一株鼠李糖乳杆菌菌株LRa05及其用途与产品

技术领域

本发明涉及微生物应用技术领域，特别涉及一株鼠李糖乳杆菌菌株LRa05及其用途与产品。

背景技术

腹泻是一种常见的消化道症状，是指排便次数明显超过平日习惯的频率(大于3次/天)，粪质稀薄，水分增加，每日排便量超过200g，或含未消化食物或脓血、黏液的一种临床状态。腹泻常伴有排便急迫感、肛门不适、失禁等症状。根据发病原因，腹泻可分为感染性腹泻和非感染性腹泻。感染性腹泻由病原体引起，常见的病原体包括细菌、病毒以及寄生虫等，其中EPEC腹泻就是感染性腹泻的一种。EPEC腹泻指肠致病性大肠杆菌(Enteropathogenic E.coli,EPEC)引起的腹泻。目前根据流行病学调查，EPEC是引起全球婴幼儿急、慢性腹泻和成年人散发腹泻的一类重要病原菌，并且该类细菌还可导致幼儿营养不良。20世纪中后期的EPEC暴发流行统计中，死亡率达到25％-50％。可见EPEC具有较大的危害性。。

目前对于腹泻，一般选择对症治疗如纠正水、电解质、酸碱平衡紊乱和营养失衡，酌情补充液体、补充维生素、氨基酸、脂肪乳等营养物质。必要时选择黏膜保护剂，如蒙脱石散、硫糖铝等。对于细菌感染引起的腹泻，一般还需要选择抗生素治疗，但不同的细菌选用相应的抗生素。虽然抗生素被用来对抗病原体，但也针对宿主肠道内共生细菌，有研究指出抗生素会扰乱肠道微生物群的组成，导致菌群失调和疾病。此外服用抗生素还存在副作用大、成本高、病原性易出现耐药性等问题。上述缺陷均使得这些抗生素的使用受到限制，因而需寻求更为安全有效的方法治疗腹泻。益生菌是通过定殖在人体内，改变宿主肠道菌群组成，进而代谢产生如短链脂肪酸等有益代谢物，以对宿主产生有益影响的一类菌。与普通的药物相比，益生菌具有安全性高、无副作用、不会出现耐药性和成本低等优势。

鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)作为益生菌的一种，虽然已被报道其对腹泻有缓解作用，但鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)对于死亡率较高的EPEC腹泻的作用，本领域尚未见报道。

发明内容

基于此，为有效缓解EPEC致腹泻症状，避免使用药物导致的耐药性和不良反应，本发明提供一种对EPEC致腹泻有缓解效果的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)菌株LRa05及其应用。本发明在于克服背景技术中存在的问题，提供一种能可缓解EPEC腹泻的鼠李糖乳杆菌LRa05。该鼠李糖乳杆菌LRa05能够缓解EPEC导致的腹泻。本发明还提供了一种能够缓解EPEC致腹泻的鼠李糖乳杆菌LRa05的制备方法。

本发明的技术方案如下：

一株鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)菌株LRa05，其特征在于，其保藏号为CGMCC No.24377。

鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)菌株LRa05在制备缓解EPEC腹泻制品方面的用途，其特征在于，所述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)菌株LRa05的保藏号为CGMCC No.24377。

所述缓解EPEC腹泻包括：抑制EPEC生长、和/或，降低EPEC对细胞的粘附、和/或，降低EPEC感染导致的死亡率、和/或，降低EPEC感染导致的腹泻评分、和/或，改善EPEC感染导致的体重降低。

所述细胞指结肠上皮细胞。

所述制品选自药物或食品；优选地，所述食品为保健食品。

一种缓解EPEC腹泻制品，包括：活性成分；其特征在于，所述活性成分包括：保藏号为CGMCC No.24377的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)菌株LRa05。

所述缓解EPEC腹泻包括：抑制EPEC生长、和/或，降低EPEC对细胞的粘附、和/或，降低EPEC感染导致的死亡率、和/或，降低EPEC感染导致的腹泻评分、和/或，改善EPEC感染导致的体重降低。

所述制品选自药物或食品；所述食品优选保健食品。

所述的一种缓解EPEC腹泻制品还包括辅料。

所述辅料选自药用辅料或制品添加剂。

在一些国家或地区专利法允许的情况下，本发明还请求保护保藏号为CGMCCNo.24377的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)菌株LRa05在缓解或改善EPEC腹泻方面的用途。

