一种检测前列腺癌的生物标志物、分子探针以及试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学检测技术领域，尤其涉及一种检测前列腺癌的生物标志物、分子探针以及试剂盒。

背景技术

2016年Nature Genetics杂志报道了tRNA是一种高丰度的、广泛存在的、被动参与的mRNA解码器及蛋白翻译元件。tRNA通过其反密码子与mRNA的密码子结合而显著影响生物学过程和疾病进展。同时，tRNA在体液中高丰度存在的特点使其成为临床应用的生物标志物，可被运用到肿瘤增殖、转移的检测中。

2019年Pan Jiang等在Current Medicinal Chemistry杂志上综述报道了tRNA在特定的核酸酶作用下被剪切为tRF和tiRNA，tRF和tiRNA属于一类小的非编码RNA，被统称为tsRNA。tRF分为tRF-1,tRF-2,tRF-3,tRF-5和i-tRF；tiRNA分为5’tiRNA和3’tiRNA。tRF和tiRNA在抑制蛋白质合成、调节基因表达、启动病毒逆转录酶和调节DNA损伤反应中发挥重要作用，可视为tRNA的功能单位。

虽然tRNA在肿瘤增殖转移中发挥了重要作用，但其在体内稳定性不足，限制了其生物学作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测前列腺癌的生物标志物、分子探针以及试剂盒，该生物标志物具有较高的稳定性，分子探针具有较高敏感性与特异性。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种检测前列腺癌的生物标志物，所述生物标志物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

作为优选，所述生物标志物的核苷酸序列包括编码Argonaute蛋白的核苷酸序列和编码3’tRF-mtProTGG的核苷酸序列。

本发明提供了所述的生物标志物在制备检测前列腺癌的试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种检测前列腺癌的试剂盒，所述试剂盒包括检测所述的生物标志物的试剂。

本发明还提供了一种检测前列腺癌的分子探针，所述分子探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述分子探针的核苷酸序列为所述的生物标志物核苷酸序列的第27～60位。

本发明还提供了所述的分子探针在制备检测前列腺癌的试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种检测前列腺癌的试剂盒，所述试剂盒包括所述的分子探针。

本发明的有益效果：

本发明提供一种检测前列腺癌的生物标志物、分子探针以及试剂盒，本发明通过检测血液中Argonaute蛋白与3’tRF-mtProTGG复合体相对表达量，评判前列腺癌细胞的增殖水平。相比较于目前单纯检测血液中3’tRF-mtProTGG含量，更具实际意义。因血液中3’tRF-mtProTGG容易降解，而Argonaute蛋白与3’tRF-mtProTGG复合体更加稳定，更能体现其生物学效应。同时我们将检测Argonaute蛋白与3’tRF-mtProTGG复合体的探针优化为34个核苷酸GGGTCAGAGAAAAAGTCTTTAACTCCACCATTAG序列，具有较高敏感性与特异性。

附图说明

图1为健康人血液中的Argonaute蛋白与tRNA复合体的表达情况；

图2为前列腺癌患者血液中的Argonaute蛋白与tRNA复合体的表达情况；

图3为健康人和前列腺癌患者血液中Argonaute蛋白与tRNA复合体差异表达情况。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1复合体的筛选

选取2023年扬州大学附属医院体检确诊为前列腺患者1名和健康志愿者1名，分别抽取前列腺患者和健康志愿者的血液各10mL，送至数谱(上海)生物科技有限公司检测样本中的tRNA-Argonaute蛋白复合体(合同编号2304008)(如图1～2所示)。图1为健康人血液中的Argonaute蛋白与tRNA复合体的表达情况，图2为前列腺癌患者血液中的Argonaute蛋白与tRNA复合体的表达情况。

通过健康人和前列腺癌患者的Argonaute蛋白与tRNA复合体表达情况的差异性进行分析，得到508个上调表达与418个下调表达(如图3所示)，在此基础上人工筛选出上调表达差异性最大一种tRNA-Argonaute蛋白复合体，即Argonaute蛋白与3’tRF-mtProTGG复合体。

实施例2分子探针的制备

3’tRF-mtProTGG与Argonaute蛋白结合处有60个核苷酸片段，作为生物标志物，具体为SEQ ID NO.1：GGGCGGGCGCCAAAAGGCGCCCGCCCGGGTCAGAGAAAAAGTCTTTAACTCCACCATTAG，将其中第27～60位核苷酸序列(34个核苷酸序列)作为检测探针，该检测探针的序列为SEQ ID NO.2：GGGTCAGAGAAAAAGTCTTTAACTCCACCATTAG。将此核苷酸序列GGGTCAGAGAAAAAGTCTTTAACTCCACCATTAG提供给武汉博士德生物工程有限公司(https://www.boster.com.cn)，由该公司制作成荧光原位杂交探针。

实施例3Argonaute蛋白与3’tRF-mtProTGG复合体的检测

(1)裂解组织

①抽取前列腺癌患者的血液10ml置于采血管中，随即在4℃，8000r/min下离心20min，得到沉淀和上清液；

②弃上清液后，加入1ml RIPA裂解液(赛默飞公司生产，货号89900)

