一种提高脐带间充质干细胞原代获取的方法

技术领域

本发明涉及一种干细胞的分离和培养方法，尤其涉及一种提高脐带间充质干细胞原代获取的方法。

背景技术

近年来，细胞药物研发成为药品研发的热点，不同来源的干细胞在国外已有上市药物。脐带间充质干细胞的获取和扩增技术，已有成熟的研究体系和应用，但稳定大量的规模化制备仍然是商业化生产需要解决的难点，尤其是在原代细胞获取阶段。

目前原代细胞获取的方法主要有两种，酶解法和爬瓶法。酶解法方法操作步骤较多，涉及多种仪器间的来回穿插，生产控制风险大；涉及到的生物酶，对细胞损伤难以评估，引入的生物活性物质残留难以检测，生物反应器来源大多为大肠杆菌等微生物，造成安全性风险增加。在制药行业中，对生产用原材料的控制使得这种方法应用并不广泛。

爬瓶法生产所采用的培养容器多为培养皿或带透气盖培养瓶，培养皿操作简单方便，但由于其开口大，且无法密封导致操作、转移和培养过程极易发生微生物污染；培养瓶则较好的降低了污染风险，但由于敞口变小，操作难度也相应增加。爬瓶法的爬出率和爬出量难以稳定，主要原因是细胞在华通胶组织中分布是不均匀的，该法不能够帮助提高细胞贴壁增殖，导致爬瓶法一般原代获取量一般小于酶解法且稳定不高。

近年某些生物器械厂家也推出了一些能够自动化处理脐带的器械。这些仪器普遍功能较少，仅作用于原代操作的某个阶段，例如对获得的华通胶进行操作，通量较小，单次脐带处理量较低，单次处理长达数个小时，价格较高，单台仪器超过10万元，某些仪器仍然需要联合生物酶才能发挥较好的作用，不适合在规模化制备上进行应用。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中干细胞原代获取量小、污染风险大的技术问题，提供一种提高脐带间充质干细胞原代获取的方法，基于爬瓶法进行优化和调整，使污染风险更小，原代获取量大大增加，且不引入风险评估困难的成分，使安全性提高，生产控制更容易。

本发明提供的技术方案如下：

一种提高脐带间充质干细胞原代获取的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)铺板：取组织块接种于细胞培养瓶，加入原代培养液，使组织块较均匀地贴附于细胞培养瓶表面；

(2)补液：培养3～7天后取出细胞培养瓶，补加37℃水浴预热后的原代培养液2～10mL，继续培养3～7天；

(3)换液：吸出培养废液，每瓶加入原代培养液10mL，继续培养，当不低于10个组织块且每个组织块40x放大至少1个视野的细胞爬出情况达到如下条件可进行传代：每个细胞瓶中成功爬出的组织块数量＞15个，每个组织块细胞爬出量可占满一个40×视野。

