一株高产褪黑素的葡萄酿酒酵母及其应用

技术领域

本发明涉及葡萄酒酿造技术领域，具体涉及一株高产褪黑素的葡萄酿酒酵母及其应用。

背景技术

褪黑素，又叫松果体素，是动物体和人体内一种广泛存在的具有生理功能的生物胺类物质，生理作用非常广泛。目前已知的褪黑素的生理功能主要有调节生物体的昼夜节律、缓解睡眠障碍、抗氧化等，褪黑素及其代谢产物都有强大的自由基清除能力，而且能够诱导生物体相关抗氧化酶活性增强、增强免疫作用、抗肿瘤、抗衰老等，特别是对阿尔茨海默病有明显的效果。通过日常饮用含有褪黑素的食品来补充褪黑素是一种更加环保、绿色、自然的保健方式，更符合未来的发展方向。

葡萄酒本身作为一种健康饮品，里面含有许多功能性成分，如多酚类、黄酮醇、黄烷醇、花色苷、白藜芦醇等营养成分，但葡萄酒中成分有上千种，活性物质非常多，褪黑素就是近几年新发现的葡萄酒中的功能性成分。经过近几年研究表明，葡萄酒中褪黑素主要是由酵母酒精发酵过程中产生的，但是目前商业葡萄酒酵母褪黑素的生成量普遍偏低。所以为酿造富含褪黑素的保健葡萄酒，选育高产褪黑素的葡萄酿酒酵母很有必要。

采用酵母合成褪黑素以增加葡萄酒中褪黑素含量具有诸多优势，如反应条件温和、不涉及有毒有害的化学试剂；加之酵母生长周期短，能够实现葡萄酒快速发酵，产物合成效率高。赵宏伟等人发明的“一种高效合成褪黑素的基因工程菌及其构建方法与应用”(CN111394269A)是以酿酒酵母为宿主细胞，过表达色氨酸合成酶基因TRP5，敲除了吲哚胺2，3-双加氧酶基因BNA2，提高酵母褪黑素的生成量，但是此方法需要对两个基因进行操作，且耗时耗力，成本高、效率低。也有研究通过过表达葡萄中VvASMT1基因来提高葡萄中褪黑素的含量，但是VvASMT1基因是在葡萄上发现的，在酿酒酵母中是不存在VvASMT1基因的，在酿酒酵母中异源过表达VvASMT1基因的技术难度较大。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一株高产褪黑素的葡萄酿酒酵母及其应用。采用本发明的酿酒酵母生产葡萄酒可有效提高葡萄酒中褪黑素的含量。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一株高产褪黑素的酿酒酵母TS001(Saccharomycescerevisiae)，已于2021年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其生物保藏号为：CGMCCNO.21601。

本发明的第二方面，提供上述高产褪黑素的酿酒酵母的构建方法，包括以下步骤：

以酿酒酵母C P1118P(Saccharomyces cerevisiae)为出发菌株，过表达VvASMT1基因。

本发明的第三方面，提供上述酿酒酵母在如下(1)或(2)中的应用；

(1)生产褪黑素；

(2)提高葡萄酒中褪黑素的含量。

本发明的第四方面，提供一种提高葡萄酒中褪黑素含量的方法，包括以下步骤：

将生物保藏号为CGMCC NO.21601的酿酒酵母TS001(Saccharomyces cerevisiae)接种于灭菌后的葡萄汁中进行发酵。

优选的，所述发酵条件为：发酵温度控制在25-30℃，含糖量低于4g/L时终止发酵。

本发明的第五方面，提供一种富含褪黑素的保健葡萄酒，所述保健葡萄酒是以生物保藏号为CGMCC NO.21601的酿酒酵母TS001(Saccharomyces cerevisiae)为发酵菌株酿制而成。

本发明的有益效果：

(1)本发明首次实现了将外源VvASMT1基因在酿酒酵母中的异源过表达，属于VvASMT1基因在葡萄酿酒酵母褪黑素合成应用中的首例，本发明可以有效提高葡萄酒中褪黑素的含量，省时省力、效率高、成本低易操作。