另一方面，本发明还请求保护保藏号为CGMCC No.24377的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)菌株LRa05在抑制EPEC生长、和/或，降低EPEC对细胞的粘附、和/或，降低EPEC感染导致的死亡率、和/或，降低EPEC感染导致的腹泻评分、和/或，改善EPEC感染导致的体重降低方面的用途。

本发明提供一株鼠李糖乳杆菌LRa05及其应用。所述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)LRa05菌株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2022年1月24日，保藏编号为CGMCC No.24377，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

所述的鼠李糖乳杆菌LRa05在制备缓解或治疗EPEC致腹泻的产品中的应用。

所述产品包括鼠李糖乳杆菌菌粉及其制剂，所述菌粉按照如下制备方法制得：将鼠李糖乳杆菌LRa05按照10％(V/V)的接种量接种到种子培养基中，于37℃下培养6-8h，得到一级种子；将一级种子以5％接种量接种于种子培养基中，37℃静置培养5-6h即为二级种子；然后以2％(v/v)的接种量将培养获得的二级种子接种到发酵罐，进行发酵罐培养，将发酵液离心，得到菌泥；将菌体用冻干保护剂重悬(冻干保护剂和菌体的质量比为1:1)，得到重悬液；将重悬液采用真空冷冻法进行冻干，得到冻干粉。

所述的种子培养基的配方为：20g/L葡萄糖，10g/L牛肉浸粉，5g/L酵母粉，10g/L蛋白胨，5g/L乙酸钠，2g/L柠檬酸钠，3g/L磷酸氢二钾，0.5g/L酸镁，0.1g/L硫酸锰，1g/L吐温80，1g/L L-半光氨酸盐酸盐，115℃灭菌20min。

所述发酵培养基配方为：50g/L葡萄糖，15g/L酵母粉，20g/L蛋白胨，5g/L牛肝浸粉，5g/L乙酸钠，3g/L柠檬酸钠，3g/L磷酸氢二钾，0.5g/L硫酸镁，0.1g/L硫酸锰，1g/L吐温80，1g/L L-半光氨酸盐酸盐，115℃灭菌20min。

所述的冻干保护剂包含如下按质量百分比计的组分：15％海藻糖，5％脱脂奶粉，2％蔗糖，2％甘油，0.5％山梨醇。

(1)本发明所述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)LRa05菌株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2022年1月24日，保藏编号为CGMCC No.24377，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

(2)本发明还提供一种能够缓解EPEC致腹泻的鼠李糖乳杆菌LRa05的菌粉制备方法

(3)权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌LRa05冻干粉制备方法为：将鼠李糖乳杆菌LRa05按照10％(V/V)的接种量接种到种子培养基中，于37℃下培养6-8h，得到一级种子；将一级种子以5％接种量接种于种子培养基中，37℃静置培养5-6h即为二级种子；然后以2％(v/v)的接种量将培养获得的二级种子接种到发酵罐，进行发酵罐培养，将发酵液离心，得到菌泥；将菌体用冻干保护剂重悬(冻干保护剂和菌体的质量比为1:1)，得到重悬液；将重悬液采用真空冷冻法进行冻干，得到冻干粉。

本发明提供的一种能够缓解EPEC致腹泻的鼠李糖乳杆菌LRa05。具体体现在：

(1)该鼠李糖乳杆菌LRa05菌悬液及代谢产物在体外对EPEC具有良好的抑制能力。

(2)该鼠李糖乳杆菌能够大幅降低EPEC对肠上皮细胞的黏附效果。

(3)该鼠李糖乳杆菌能显著降低EPEC攻毒小鼠的死亡率。

(4)该鼠李糖乳杆菌能显著降低EPEC攻毒小鼠的腹泻评分。

(5)该鼠李糖乳杆菌能显著降低EPEC攻毒小鼠的体重损失。

因此，本发明提供的能够缓解腹泻的鼠李糖乳杆菌LRa05在制备缓解腹泻的产品(如固体饮料)中，具有很大的应用前景。

本发明提供的鼠李糖乳杆菌LRa05能够有效缓解EPEC引起的小鼠腹泻，具体体现在：(1)该鼠李糖乳杆菌LRa05在体外对EPEC具有良好的抑制能力；(2)该鼠李糖乳杆菌能够大幅降低EPEC对肠上皮细胞的黏附效果；(3)该鼠李糖乳杆菌能显著降低EPEC攻毒小鼠的死亡率；(4)该鼠李糖乳杆菌能显著降低EPEC攻毒小鼠的腹泻评分；(5)该鼠李糖乳杆菌能显著降低EPEC攻毒小鼠的体重损失。可见鼠李糖乳杆菌LRa05在缓解EPEC引起的腹泻方面具有巨大的应用前景。

