一种阳离子型羧甲基壳聚糖

技术领域

本发明涉及壳质多糖技术领域，具体涉及一种阳离子型羧甲基壳聚糖。

背景技术

随着伤口修复阶段的护理成本越来越高，可促进伤口修复的医用材料和医疗技术引起了广泛的关注。其中以壳聚糖、纤维素为代表的天然高分子材料已经被开发应用于伤口促愈合敷料，多以高分子海绵、薄膜、纤维膜等形式，其促愈合作用机制基本依赖于敷料吸液、保水带来的伤口湿性促愈合环境，以及材料的抗菌性能对伤口感染的控制。但是，这些技术方案对机体自身修复过程的干预是非常粗略的，海绵、薄膜、纤维膜等敷料的设计过程中也缺少（或者说不需要）对天然高分子的结构进行优化。

因此，仍然有必要针对伤口修复过程中的机体自身修复过程，从分子结构上去设计天然高分子的改性产物，以优选出与自身修复过程协同、促伤口修复的新型医用材料。同时，目前也缺乏简单高效、作用机制明确的新型医用材料制备技术。

发明内容

针对现有壳聚糖材料对机体自身修复过程的干预非常粗略的技术问题，本发明提供一种阳离子型羧甲基壳聚糖，利用来源于海洋的天然碱性多糖甲壳素的衍生物羧甲基壳聚糖为原料，通过特定制备步骤及原料配比，实现了对羧甲基壳聚糖的特定结构的分子修饰，合成的阳离子型羧甲基壳聚糖细胞毒性较小，可以直接作用于缺损伤口，明显促进伤口愈合。

第一方面，本发明提供一种阳离子型羧甲基壳聚糖，采用如下制备方法制得：

1）将环氧氯丙烷加入到叔胺试剂中，50-60℃下加热搅拌反应0.5-2h，得到环氧烷基季铵盐，所述叔胺试剂为N,N-二甲基癸胺或N,N-二甲基十二烷基胺；

2）将步骤1）制备的环氧烷基季铵盐加入到羧甲基壳聚糖水溶液中进行反应，羧甲基壳聚糖与环氧烷基季铵盐的质量比为4.7:1-6.5:1，控制温度在55-75℃，反应32-48h，制备得到阳离子型羧甲基壳聚糖。

进一步的，阳离子型羧甲基壳聚糖的制备方法为：

1）将环氧氯丙烷加入到叔胺试剂中，50℃下加热搅拌反应2h，得到环氧烷基季铵盐，所述叔胺试剂为N,N-二甲基癸胺或N,N-二甲基十二烷基胺；

2）将步骤1）制备的环氧烷基季铵盐加入到羧甲基壳聚糖水溶液中进行反应，羧甲基壳聚糖与环氧烷基季铵盐的质量比为4.7:1，控制温度在55℃，反应48h，制备得到阳离子型羧甲基壳聚糖。

进一步的，阳离子型羧甲基壳聚糖的制备方法为：

1）将环氧氯丙烷加入到叔胺试剂中，60℃下加热搅拌反应0.5h，得到环氧烷基季铵盐，所述叔胺试剂为N,N-二甲基癸胺或N,N-二甲基十二烷基胺；

2）将步骤1）制备的环氧烷基季铵盐加入到羧甲基壳聚糖水溶液中进行反应，羧甲基壳聚糖与环氧烷基季铵盐的质量比为6.5:1，控制温度在75℃，反应32h，制备得到阳离子型羧甲基壳聚糖。

进一步的，羧甲基壳聚糖的脱乙酰度为85%-99%。

进一步的，羧甲基壳聚糖在5mg/mL的水溶液状态下黏度为10.8mPa·s。

进一步的，步骤1）反应结束后用石油醚沉淀、减压干燥，得到环氧烷基季铵盐。

进一步的，步骤2）反应结束后用乙醇沉淀、洗涤、真空干燥，得到阳离子型羧甲基壳聚糖。

第二方面，本发明还提供一种上述阳离子型羧甲基壳聚糖在制备细胞修复产品中的应用，细胞修复产品能够促进巨噬细胞从休眠态向炎症分型的转变以及从炎症分型向抗炎分型的转变。

本发明的有益效果在于：

本发明通过对羧甲基壳聚糖进行特定结构的分子修饰，合成出一种新的阳离子型羧甲基壳聚糖。通过对促愈合机制进行探究，揭示了其不同于未改性羧甲基壳聚糖的作用机制：本发明阳离子型羧甲基壳聚糖可促进伤口修复过程中巨噬细胞快速极化（即可促进巨噬细胞从休眠态向极化态转变），可促进巨噬细胞快速完成从炎症分型M1到抗炎分型M2的转变。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

