹上下夹住导线两端并拉直，使导线在玻璃管正中央。

将神经细胞消化，离心，重新悬浮至10

取100uL细胞悬液，沿导线缓缓加入玻璃管中，随后将整个装置放入培养箱内。

每天换半液，一周左右即可形成细胞球并将导线包裹住。其中细胞球形成的原理为：在琼脂糖基底上，细胞无法贴壁生长，而四周又是超低吸附玻璃表面，细胞会倾向性的聚团，形成细胞球；而细胞球包裹导线的原理为：琼脂糖在玻璃管内凝固时，由于表面张力作用，会形成微微凹陷的结构。导线设置在玻璃管中央也即凹陷中央位置，细胞球由于重力作用便会将其包裹住。

将玻璃管浸没到培养液中，缓缓抽出导线，细胞球也随之被带出，如图2所示。

将细胞球放到平面电极上，即可记录细胞球外部的信号，同时将导线连接至信号采集器，即可记录细胞球内部的信号，如图3所示。

本实例中用到的玻璃管的参数为：内径3mm，外径5mm，长度30mm，在本发明中玻璃管可以采用其他任意超低吸附管替代，其参数通常为内径2-12mm，外径4-14mm，长度30mm，且管体为上粗下细最好；

本例中所用到的导线的参数为：直径100μm，长度4cm，为铂线，在本发明中导线可以采用金线、铂线，铜线，钨丝等替代，其参数通常为直径25-200μm，长度4cm。

本发明所提供的装置结构简单、加工步骤简单，装配性好，所有组件可根据具体需要替换调整，且装置中可根据所需培养细胞球的大小选择所用管体的直径，还可以在管体内平行设置若干所述导线，记录细胞球不同位置的信号；利用该装置进行培养的细胞种类不限于神经细胞，可以为任意的需研究的细胞，如癌细胞球等，可以对细胞球进行培养、操控及监测信号以进行各种各样的研究。本发明装置具有极佳的普适性，可有利于批量生产。

以上所述仅为本发明的部分实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。