本发明的鼠李糖乳杆菌菌株LRa05的保藏信息如下：

菌株名称：LRa05；

保藏号：CGMCC No.24377；

分类命名：鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus；

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

保藏日期：2022年1月24日。

附图说明

图1为本发明实验例4的鼠李糖乳杆菌LRa05降低EPEC对HT-29细胞的黏附率结果图；图中，对照组指实验例3的阳性对照组。

图2为本发明实验例5的鼠李糖乳杆菌LRa05干预对EPEC攻毒小鼠腹死亡率的影响。

图3为本发明实验例6的鼠李糖乳杆菌LRa05干预对EPEC攻毒小鼠腹泻评分的影响。

图4为本发明实验例7的鼠李糖乳杆菌LRa05干预对EPEC攻毒小鼠体重的影响。

图2-图4的横坐标均为时间：天数。

具体实施方式

下面将结合本发明附图及实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实验例使用的菌株EPEC来自中国工业微生物菌种保藏中心。

本发明实验例使用的小鼠购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。

本发明实验例3使用的HT-29细胞购自中国典型微生物菌种保藏中心。

本发明实验例使用MRS培养基、TSA培养基购自青岛海博生物技术有限公司第1组实施例、菌株LRa05的新用途

本组实施例提供鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)菌株LRa05在制备缓解EPEC腹泻制品方面的用途。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)菌株LRa05的保藏号为CGMCC No.24377。

本领域技术人员根据本发明的教导和启发，可将保藏号为CGMCC No.24377的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)菌株LRa05用于制备缓解EPEC腹泻功效的任何制品。任何使用、培养、扩繁、接种、制备、生产、发酵保藏号为CGMCC No.24377的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)菌株LRa05并将其用于制备缓解EPEC腹泻的任何形式的产品的行为，均落入本发明的保护范围。

在具体的实施例中，所述缓解EPEC腹泻包括：抑制EPEC生长、和/或，降低EPEC对细胞的粘附、和/或，降低EPEC感染导致的死亡率、和/或，降低EPEC感染导致的腹泻评分、和/或，改善EPEC感染导致的体重降低。

在更具体的实施例中，所述细胞指结肠上皮细胞。

在一些实施例中，所述制品选自药物或食品。

在优选的实施例中，所述食品为保健食品。

本领域技术人员可根据本发明的教导，参考本领域常用的工具书(如：《生物药物制剂技术》、《食品微生物》等)结合微生物领域常规的生产工艺，并通过培养、扩繁、接种、制备、生产、发酵等本领域常规技术手段，将本发明保藏号为CGMCC No.24377的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)菌株LRa05制成药物或食品。

第2组实施例、本发明的缓解EPEC腹泻制品

本组实施例提供一种缓解EPEC腹泻制品。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述缓解EPEC腹泻制品包括：活性成分；其特征在于，所述活性成分包括：保藏号为CGMCC No.24377的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)菌株LRa05。

在一些实施例中，所述缓解EPEC腹泻包括但不限于：抑制EPEC生长、和/或，降低EPEC对细胞的粘附、和/或，降低EPEC感染导致的死亡率、和/或，降低EPEC感染导致的腹泻评分、和/或，改善EPEC感染导致的体重降低。

在另一些实施例中，所述制品选自药物或食品；所述食品优选保健食品。

在进一步的实施例中，所述的一种缓解EPEC腹泻制品还包括辅料。

在具体的实施例中，所述辅料选自药用辅料或食品添加剂。

在更具体的实施例中，所述药用辅料包括但不限于：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂等。

本领域技术人员根据实际生产中药物的剂型与规格，可对上述药用辅料进行选择和调整，以获得合适的适于本发明的以鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)菌株LRa05为活性成分的缓解EPEC腹泻药物制备、生产、存放、运输、服用、使用、崩解、吸收的药物产品。