(2)利用本发明选育的高产褪黑素葡萄酿酒酵母菌种生产葡萄酒，可以使葡萄酒中褪黑素的含量提高4倍以上。利用本发明选育的褪黑素高产菌株进行酒精发酵可有效增加葡萄酒中褪黑素的含量，提高葡萄酒的保健价值。

附图说明

图1：褪黑素含量测定的标准曲线。

图2：出发菌株(酿酒酵母CP1118)酿造的葡萄酒中褪黑素测定的液相色谱图。

图3：目的菌株(酿酒酵母TS001)酿造的葡萄酒中褪黑素测定的液相色谱图。

图4：不同继代次数的菌株发酵葡萄酒褪黑素含量比较分析；图中，TS表示目的菌株，CK表示出发菌株。

图5：目的菌株TS001的发酵试验结果；图中，TS表示目的菌株，CK表示出发菌株。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分介绍的，目前商业葡萄酒酵母褪黑素的生成量普遍偏低，选育高产褪黑素的葡萄酿酒酵母对于酿造富含褪黑素的保健葡萄酒具有十分重要的意义。

从褪黑素的合成路径上分析，褪黑素(N-乙酰基-5-甲氧基色胺)是以色氨酸为底物合成的一种激素物质。为提高酿酒酵母的褪黑素生成量，专利CN111394269A以酿酒酵母为出发菌株，通过基因工程的手段过表达了色氨酸合成酶基因TRP5，以及敲除了吲哚胺2，3-双加氧酶基因BNA2，使构建的基因工程菌的褪黑素合成产量明显提高。

但是，该专利中此两项步骤的直接结果应该是使色氨酸的含量提升，减缓褪黑素的分解，进而间接使得褪黑素的含量提升，而不是对褪黑素合成途径的直接调控，而色氨酸转化成褪黑素的效率却不能直接保证有提高；另外，目前色氨酸的工业合成已经很成熟，商品色氨酸的价格也不高，如果是利用发酵培养基进行大规模生产，人为添加色氨酸完全可以替代该专利中所构建的基因工程菌的作用。

本发明解决这个问题的途径是对葡萄酿酒酵母进行基因改造。其原理是：在酿酒酵母中过表达目的基因VvASMT1(Gene ID:100255808)，调控编码N-乙酰基-5-羟色胺-甲基转移酶，该酶为褪黑素合成路径上的关键酶，进而直接调控增加酵母发酵过程中褪黑素的生成。利用本发明可以准确、方便、快速的选育出高产褪黑素的酵母菌种。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或者按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。

其中：酿酒酵母CP1118的保藏号为CGMCC NO.7828，记载在中国专利CN103627646A中。

实施例1：高产褪黑素葡萄酿酒酵母的选育

1.用接种环挑取一环葡萄酵酒母菌体CP1118作为出发菌株，接种到20mL YPD液体培养基中，30℃振荡培养16～18h；

2.测定培养的菌液至OD

3.将菌液置于50ml离心管中，12000r/min离心5min。用10ml YPD液体培养基重悬沉淀，然后转移到1L锥形摇瓶中。再用40ml YPD液体培养基冲洗离心管；

4. 30℃，220rpm培养至OD

5.准备single-strand carrier DNA，99℃变性5min，冰上2min，重复一次；

6.准备LiOAc/TE和PEG/LiOAc master mix：

LiOAc/TE master mix(1M LiOAc，1.1ml；10X TE pH7.5，1.1ml；Water，7.8ml)；

PEG/LiOAc master mix(50％PEG，12ml；1M LiOAc，1.5ml；10X TE pH7.5，1.5ml)；

7.将二次活化的菌液置于离心管中，12000r/min离心5min；

8.倒去上清，用30ml无菌水重悬，12000r/min离心5min；

9.倒去上清，用1ml LiOAc/TE master mix重悬，并转到1.5ml离心管中，12000r/min离心5min。加入600μl LiOAc/TE master mix溶液吹打均匀，得到感受态细胞备用液；

