一种重组长效人CXCR4amp;PD-1双靶点抗体融合蛋白及其制备方法

技术领域

本发明属于分子生物学、生物制药等技术领域，具体涉及一种重组长效人CXCR4&PD-1双靶点抗体融合蛋白及其制备方法。

背景技术

全球肿瘤新发患者持续增长，据统计，2030年全球肿瘤患者新发人数将高达2400万，中国则超580万，占比近1/4。众多的immune checkpoint中，PD-1/PD-L1是重要的靶点，阻断immune checkpoint可以重新激活T细胞，帮助免疫系统清除癌细胞。肿瘤内微环境介导程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)通路的诱导和调节性T(Treg)细胞的积累，被认为有助于抑制抗肿瘤免疫。PD-1是T细胞上表达的抑制性表面受体，可以结合肿瘤细胞上上调的免疫抑制程序性细胞死亡配体1(PD-L1)。受体-配体相互作用可以抑制抗肿瘤细胞因子的产生和PD-1高表达的肿瘤浸润T细胞的细胞溶解活性，从而使免疫系统沉默。阻断PD-1/PD-L1之间的结合可以增强T细胞的免疫反应，并介导抗肿瘤活性。PD-1/PD-L1抑制剂作为高效的广谱抗肿瘤药物，在抗肿瘤历史上具有划时代意义，自上市起在全球肿瘤药物市场上迅速渗透放量，销售额持续增长。

目前海外市场共获批6款PD-1/PD-L1产品，80多个肿瘤适应症。4款PD-1分别是默沙东(K药)、施贵宝(O药)、辉瑞/默克(B药)、赛诺菲/再生元(L药)和2款PD-L1分别是罗氏(T药)和阿斯利康(I药)。而NMPA共批准了12款PD-1/PD-L1产品，涉及11个癌种，44个适应症，其中国产8款，进口4款。已上市的PD-1/PD-L1药物的适应症中的45％是通过加速审批途径获批的，通常是只做了单臂试验，之后的验证性随机临床试验显示出不一致的结果。ClinicalTrials.gov官网显示目前有2909项PD-1和2318项PD-L1临床试验，该赛道拥挤、扎堆内卷现象严重。同时许多患者对检查点抑制剂单一疗法缺乏反应，有效性仅限于少数癌症患者。一般认为，联合免疫治疗可以达到最大的抗肿瘤疗效。

趋化因子受体(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)是一个具有7次跨膜结构的G蛋白耦联受体(G Protein-Coupled Receptor，GPCR)，介导对靶细胞的化学作用，具有趋化免疫细胞、维持免疫细胞的动态平衡等生物学作用。CXCR4由352个氨基酸组成，在体内大部分组织和器官上都有表达，包括骨髓、脐血和动员的外周血来源的细胞表面，以及多种非造血干细胞表面表达，同时在许多肿瘤中都存在异常高表达。目前的研究表明，与趋化因子受体CXCR4相关的癌症超过23种，它还能促进血管生成，细胞的转移、生长或生存。SDF-1属于CXC趋化因子家族，是CXCR4的配体。SDF-1/CXCR4受体配体系统的作用主要研究在免疫学领域，在介导肿瘤定向迁移、侵袭和转移中发挥着重要的作用，多项CXCR4开发药物在临床治疗中表现出巨大的潜力。研究表明CXCR4可以减少调节性T(Treg)细胞瘤内浸润，这些药物将为肿瘤免疫治疗开辟一条新的途径。目前，以CXCR4为靶向的研究已经相当成熟。除了FDA批准的CXCR4抑制剂普乐沙福(Plerixafor)，用于血液恶性肿瘤。近年来新的研究成果显示，已经探索出了多种CXCR4靶向抑制剂，例如，国内已获批临床的Motixafortide，目前处于临床III期，用于治疗局部晚期或转移性三阴性乳腺癌；同样处于临床III期阶段的Mavorixafor，作用造血干细胞动员用于多发性骨髓瘤患者自体骨髓移植，计划于今年上半年递交NDA，有望成为全球第二款CXCR4靶向药。在现有的技术中，单抗专利方面有PierreFabre Medicament于2008年申请专利US9388248B2，伊莱利利于2010年申请CXCR4单抗专利CN102027015A用来治疗癌症，Bristol-Myers Squibb Company于2006年申请CXCR4单抗专利US20200231683A1，The General Hospital Corporation于2010年申请专利US20160128974A1，及Pfizer Inc.于2013年申请专利US10927178B2。

研究发现组合封锁趋化因子受体CXCR4和免疫检查点PD-1大大减少免疫抑制肿瘤微环境中的特定细胞和功能元素，增强肿瘤特异性细胞介导免疫反应产生更强大的控制。因此PD-1/L1抑制剂与CXCR4抑制剂联合使用，会存在协作增效性。