在另一些更具体的实施例中，所述食品添加剂包括但不限于：抗氧化剂、酶制剂、增味剂、甜味剂、防腐剂、膨松剂、酸味剂、香料等。

本领域技术人员可根据食品领域的生产需求，在不影响鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)菌株LRa05活性的前提下，根据食品的形式、包装、保质期、口感、味道等因素，对上述食品添加剂进行合理的选择和调整，并制备出符合食品安全标准的食品。

通过下面的实验例证明本发明上述实施例所能达到的技术效果。

实验例1、鼠李糖乳杆菌的分离筛选与鉴定

(1)菌株的分离筛选

采集健康人体粪便样品，取1g至9mL无菌生理盐水中，充分振荡分散样品，取100μL样品梯度稀释，选取合适梯度均匀涂布于MRS琼脂平板上，置于厌氧条件下，37℃培养36～48h后，挑选疑似单菌落，进行革兰氏染色，镜检观察菌落形态特征，初步筛选疑似乳杆菌的菌株。菌株在MRS固体培养基上进行反复划线纯化培养，获得乳杆菌纯化菌株。

MRS培养基配方(g/L)：蛋白胨10、牛肉浸粉5、酵母粉5、葡萄糖20、无水乙酸钠5、柠檬酸氢二铵2、吐温80 1、K

(2)分子生物学鉴定

对筛选的目的菌株液体扩培，收集菌体，提取基因组DNA，采用通用引物27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT扩增其16S rDNA片段，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，并对PCR产物进行测序。其中PCR反应体系：10×buffer 10ul，10mM dNTP 2ul，上下引物各1ul，DNA模板2ul，Taq酶0.5ul，ddH

菌株名称：LRa05；

保藏号：CGMCC No.24377；

分类命名：鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus；

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

保藏日期：2022年1月24日。

实验例2、鼠李糖乳杆菌LRa05对EPEC的抑制作用

将甘油管中保存的鼠李糖乳杆菌LRa05先在MRS平板上活化2-3次，随后挑取单菌落接种到MRS液体培养基中，于37℃下厌氧培养，得到种子液；将种子液以2％的比例接种至MRS液体培养基中，于37℃下培养17-24h得到培养液。收集离心后的菌体，采用无菌生理盐水重悬，调整浓度至10

将指示菌株EPEC在TSA固体平板培养基上活化后，挑取单菌落接种到TSA液体培养基，连续转接二代后，离心，收集菌体。菌体用无菌PBS重悬洗涤后，再离心收集菌体，并用无菌PBS重悬调整菌悬液浓度至10

将含有1.5％琼脂的MRS琼脂培养基冷却至55℃左右，与指示菌株菌悬液按一定比例混匀，调节指示菌浓度(10

表1.鼠李糖乳杆菌LRa05对EPEC的抑制作用

实验例3、鼠李糖乳杆菌LRa05降低EPEC对结肠上皮细胞的黏附率

用DMEM完全培养液(含10％胎牛血清，1％青霉素和链霉素溶液)将HT-29细胞培养于37℃含5％CO

采用三种实验研究鼠李糖乳杆菌LRa05对EPEC的黏附抑制作用，实验所用EPEC为10

实验结果如图1所示，图1显示了不同处理方式对EPEC黏附HT-29细胞的影响。其中以阳性对照的相对黏附率为100％，其中竞争、排斥和置换实验均降低了EPEC对HT-29细胞黏附率，竞争组相对率黏附为(61.2±5.66)％，排斥组为(38.4±4.82)％，置换组为(77.6±6.42)％，以排斥组抑制效果最好，可抑制约60％以上的EPEC黏附，表明鼠李糖乳杆菌可以通过占位效应有效抑制EPEC黏附于肠道长皮细胞。

实验例4、鼠李糖乳杆菌LRa05干预对EPEC攻毒小鼠死亡率的影响

鼠李糖乳杆菌LRa05菌悬液的制备：鼠李糖乳杆菌LRa05从甘油管出发按照1％(v/v)的接种量接入MRS液体培养基中，于37℃厌氧培养24h，得到一级种子液；将一级种子液按照2％(v/v)的接种量接入MRS液体培养基中，于37℃厌氧培养16h，得到二级种子液；将二级种子液按照2％(v/v)的接种量接入MRS液体培养基中，于37℃厌氧培养16h，得到菌液；将菌液8000g离心10min，收集菌体；将菌体用无菌生理盐水洗涤两次后，再将菌体重悬至细胞浓度为5×10