10.准备15ml离心管，向其中加入100μl single-strand carrier DNA，7μg携带有目的基因VvASMT1的重组质粒pYES2，600μl感受态细胞备用液，2.5ml PEG/LiOAc mastermix。斡旋1min，至所有组分充分混匀；

11. 30℃水浴，45min，每15min摇菌一次。

12.加入160μl DMSO，轻轻摇匀。

13. 42℃水浴热激20min，每10min上下颠倒混匀一次。

14. 12000r/min，离心5min；加入3ml YPD，30℃，150rpm复苏培养90min。

15. 12000r/min，离心5min，收集菌体，每管加入NaCl(0.9％)悬浮菌体，取100μl涂布100mm SD/-Ura平板；

16. 30℃培养3天后挑选平板单菌落，将单菌落接种至葡萄汁中进行发酵，筛选发酵液中褪黑素含量最高的菌株即为目的菌株。

将目的菌株命名为TS001(Saccharomyces cerevisiae)。该菌株的主要生物学特征为：呈卵圆形或圆形。菌落呈乳白色，表面湿润、粘稠，不透明，边缘整齐，易被挑起。该菌株最适宜的生长条件为pH值7.0，温度30℃。

对目的菌株进行生物保藏，保藏信息如下：

菌株名称：TS001

分类命名：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2021.01.07.

保藏中心登记入册编号：CGMCC NO.21601。

实施例2：目的菌株TS001的遗传稳定性试验

a.将目的菌TS001用接种针接种到YPD固体培养基中，持续培养2天，得到一代菌株；再用接种环接种一环一代菌株到新的YPD固体培养基中，持续培养2天，得到二代菌株；以此类推，连续传代培养10次。

b.用接种针接种适量目的菌于YPD液体培养基中，28℃摇床培养2天后镜检计算菌液浓度。

c.用无菌水将菌液浓度稀释，然后按照10

褪黑素的测定：取出发菌株(CK)与目的菌株(TS)酒样各200μl，经0.22μm滤膜过滤到进样瓶中，经三重四极高效液相色谱-质谱联用仪检测。MT检测参数：激发波长λex＝288nm，发射波长λem＝333nm；流动相：甲醇∶乙酸＝25∶75(V/V)；流速：0.5mL·min

褪黑素的定性与定量分析：酒样经液相色谱质谱，形成色谱峰图，用液相色谱-质谱-计算机联用仪进行分析鉴定。定性分析：运用Xcalibur对峰图进行分析，对比褪黑素标准品峰图对样品峰图进行定性分析。定量分析：采用高效液相色谱外标法进行定量分析。

对第1代、第5代和第10代的目的菌株进行了发酵测试，测定了发酵液中的褪黑素含量，结果见图4。

由图4可以看出，本发明选育的酿酒酵母菌株的遗传稳定性良好，经连续传代10代，仍能保持优异的褪黑素发酵性能。与出发菌株相比，采用本发明选育的酿酒酵母菌株发酵生产的葡萄酒中，褪黑素含量可提高4倍以上。

实施例3：目的菌株TS001的发酵试验

将目的菌株TS001的种子液接种至发酵培养基中，28℃摇床培养，12小时后进行取样，采用高效液相色谱法检测褪黑素的浓度；以出发菌株作为对照。

所述发酵培养基的配方：0.67g无氨基酸的酵母氮源基础(yeast nitrogen base，YNB)，10g葡萄糖，0.2g省却尿嘧啶氨基酸混合物，溶于100ml去离子水中，115℃高压蒸汽灭菌15min。上述发酵培养基参考专利CN111394269A。

发酵液中褪黑素的浓度测定结果如图5所示。由图5可以看出，本发明的目标菌株TS001具有优异的发酵性能，能够在发酵培养基中快速发酵合成褪黑素，发酵液中褪黑素的浓度达35mg/L；与出发菌株相比，发酵生产褪黑素的能力有了显著提高。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。