充分混匀，冰浴超声5min，溶液澄清；

③在4℃，8000r/min下离心20min，取上清液至新的采血管。

(2)Argonaute蛋白制备

①取步骤(1)③中所述的上清液50μl在4℃下旋转孵育3h；

②用1mlNETbuffer液(上海如吉生物科技发展有限公司)清洗4遍，再用PBS缓冲液清洗1遍，每次清洗完颠倒混匀；

③用1ml PBS缓冲液重悬，然后取700μl抽RNA，测浓度，反转；

④将步骤③中剩余的300μl经离心后去除上清液，加30μl裂解液和5×loading液15μl(均购自宝日医生物技术(北京)有限公司)，95℃下孵育10min，孵育后对液体进行琼脂糖凝胶电泳，首先取一定量的琼脂糖于500ml容量的三角瓶中，并加入TAE缓冲液(购自购自赛默飞世尔科技公司)，于微波炉中进行加热，使得琼脂糖全部溶解；接着加入核酸染料(购自购自赛默飞世尔科技公司)，摇晃均匀。溶解液倒入插入梳子的胶盒，等待直到胶凝固；然后将胶轻轻放入电泳槽，并使TAE缓冲液将胶完全浸没；最后取上述已制备溶液中的5μl注入胶孔，打开电泳槽开关，30min后关闭电泳槽。

(3)考染脱色

①使用考马斯亮蓝染色试剂盒(购自上海咏科生物科技有限公司)对步骤(2)制备得到的胶体进行染色。对染色后的胶体进行切割，将切好的胶条放在脱色液(购自上海泽叶生物科技有限公司)中，脱色液没过胶条即可，震荡30min。

②换脱色液重复操作1次，至胶条颜色变浅至无色，得到脱色胶条。

(4)还原和烷基化

①向步骤(3)得到的脱色胶条中加入500μl乙腈浸泡10min，待胶条收缩、变白后，在27℃下8000rpm离心20min，收集沉淀。

②在步骤①的沉淀中加入10μl 5mmol/LTECP(四氯苯酚)，没过沉淀，在55℃下培育10min。

③冷却至27℃后，加入10μl 10mmol/L吲哚乙酸至试管内液体体积翻倍，避光反应20min。

④弃去所有液体，在沉淀中加入500μl乙腈反应10min，待沉淀收缩后，在27℃下8000rpm离心20min，然后去除所有液体。

(5)胰酶消化

加入50μl胰蛋白酶溶液(配制按：1μg胰蛋白酶放入100μlABC缓冲液)至胶条中，在4℃下放置30min，胶条吸收膨胀完全，在4℃下放置90min，胰蛋白酶溶液完全与胶条饱和，再加入20μlABC缓冲液，在37℃下酶切过夜。于4℃，8000r/min下离心30min，收集沉淀物。

(6)细胞切片准备

对收集的沉淀物用95％乙醇固定24h，固定后经标准化脱水、浸蜡流程制作成细胞蜡块。于切片机上切片，厚度3～5μm，切片后立即在65℃烤片2h，烤片后脱蜡得到切片。

(7)前处理

取步骤(6)制得的切片于室温下浸入100％乙醇中5min，并重复一遍；取出切片后分别浸入80％、75％梯度乙醇和去离子水中各3min；接着浸入煮沸的通透剂中30min；然后将切片浸入预热的37℃胃蛋白酶工作液中消化10min；取出切片后浸泡于2×SSC缓冲液(购于上海创赛科技有限公司)中漂洗2次，每次5min；取出切片后分别浸入70％、85％和100％梯度乙醇各3min；取出切片后室温晾干，得到处理后的切片。

(8)杂交

取出实施例2所述的荧光原位杂交探针，于25℃下静置5min，上下颠倒混匀探针，然后在8000r/min下离心2min，取10μl滴于步骤(7)所述的处理后的切片上。立即盖上与组织大小相符的盖玻片，并用橡皮胶封边；将玻片置于杂交仪上，85℃共变性5min，37℃杂交过夜。

(9)洗涤、复染与观察

取出杂交后的切片，去除盖切片上的橡皮胶，将切片浸入2×SSC缓冲液(购于上海创赛科技有限公司)中5s，用镊子轻轻将盖薄片揭去；将切片置于37℃预热的2×SSC缓冲液(购于上海创赛科技有限公司)浸泡40min；取出切片浸入提前60℃预热的2×SSC缓冲液(购于上海创赛科技有限公司)10min，然后浸入0.1％NP-40/2×SSC溶液(购于上海创赛科技有限公司)中洗涤5min；取出切片浸入75％乙醇中，浸泡3min；将10μl的DAPI复染剂(购于上海创赛科技有限公司)滴于切片上，立即盖上盖玻片；暗处静置10min后使用荧光显微镜观察。

按照上述方法检测正常人的血液中的Argonaute蛋白与3’tRF-mtProTGG复合体含量。

实施例4Argonaute蛋白与3’tRF-mtProTGG复合体的结果判定

由于Argonaute蛋白与3’tRF-mtProTGG复合体对前列腺癌细胞具有促进增殖的作用，因此以第一次血液中荧光原位杂交检测值为基准，当第二次及以上的检测时荧光原位杂交检测值下降，表明Argonaute蛋白与3’tRF-mtProTGG复合体增加，前列腺癌细胞增殖水平提升；当第二次及以上检测时荧光原位杂交检测值上升，表明Argonaute蛋白与3’tRF-mtProTGG复合体减少，前列腺癌细胞增殖水平降低。

综上所述，本发明提供了一种检测前列腺癌的生物标志物、分子探针以及试剂盒，该生物标志物具有较高的稳定性，分子探针具有较高敏感性与特异性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。