一种资源化利用干贝提高抗氧化能力的方法

技术领域

本发明涉及一种资源化利用干贝提高抗氧化能力的方法，尤其是一种利用微生物协同发酵制备高抗氧化能力的干贝多肽生物制品，属于海洋生物技术领域。

背景技术

干贝即扇贝的干制品，其味道、色泽、形态与干贝、干贝不相上下。古人曰：“食后三日，犹觉鸡虾乏味。”可见干贝之鲜美非同一般。干贝富含蛋白质、碳水化合物、核黄素和钙、磷、铁等多种营养成分，蛋白质含量高达61.8％，为鸡肉、牛肉、鲜对虾的3倍。矿物质的含量远在鱼翅、燕窝之上。干贝含丰富的谷氨酸钠，味道极鲜。与新鲜扇贝相比，腥味大减。干贝具有滋阴补肾、和胃调中功能，能治疗头晕目眩、咽干口渴、虚痨咳血、脾胃虚弱等症，常食有助于降血压、降胆固醇、补益健身。据记载，干贝还具有抗癌、软化血管、防止动脉硬化等功效。

目前干贝作为海珍品深受广大消费者青睐，食用方式主要以即食和干制品为主，存在着一定的弊端，一是食用方式单一，缺乏干贝功能性强的活性提取物及其应用；二是烹制过或提取程中大量营养成分流失，影响功效；三是食用不便。因此，干贝营养保健品的开发既能充分发挥干贝的食效、药效功能，又便于消费者食用，顺应市场需求，具有较好的市场前景，这就对干贝工功能活性物质的提取提出了更高的要求。

现有技术中，关于干贝多肽及其在食品中的应用研究较少，如专利201610271264.X公开了一种扇贝抗氧化肽的制备方法，选用扇贝加工废弃物——扇贝外套膜及加工碎肉为主要原料，通过生物酶解技术制备抗氧化肽，在最优酶解条件下测定DPPH的清除率达到70.32％，所得产品可作为功能食品直接食用或作为附加材料添加到其他食品中，增强保健作用。比较上述文献可以发现，关于干贝多肽的制备多采用复合酶解法，缺少复合微生物发酵关键技术的应用，尤其是缺乏提高干贝多肽营养性的研究成为制约产业发展的关键瓶颈。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，满足干贝多肽高效提取及高抗氧化能力应用，本申请提供一种资源化利用干贝提高抗氧化能力的方法，集成现代生物分离技术、生物酶解技术、混菌微生物发酵技术，研制开发出高体外抗氧化能力的干贝多肽生物制品，满足保健、医疗、食品等领域对干贝多肽的应用需求，该工艺工艺简单高效、所得产品抗氧化能力和自由基清除能力强，生产成本低，易于工业化规模生产。

本发明通过下述技术方案实现上述技术效果：

一种资源化利用干贝提高抗氧化能力的方法，其特征在于具体包括如下步骤：

(1)溶解：将干贝粉碎，加水搅拌至完全溶解；

(2)酶解：向溶解后的加入干贝蛋白质量比2～3％的复合蛋白酶，控温40～60℃条件下酶解4～8h；

(3)好氧发酵：向酶解后的酶解液中加入酶解液质量比2～3％的复合微生物菌剂，在28～35℃条件下好氧发酵6～12h；

(4)厌氧发酵：好氧发酵结束后加入1～2％的乳酸杆菌粉，在28～35℃条件下厌氧发酵8～16h；

(5)过滤：进行粗过滤除去发酵菌体；

(6)灭酶：在100℃条件下灭酶10min；

(7)离心：以10000r/min速率离心分离，上清液即为干贝多肽提取液。

上述步骤(1)中最佳加水比例为干贝：水＝1:8。

优选的，在干贝溶解过程中加入干贝蛋白质量比2～3％的党参。

上述步骤(2)中所述复合蛋白酶为菠萝蛋白酶和胰蛋白酶的组合，其质量比为2:1。

上述步骤(3)中所述复合微生物菌剂为黑曲霉和枯草芽孢杆菌的混合菌剂，其质量比组成为2:3。

上述步骤(3)中好氧发酵过程在发酵罐中进行时通风量为0.1～ 0.2m

黑曲霉的种子液的制备方法为：在无菌条件下，采用土豆培养基在35～ 40℃条件下培养24h，制得黑曲霉种子液，要求种子液的有效活菌数≥10

上述枯草芽孢杆菌种子液制备方法为：在无菌条件下，采用LB培养基在 28～32℃条件下培养24h，制得液体枯草芽孢杆菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥10