发明内容

本发明提供了一种重组长效人CXCR4&PD-1双靶点抗体融合蛋白及其制备方法。

本发明的具体技术方案如下：

本发明提供的重组长效人CXCR4&PD-1双靶点抗体融合蛋白，其特征在于，

该重组长效人CXCR4&PD-1双靶点抗体融合蛋白的结构如下式M1、M2或M3所示：

该重组长效人CXCR4&PD-1双靶点抗体融合蛋白的氨基酸序列包括在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQID NO:14、SEQ ID NO:15中，基因序列包括在SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:32中；该重组长效人CXCR4&PD-1双靶点抗体融合蛋白的连接肽为(GGGGS)n(n＝0，1，2，3或4)，连接肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:16，基因序列包括SEQ ID NO:33；该重组长效人CXCR4&PD-1双靶点抗体融合蛋白的信号肽氨基酸序列包括SEQ ID NO:17，基因序列包括SEQ ID NO:34。

本发明还提供了一种表达载体，其特征在于，该表达载体可以高表达上述重组长效人CXCR4&PD-1双靶点抗体融合蛋白的氨基酸序列。

本发明还提供了一种宿主细胞，其特征在于，该宿主细胞可以高表达上述重组长效人CXCR4&PD-1双靶点抗体融合蛋白的氨基酸序列，该宿主细胞包括大肠杆菌、酵母、CHO细胞、HEK293或其中至少一种。

本发明还提供了一种上述重组长效人CXCR4&PD-1双靶点抗体融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤S1，培养上述宿主细胞，获得含重组长效人CXCR4&PD-1双靶点抗体融合蛋白的培养液；步骤S2，从培养液中分离得到重组长效人CXCR4&PD-1双靶点抗体融合蛋白。

发明的作用与效果

与现有技术相比，本发明提供的重组长效人CXCR4&PD-1双靶点抗体融合蛋白(双抗)，活性普遍要比对应单抗高，其在抗肿瘤领域有很好的开发和应用前景。

附图说明

图1是本发明实施例的重组长效人CXCR4&PD-1双靶点抗体融合蛋白(双抗)的结构示意图。

图2是本发明实施例的重组长效人CXCR4&PD-1双靶点抗体融合蛋白(双抗)及其对比物PD-1Mab与人PD-1受体结合图(ELISA)。

图3是本发明实施例的重组长效人CXCR4&PD-1双靶点抗体融合蛋白(双抗)及其对比物CXCR4单抗与HEK293-CXCR4-luc细胞流式结合数据图(Facs)。图4是报告基因法检测本发明实施例的重组长效人CXCR4&PD-1双靶点抗体融合蛋白(双抗)及其对比物221-PD-1单抗阻断PD-1/PD-L1结合而引起的CD3信号通路的激活图。

具体实施方式

在本发明中使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

下述实施例中所采用的试剂为普通商业途径购得，未注明的实验操作及实验条件参考本领域的常规操作及常规条件。

以下结合实施例和附图来说明本发明的具体实施方式。

<实施例>

本实施例提供了一种重组长效人CXCR4&PD-1双靶点抗体融合蛋白(双抗)及其制备方法。

图1是本发明实施例的重组长效人CXCR4&PD-1双靶点抗体融合蛋白(双抗)的结构示意图。

如图1所示，本实施例的重组长效人CXCR4&PD-1双靶点抗体融合蛋白(双抗)的结构如图1中式M1、M2或M3所示。

该重组长效人CXCR4&PD-1双靶点抗体融合蛋白的氨基酸序列包括在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQID NO:14、SEQ ID NO:15中，基因序列包括在SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:32中。

该重组长效人CXCR4&PD-1双靶点抗体融合蛋白的连接肽为(GGGGS)n(n＝0，1，2，3或4)，连接肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:16，基因序列包括SEQ ID NO:33。

该重组长效人CXCR4&PD-1双靶点抗体融合蛋白的信号肽氨基酸序列包括SEQ IDNO:17，基因序列包括SEQ ID NO:34。

本实施例提供的重组长效人CXCR4&PD-1双靶点抗体融合蛋白(双抗)的制备方法，包括如下步骤：

步骤S1，培养上述宿主细胞，获得含重组长效人CXCR4&PD-1双靶点抗体融合蛋白的培养液，具体过程为：

步骤S1-1，制备重组长效人CXCR4&PD-1双靶点抗体融合蛋白(双抗)表达载体，具体过程为：

本实施例所用连接肽为(GGGGS)n(其中n＝0、1、2、3或4)，连接肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:16，基因序列为SEQ ID NO:33；对目的分子的密码子进行优化，在人种属和宿主细胞易于表达方面进行优化，最终合成基因质粒，得到重组长效人CXCR4&PD-1双靶点抗体融合蛋白(双抗)表达载体，该表达载体可以高表达上述重组长效人CXCR4&PD-1双靶点抗体融合蛋白的氨基酸序列。

