一种肝细胞三维培养方法

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其是一种肝细胞三维培养方法。

背景技术

肝脏是人体重要的生命器官，体外构建人源肝细胞三维组织和器官芯片，不仅可以用于治疗肝坏死等肝脏疾病，也可以用于肝脏发育研究以及肝脏疾病治疗药物筛选的模型，还可以用于药物、重金属和有机污染物等毒物的肝脏代谢和肿瘤发生的毒性通路研究，有利于提出重要污染物的健康指导值，为食品相关政策提供技术支持。

三维细胞培养(three-dimensional cell culture，TDCC)是指将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养,细胞与周围微环境中的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)、各种细胞因子、化学因子、物理机械力以及其它细胞发生交流与相互作用，并能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长,构成三维的细胞-载体复合物。三维细胞培养技术是介于单层细胞培养与动物实验之间的一种技术，既能最大程度的模拟体内细胞的生长、增殖、迁移、分化和凋亡的微环境，又易于形成具有合理形态和生理功能的组织器官，还能展现细胞培养的直观性及条件可控性的优势，所以三维细胞培养技术常被应用于药物载体、药物毒理、药物筛选、肿瘤治疗等方面的研究，但是，现有的培养方式针对不同应用需求通常需要进行针对的实验，这样会造成大量重复性劳动，降低研发效率。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明公布了一种肝细胞三维培养方法，它包括如下步骤：

步骤一，细胞培养：将肝细胞放入含培养液的培养皿中，将培养皿放入37℃含体积含量为5％CO

步骤二，三维细胞培养准备：将步骤一中得到的细胞悬浮液和稀释水凝胶添加至孔板培养皿中进行混合，并调节细胞终浓度为1×10

步骤三，三维细胞培养，向步骤二中的孔板培养皿添加细胞培养液后，放置的培养箱中培养，每天半量更换细胞培养液，培养一段时间后得到三维细胞培养产物。

进一步的，所述步骤一中培养液为体积百分含量10％胎牛血清的1640培养液。

进一步的，所述步骤二中最优细胞浓度为1.1×10

进一步的，所述步骤二中最优水凝胶与水凝胶稀释液体积比为1：3.7。

进一步的，所述步骤三中最优培养时间为9.5天。

进一步的，还包括步骤二(1)预测步骤，所述步骤二(1)设置在步骤二与步骤三之间，其包括：根据如下预测模型以需要的细胞活性OD值确定细胞浓度、培养时间和水凝胶与水凝胶稀释液体积比：

Y＝2.11-3.625×

10

A为细胞浓度，B为培养时间，C为水凝胶与水凝胶稀释液体积比，Y为细胞活性OD值。

优点效果

本发明公开了肝细胞三维培养方法，采用本申请中的培养方法得到的培养物活度高，提供了一种用于药物筛选和毒物通路研究的模型，通过本发明中的模型，可以提高工作效率，减少培养时摸索最优条件的时间。

附图说明

图1本发明的实施例1中不同细胞浓度、相同水凝胶稀释度(1：2)，肝细胞三维培养物450nm的吸光度值随时间变化曲线；

图2本发明的实施例2中相同细胞浓度(1×10

图3本发明的实施例3中相同细胞浓度(1×10

具体实施方式

下面结合实施例对发明做进一步说明，但不局限于说明书上的内容。

一种肝细胞三维培养方法，它包括如下步骤：

细胞培养：将肝细胞放入含培养液的培养皿中，将培养皿放入37℃含体积含量为5％CO

步骤二，三维细胞培养准备：将步骤一中得到的细胞悬浮液和稀释水凝胶添加至孔板培养皿中进行混合，并调节细胞终浓度为1×10

步骤三，三维细胞培养，向步骤二中的孔板培养皿添加细胞培养液后，放置的培养箱中培养，每天半量更换细胞培养液，培养一段时间后得到三维细胞培养产物，具体的当为96孔板时，孔板培养皿添加75μl细胞培养液，放置37℃含5％CO

步骤二中最优细胞浓度为1.1×10

实施例1

本实施例细胞培养方法采用具体实施方式中的方法，区别在于采用水凝胶稀释度1：2，细胞终浓度分别为1×10

具体的数据结果见下表1，对应的曲线图参见图1。

表1

实施例2

本实施例细胞培养方法采用具体实施方式中的方法，区别在于采用细胞终浓度1×10

具体数据结果见下表2，对应的曲线图参见图2。

表2

实施例3

本实施例细胞培养方法采用具体实施方式中的方法，区别在于采用细胞终浓度1×10

具体的数据结果见下表3，对应的曲线图参见图3。

表3

改变细胞接种浓度、培养时间和水凝胶稀释度对肝细胞三维培养的影响如图1-3所示。从图2中可以看出，随着培养时间的增加，细胞活性检测OD值先增加后减少，在培养时间为9天时达到最大；从图1和3中可以看出，水凝胶稀释度和细胞接种浓度不同，细胞活性检测OD值变化比较规则，均为先增加后减少，在培养时间为9天时达到最大，在细胞接种浓度1×10

更优选的，还包括步骤二(1)预测步骤，步骤二(1)设置在步骤二与步骤三之间，其包括：根据如下预测模型以需要的细胞活性OD值确定细胞浓度、培养时间和水凝胶与水凝胶稀释液体积比：

Y＝2.11-3.625×

10

A为细胞浓度，B为培养时间，C为水凝胶与水凝胶稀释液体积比，Y为细胞活性OD值。通过本发明的预测模型可以根据需要的活性得到初步的操作参数，仅仅需要在靠近预测参数时进行连续观察检测即可。

表4

表5

由上表可以看出，采用本发明中的预测模型预测结果与实测值相差不大，能够很好的预测活度值，采用该预测模型能够减少同样实验中参数的确定实验，减少重复性劳动，提高培养效率。通过最大化响应R1来确定最佳工艺参数。预计培养过程的细胞接种浓度、培养时间和水凝胶稀释度最佳条件分别为1.1×10

显然，本发明的上述实施方式仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。