本发明提供一种资源化利用干贝提高抗氧化能力的方法，所得干贝多肽具有较强的抗氧化能力，提取液可根据应用途径做浓缩、吸附干燥、醇析或树脂纯化等处理，满足在保健、食品、医药等领域的高效利用。

本发明提供一种资源化利用干贝提高抗氧化能力的方法，与现有技术相比，具有以下显著优势：

(1)本申请以干贝为原料，集成现代生物分离技术、生物酶解技术、混菌微生物发酵技术，显著提升了干贝抗氧化能力；尤为重要的是，本申请创造性的发现，在干贝蛋白溶解液中加入一定比例的党参可以显著提高酶解发酵法制备的干贝多肽的抗氧化能力，分析原因可能是补益类中草药能够促进微生物的发酵作用，且党参中的活性物质与干贝多肽产生复杂的化合反应，进一步提升产品的抗氧化能力；

(2)本申请利用好氧菌(黑曲霉、枯草芽孢杆菌)共同发酵干贝提取干贝多肽，充分利用微生物间的协同作用，提升干贝多肽的提取率和体外抗氧化能力，其中：黑曲霉在发酵过程中会产生各种降解细胞壁的酶类，使得更多的多肽等功能活性物质从细胞壁中释放出来，有利于提升干贝多肽的体外抗氧化能力；枯草芽孢杆菌在高温发酵过程中能够杀灭发酵液中的致病菌，并具有较强的产淀粉酶、蛋白酶等能力，可以将大分子淀粉、蛋白物质降解为微生物所利用；黑曲霉与枯草芽孢杆菌的协同作用显著提升了产品的抗氧化能力；

(3)，本发明采用乳酸杆菌进行厌氧发酵，提升了干贝多肽的稳定性，试验结果表明，在20～80℃范围内，温度和时间对干贝蛋白水解肽抗氧化性影响不大，当温度超过100℃时抗氧化性随着温度和时间的增加开始降低，稳定性高于目前报道的技术水平；

(4)采用液体发酵，提高了菌体的生长速率，缩短了发酵时间，提升了生产效率；发酵工艺条件温和，生产成本低，且易于规模化生产。

具体实施方式

在本申请中，黑曲霉和枯草芽孢杆菌的活化方法如下：

(1)黑曲霉种子液制备方法为：在无菌条件下，采用土豆培养基在35～40℃条件下培养24h，制得黑曲霉种子液，要求种子液的有效活菌数≥10

(2)上述枯草芽孢杆菌种子液制备方法为：在无菌条件下，采用LB培养基在 28～32℃条件下培养24h，制得液体枯草芽孢杆菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥10

实施例1

一种资源化利用干贝提高抗氧化能力的方法，具体工艺步骤包括：

(1)溶解：将干贝粉碎，加水搅拌至完全溶解；加水比例为干贝：水＝1:8；

(2)酶解：向溶解后的加入干贝蛋白质量比3％的复合蛋白酶，控温40～60℃条件下酶解6h；所述复合蛋白酶为菠萝蛋白酶和胰蛋白酶的组合，其质量比为 2:1；

(3)好氧发酵：向酶解后的酶解液中加入酶解液质量比2％的复合微生物菌剂，在28～35℃条件下好氧发酵12h；所述复合微生物菌剂为黑曲霉和枯草芽孢杆菌的混合菌剂，其质量比组成为2:3；好氧发酵过程在发酵罐中进行时通风量为 0.1～0.2m

(4)厌氧发酵：好氧发酵结束后加入2％的乳酸杆菌粉，在28～35℃条件下厌氧发酵8h；

(5)过滤：进行粗过滤除去发酵菌体；

(6)灭酶：在100℃条件下灭酶10min；

(7)离心：以10000r/min速率离心分离，上清液即为干贝多肽提取液。

测定实施例1中干贝多肽提取液的抗氧化能力，其中·OH自由基清除率的测定参照邵秀芝等《食品化学试验》中所述方法；ABTS自由基清除率和DPPH 自由基清除率的测定参照林恋竹等《反应时间对DPPH法、ABTS法评价抗氧化性结果的影响》中所述方法；测定结果如下：