步骤S1-2，重组长效人CXCR4&PD-1双靶点抗体融合蛋白(双抗)表达，具体过程为：

利用Expi CHO-S(Gibco，A29133)作为宿主细胞(该宿主细胞可以高表达上述重组长效人CXCR4&PD-1双靶点抗体融合蛋白的氨基酸序列)，采用化学转染试剂Polyplus-FectoPRO(polyplus，116-010)，瞬时表达重组长效人CXCR4&PD-1双靶点抗体融合蛋白(双抗)，获得含重组长效人CXCR4&PD-1双靶点抗体融合蛋白(双抗)的培养液。

步骤S2，从培养液中分离得到重组长效人CXCR4&PD-1双靶点抗体融合蛋白(双抗)，具体过程为：

将步骤S1得到的培养液进行二级离心(一级：3000g，30min；二级：12000g，20min)，收集上清液经0.2μm滤器过滤，待用；Protein A亲和层析：将滤液上样到经20mM PB(pH7.2)、150mM NaCl(pH 7.2)预平衡的Protein A柱上，保留时间为5min；再平衡：分别利用50mM NaAc-HAc(pH 4.5)、50mM NaAc-HAc(pH 4.0)、50mM NaAc-HAc(pH 3.5)进行洗脱，收峰范围为50mAU-peak-50mAU，得到SEC纯度符合要求(＞98.0)的重组长效人CXCR4&PD-1双靶点抗体融合蛋白(双抗)。

本实施例获得了9种重组长效人CXCR4&PD-1双靶点抗体融合蛋白(双抗)，其分子序列见表1。

表1

<测试例1>

本测试例通过ELISA试验，测试上述实施例获得的重组长效人CXCR4&PD-1双靶点抗体融合蛋白(双抗)与人PD-1受体的结合活性。

检测方法：在96孔细胞板内分别包被100ng/孔人PD-1受体，4℃过夜，分别加入系列稀释后浓度(10000-0.009537ng/mL)的PD-1Mab、221-S1、221-S2、221-S3、221-S4、221-S5、221-S6、221-S7、221-S8、221-S9，于37℃孵育1小时，加入HRP-anti-human IgG-Fc 37℃孵育1小时，最后加入TMB显色10min，在酶标仪读取450nm吸光度值，利用四参数法进行曲线拟合，计算EC

图2是本发明实施例的重组长效人CXCR4&PD-1双靶点抗体融合蛋白(双抗)及其对比物PD-1Mab与人PD-1受体结合图(ELISA)。

重组长效人CXCR4&PD-1双靶点抗体融合蛋白(双抗)及其对比物PD-1Mab(对应单抗)与人PD-1受体结合活性测试结果列于表2。

表2

由图2和表2可知，重组长效人CXCR4&PD-1双靶点抗体融合蛋白(双抗)结合活性EC

<测试例2>

本测试例通过Facs技术，测试上述实施例获得的重组长效人CXCR4&PD-1双靶点抗体融合蛋白(双抗)及其对比物CXCR4单抗与人CXCR4受体流式结合活性。

检测方法：在96孔细胞板内分别加入50μL 2×10

图3是本发明实施例的重组长效人CXCR4&PD-1双靶点抗体融合蛋白(双抗)及其对比物CXCR4单抗与HEK293-CXCR4-luc细胞流式结合数据图(Facs)。

重组长效人CXCR4&PD-1双靶点抗体融合蛋白(双抗)及其对比物CXCR4单抗与人CXCR4受体流式结合活性测试结果列于表3。

表3

由图3和表3可知，重组长效人CXCR4&PD-1双靶点抗体融合蛋白(双抗)结合活性EC

<测试例3>

本测试例通过报告基因法，检测上述实施例获得的重组长效人CXCR4&PD-1双靶点抗体融合蛋白(双抗)及其对比物221-PD-1单抗阻断PD-1/PD-L1活性。

检测方法：制备2×10

图4是报告基因法检测本发明实施例的重组长效人CXCR4&PD-1双靶点抗体融合蛋白(双抗))及其对比物221-PD-1单抗阻断PD-1/PD-L1结合而引起的CD3信号通路的激活图。

重组长效人CXCR4&PD-1双靶点抗体融合蛋白(双抗)及其对比物221-PD-1单抗阻断PD-1/PD-L1活性列于表4。

表4

由图4和表4可知，重组长效人CXCR4&PD-1双靶点抗体融合蛋白(双抗)可以阻断PD-1/PD-L1之间的结合，恢复CD3激活性信号通路，从而激活T细胞。因此，重组长效人CXCR4&PD-1双靶点抗体融合蛋白(双抗)有较强的阻断PD-1/PD-L1活性、激活T细胞活性的功能。

以上是对实施例的详细描述，方便本领域的技术人员能正确理解和使用本发明。凡本领域的技术人员依据本发明在现有技术基础上，不经过创新性的劳动，仅通过分析、类推或有限列举等方法得到的改进或修改技术方案，都应该在由权利要求书所确定的保护范围内。