优选的，所述步骤(1)中接种组织块的量为0.25～0.75ml，接入培养液的量为2～12ml。

优选的，所述培养环境均为37℃、5％CO

优选的，原代细胞获取方法包括如下步骤：

A清洗：将组织块拨下，连同培养废液倒出，使用清洗液润洗细胞面2次，每次10mL，注意加液时不得直接冲洗细胞生长的表面；

B消化：加入2mL消化液，显微镜下观察，待细胞间出现裂隙并开始皱缩时，加入2mL终止液终止消化；

C离心计数：细胞悬液270×g离心5min，弃上清液，细胞沉淀重悬后得原代细胞(P

优选的，所述消化液为Gibco TryPLE

优选的，在进行铺板前先进行脐带处理，所述脐带处理包括如下步骤：

a清洗：将脐带在150mm培养皿中用镊子挤出残留血液，使用清洗液清洗3次及以上，每次不低于20mL，至无明显血色，用剪刀将脐带剪成1～3cm的小段；

b剔除：使用剪刀剪开静脉血管，用镊子轻轻刮除静脉血管壁；找出两根动脉血管并剔除；用镊子将华通胶撕下，置于含20mL原代培养液的50mL的离心管中。

c剪碎：加入清洗液清洗3次，每次不低于20mL，1200rpm离心5min，弃上清，用眼科剪剪碎成约1-2mm

通过采用上述技术方案，达到的技术效果如下：

本发明方法简单，污染风险低，原代获取量大大增加，且形态好，克隆率高。

附图说明

图1是不同原代获取方法的效果比较图，a为组织块贴壁法，b为胶原酶消化法，c为复合胶原酶消化法；

图2是不同原代获取方法的细胞传代效果比较图，A为组织块贴壁法，B为胶原酶消化法，C为复合胶原酶消化法。

具体实施方式

为了更进一步理解本发明技术方案，现结合实例予以说明。

实施例

首先先对脐带进行处理，所述脐带处理包括如下步骤：

a清洗：将脐带在150mm培养皿中用镊子挤出残留血液，使用清洗液清洗3次及以上，每次不低于20mL，至无明显血色，用剪刀将脐带剪成1～3cm的小段；

b剔除：使用剪刀剪开静脉血管，用镊子轻轻刮除静脉血管壁；找出两根动脉血管并剔除；用镊子将华通胶撕下，置于含20mL原代培养液的50mL的离心管中。

c剪碎：加入清洗液清洗3次，每次不低于20mL，1200rpm离心5min，弃上清，用眼科剪剪碎成约1-2mm

其次对组织块进行培养，包括如下步骤：

(1)铺板：取0.5ml组织块接种于细胞培养瓶，加入10ml原代培养液，使组织块较均匀地贴附于细胞培养瓶表面，在37℃、5％CO

(2)补液：培养7天后取出细胞培养瓶，补加37℃水浴预热后的原代培养液8mL，继续培养7天；

(3)换液：吸出培养废液，每瓶加入原代培养液10mL，继续培养，当不低于10个组织块且每个组织块40x放大至少1个视野的细胞爬出情况达到如下条件可进行传代：每个细胞瓶中成功爬出的组织块数量＞15个，每个组织块细胞爬出量可占满一个40×视野。

最后，获取原代细胞，获取方法包括如下步骤：

A清洗：将组织块拨下，连同培养废液倒出，使用清洗液润洗细胞面2次，每次10mL，注意加液时不得直接冲洗细胞生长的表面；

B消化：加入2mL Gibco TryPLETM胰酶替代物消化液，显微镜下观察，待细胞间出现裂隙并开始皱缩时，加入2mL人血白蛋白终止液终止消化；

C离心计数：细胞悬液270×g离心5min，弃上清液，细胞沉淀重悬后得原代细胞(P

对照例

目前文献报道的和常用的脐带原代处理方法主要分为3种：组织块贴壁培养法，胶原酶消化法和复合胶原酶消化法[尹富华,杨晓凤,黄胜男,et al.人脐带间充质干细胞3种分离制备方法的比较[J].临床检验杂志，2010，028(006):413-414.]。组织块贴壁培养法是一种组织块自然爬出的方法。胶原酶消化法是一种将脐带组织块使用酶消化，使组织块细胞消化成一个个小的细胞或细胞团，继续扩增从而获得原代细胞的方法。复合胶原酶消化法是在胶原酶消化法的基础上，增加酶种类进行消化，从而达到更好的获取效率和质量的方法。

据文献的对比实验结果，同等条件下的胰酶消化法未能成功分离培养出MSCs。原因可能是脐带组织成分和含量复杂，酶难以将其消化或消化过程可控性差导致分离稳定性差。[窦慧慧，郭文君，于丽，et al.人脐带间充质干细胞分离培养方法的研究[J].中国组织化学与细胞化学杂志，10.3870/zgzzhx.2010.02.016]酶的作用机制为分解蛋白质和胶质，使其中的MSCs暴露从而易被收集，然而酶的作用不具有特异性和指向性，在操作过程中受多种原因的限制，极易破坏细胞表面的膜结合蛋白和其他结构，对细胞产生不可预知的损伤，最终导致细胞状态差甚至死亡。胶原酶消化法和复合胶原酶消化法可控性差，风险发生时难以观察，风险发生后严重影响细胞质量且无法预知受影响的质量种类和程度，不符合生产工艺关于工艺稳定的要求。消化所使用的的酶，又将带来安全风险。从国家药品监督管理局查询到的胰酶药物均为口服剂型，未查询到注射剂型，则在生产工艺的选择中，除了必须要使用的情况外，应尽量避免使用胰酶或其他酶类。胶原酶消化法和复合胶原酶消化法在细胞药物生产上适用性不强。

针对文献报道结果，我们重复文献[尹富华,杨晓凤,黄胜男,et al.人脐带间充质干细胞3种分离制备方法的比较[J].临床检验杂志，2010，028(006):413-414.]中的实验，对细胞进行克隆形成率检测，收集数据并进行评估。

实验结果

由上表可知，从原代组织块的爬出情况来看，结合图1可以看出，本实施例中组织块贴壁法最好，爬出量最多形态最正常(梭型、螺旋状生长)；胶原酶消化法仅有零星细胞爬出和存活，生殖活性似乎受到了损伤而不再扩增；复合胶原酶消化法有细胞爬出和生长，但生长情况一般。而本发明技术方案克服了传统技术中胶原酶消化法的弊端，具有较高的爬出量，且细胞形态良好。

从细胞传代效果来看：将获取的原代细胞继续培养，形态观察，计算每个培养容器(T75细胞培养瓶)的细胞收获量并进行克隆形成率的检测。结合图2可以看出，本实施例组织块贴壁法细胞收获量最高，克隆形成率较好，细胞形态较好。本发明实施例克服了现有技术胶原酶消化法的弊端，不仅得到形态良好的细胞，细胞收获量和克隆形成率得到明显提升。