上述实验中对照1组为实施例1中不含好氧发酵工艺的干贝多肽产品；对照2 组为实施例1中好氧发酵中仅添加黑曲霉进行发酵后的干贝多肽产品，其余同实施例1；对照3组为实施例1中好氧发酵中仅添加枯草芽孢杆菌进行发酵后的干贝多肽产品，其余同实施例1。

实施例2

一种资源化利用干贝提高抗氧化能力的方法，具体工艺步骤包括：

(1)溶解：将干贝粉碎，加水搅拌至完全溶解，并加入干贝蛋白质量比2％的党参；加水比例为干贝：水＝1:8；

(2)酶解：向溶解后的加入干贝蛋白质量比3％的复合蛋白酶，控温40～60℃条件下酶解6h；所述复合蛋白酶为菠萝蛋白酶和胰蛋白酶的组合，其质量比为 2:1；

(3)好氧发酵：向酶解后的酶解液中加入酶解液质量比2％的复合微生物菌剂，在28～35℃条件下好氧发酵12h；所述复合微生物菌剂为黑曲霉和枯草芽孢杆菌的混合菌剂，其质量比组成为2:3；好氧发酵过程在发酵罐中进行时通风量为 0.1～0.2m

(4)厌氧发酵：好氧发酵结束后加入2％的乳酸杆菌粉，在28～35℃条件下厌氧发酵8h；

(5)过滤：进行粗过滤除去发酵菌体；

(6)灭酶：在100℃条件下灭酶10min；

(7)离心：以10000r/min速率离心分离，上清液即为干贝多肽提取液。

测定实施例2中干贝多肽提取液的抗氧化能力，测定方法同实施例1中所述的抗氧化性能测定方法。试验结果如下：

上述实验中对照1组为实施例2中不含好氧发酵的干贝多肽产品；对照2组为实施例2中好氧发酵中仅添加黑曲霉进行发酵后的干贝多肽产品，其余同实施例2；对照3组为实施例2中好氧发酵中仅添加枯草芽孢杆菌进行发酵后的干贝多肽产品，其余同实施例2。

实施例3

一种资源化利用干贝提高抗氧化能力的方法，具体工艺步骤包括：

(1)溶解：将干贝粉碎，加水搅拌至完全溶解，并加入干贝蛋白质量比3％的党参；加水比例为干贝：水＝1:8；

(2)酶解：向溶解后的加入干贝蛋白质量比3％的复合蛋白酶，控温40～60℃条件下酶解6h；所述复合蛋白酶为菠萝蛋白酶和胰蛋白酶的组合，其质量比为 2:1；

(3)好氧发酵：向酶解后的酶解液中加入酶解液质量比2％的复合微生物菌剂，在28～35℃条件下好氧发酵12h；所述复合微生物菌剂为黑曲霉和枯草芽孢杆菌的混合菌剂，其质量比组成为2:3；好氧发酵过程在发酵罐中进行时通风量为 0.1～0.2m

(4)厌氧发酵：好氧发酵结束后加入2％的乳酸杆菌粉，在28～35℃条件下厌氧发酵8h；

(5)过滤：进行粗过滤除去发酵菌体；

(6)灭酶：在100℃条件下灭酶10min；

(7)离心：以10000r/min速率离心分离，上清液即为干贝多肽提取液。

测定实施例3中干贝多肽提取液的抗氧化能力，测定方法同实施例1中所述的抗氧化性能测定方法。试验结果如下：

上述实验中对照1组为实施例3中不含好氧发酵的干贝多肽产品；对照2组为实施例3中好氧发酵中仅添加黑曲霉进行发酵后的干贝多肽产品，其余同实施例3；对照3组为实施例3中好氧发酵中仅添加枯草芽孢杆菌进行发酵后的干贝多肽产品，其余同实施例3。

以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对被发明进行了详细的说明，但对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而对这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。