EPEC菌悬液的制备：EPEC在TSA固体平板培养基上活化后，挑取单菌落接种到TSA液体培养基，连续转接二代后，离心，收集菌体。菌体用无菌生理盐水制备菌悬液，调整菌悬液浓度至9×10

EPEC腹泻模型小鼠的建立：实验取SPF级(无特定病原体)C57BL/6雄性小鼠60只。动物饲养室温温度23±2℃，湿度50％±10％，12h/12h昼夜交替，自由进食及饮水的条件下适应饲养1周后随机分为正常对照组(NC组)、造模组(DC组)和感染后LRa05干预组(LRa05组)，每组20只。

试验周期为20天，从造模前10天开始，一直持续到实验结束，其中不包括抗生素处理的那3天，对照组和造模组小鼠每天灌胃200μL无菌生理盐水溶液，LRa05干预组每天灌胃200μL的鼠李糖乳杆菌LRa05菌悬液；适应后第11天开始为造模期，造模第1～3天，在小鼠饮用水中加入庆大霉素(35mg/L)、万古霉素(45mg/L)、甲硝唑(215mg/L)和粘菌素(850U/mL)的抗生素混合物，以消除C57BL/6小鼠正常肠道菌群，造模第4～10天，用不含抗生素的无菌水代替含有抗生素的水作为小鼠饮用水，并且，对小鼠禁食18h后，除对照组外，给每组小鼠灌胃200μL EPEC菌悬液，连续灌胃7天，1天灌胃2次，每次间隔2h。每天观察小鼠生长状态，记录小鼠死亡数量，计算死亡率。小鼠死亡率如图2所示。

在干预期内对照组小鼠生长良好，摄食正常，毛发平顺有光泽，体重呈增长趋势，至干预期结束无死亡出现。模型组小鼠部分出现精神萎靡和腹泻症状，并伴有死亡出现，后期有一定程度的改善，第7天后，死亡率达65％。LRa05干预组小鼠也有精神萎靡和腹泻症状但较模型组较轻，也伴有小鼠死亡，但干预结束后整体死亡率为40％。该结果表明LRa05干预可有效降低EPEC感染小鼠致死率。

实验例5、鼠李糖乳杆菌LRa05干预改善EPEC攻毒小鼠腹泻评分

小鼠建模同实验例3，在干预期分别在1、3、5、7天记录小鼠粪便状况并进行评分，计算各组小鼠腹泻评分平均值，如出现小鼠死亡则剔除后计算。腹泻评分标准(0-4)如下：0形成良好的颗粒；1－成形但较软，易粘在EP管壁上；2－稀软或糊状大便；3－腹泻，水样粪便；4－呈稀水样，且粘附于肛门。该腹泻评分标准是本领域常见的评分标准，在“Galacto-oligosaccharides protects against DSS-induced murine colitis throughregulating intestinal flora and inhibiting NF-κB pathway”一文中有记载。各组小鼠腹泻评分如图3所示，在干预的第3、5、7天，LRa05干预组小鼠腹泻评分均低于模型组小鼠，统计检验表明同一时间两组小鼠腹泻评分存在显著性差异(p<0.05)，表明益生菌干预可有效降低EPEC感染小鼠的腹泻评分。

实验例6、鼠李糖乳杆菌LRa05干预改善EPEC攻毒小鼠体重降低

小鼠建模同实验例3，在干预期分别在1、3、5、7天记录小鼠体重，以攻毒当天小鼠体重值为100％，计算各组小鼠相对体重。如出现小鼠死亡则剔除后计算。结果如图4所示，在干预期内，对照组小鼠体重稳步增长，结束时增长至初始体重110，模型组和LRa05干预组小鼠在第3天和第3天体重呈下降趋势且模型组下降幅度更大，在干预结束后，两组小鼠体重均有小幅增加，表明鼠李糖乳杆菌LRa05干预能一定程度减弱EPEC感染导致的体重下降，且有利于小鼠体重的回升。统计学检验表明两组小鼠体重存在显著性差异(p<0.05)。

尽管通过参考附图并结合优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求所述的保护范围为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 微康益生菌(苏州)股份有限公司

<120> 一株鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）菌株LRa05及其用途与产品

<130> P220226/WKY

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<170> PatentIn version 3.5

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<223> 通用引物1492R

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