实施例1阳离子型羧甲基壳聚糖Q1的制备

按照如下方法制备阳离子型羧甲基壳聚糖Q1：

1）将5g环氧氯丙烷滴加到3g N,N-二甲基癸胺中，50℃下加热搅拌2h，结束后用石油醚沉淀、减压干燥，得到环氧烷基季铵盐C10；

2）称取3g羧甲基壳聚糖（脱乙酰度99%，5mg/mL的水溶液状态下黏度为10.8mPa·s）溶解于90mL去离子水中，加入0.64g环氧烷基季铵盐C10（羧甲基壳聚糖：环氧烷基季铵盐C10投料质量比为4.7:1），控制温度在55℃，反应48h，反应结束后用乙醇沉淀、洗涤三次，经真空干燥得到阳离子型羧甲基壳聚糖Q1。

实施例2 阳离子型羧甲基壳聚糖Q2的制备

按照如下方法制备阳离子型羧甲基壳聚糖Q2：

1）将7g环氧氯丙烷滴加到3g N,N-二甲基十二烷基胺中，60℃下加热搅拌0.5h，结束后用石油醚沉淀、减压干燥，得到环氧烷基季铵盐C12；

2）称取3g羧甲基壳聚糖（脱乙酰度85%，5mg/mL的水溶液状态下黏度为10.8mPa·s）溶解于90mL去离子水中，加入0.46g环氧烷基季铵盐C12（羧甲基壳聚糖：环氧烷基季铵盐C12投料质量比为6.5:1），控制温度在75℃，反应32h，反应结束后用乙醇沉淀、洗涤三次，经真空干燥得到阳离子型羧甲基壳聚糖Q2。

对比例1 阳离子型羧甲基壳聚糖Q3的制备

按照如下方法制备阳离子型羧甲基壳聚糖Q3：

1）称取3g羧甲基壳聚糖（脱乙酰度99%，5mg/mL的水溶液状态下黏度为10.8mPa·s）溶解于90mL去离子水中，加入0.27g实施例1的环氧烷基季铵盐C10（投料质量比羧甲基壳聚糖：环氧烷基季铵盐C10为11.1:1），控制温度在55℃，反应48h。反应结束后用乙醇沉淀、洗涤三次，经真空干燥得到阳离子型羧甲基壳聚糖Q3。

对比例2 阳离子型羧甲基壳聚糖Q4的制备

按照如下方法制备阳离子型羧甲基壳聚糖Q4：

1）称取3g羧甲基壳聚糖（脱乙酰度99%，5mg/mL的水溶液状态下黏度为10.8mPa·s）溶解于90mL去离子水中，加入1.07g实施例1的环氧烷基季铵盐C10（投料质量比羧甲基壳聚糖：环氧烷基季铵盐C10为2.8:1），控制温度在55℃，反应48h。反应结束后用乙醇沉淀、洗涤三次，经真空干燥得到阳离子型羧甲基壳聚糖Q4。

将实施例1-2、对比例1-2制备的阳离子型羧甲基壳聚糖及实施例1羧甲基壳聚糖原料分别溶于生理盐水中，配置成浓度为5mg/mL的溶液，并依次命名为X1、X2、Y1、Y2、Y3。使用X1、X2、Y1、Y2、Y3溶液进行以下测试。

测试例1 细胞毒性测试

实验步骤：

将浓度为1×10

数据处理方法：

材料的细胞存活率（%）计算公式如下：细胞活性率（%）=（As-Ap）/（An-Ap）*100%，其中As、Ap、An分别为待测样品、阳性对照组和阴性对照组的吸光度。

表1 不同样品处理后细胞存活率

实验计算出的细胞存活率是相对于阴性对照组（定义为100%）的相对值，可以表征材料的细胞毒性。从表1可以看出，X1组、X2组、Y1组和Y3组四者都高于80%，细胞毒性很低，但是Y2组的存活率远低于X1组，不到60%，明显表现出较大的细胞毒性。

上述结果表明：本发明实施例接枝合适量的环氧烷基季铵盐的阳离子型羧甲基壳聚糖具有低细胞毒性，有利于其作为伤口修复材料的医学用途。但接枝过量环氧烷基季铵盐的阳离子型羧甲基壳聚糖（Y2组的羧甲基壳聚糖投料低于专利限定范围）由于具有较大的细胞毒性，不能够用于伤口修复材料。

测试例2 体外免疫细胞的NO表达量对比

实验步骤：

将浓度为1×10

数据处理方法：

将不同浓度的亚硝酸钠标准品根据同样的方法与硝酸盐还原试验试剂作用，根据浓度和570nm处吸光度绘制标准曲线，再将各处理的三个平行孔所得吸光度取平均值，代入标准曲线对应公式，计算出不同样品处理后细胞的一氧化氮（NO）表达量。

表2 不同样品处理后细胞的NO表达量

NO表达是来源于炎症分型（M1）巨噬细胞的代谢活动，此处表达量可以对应于M1细胞的数据。一般来说，和空白对照相比，NO表达量越大，代表材料对巨噬细胞产生的极化反应越大，将巨噬细胞从休眠态（M0细胞，此处对应起始的RAW264.7细胞）向极化态转变（此处对应M1细胞）转变的比例越多。

从表2可以看出，X1和X2的NO表达量远高于空白对照组，与公认的巨噬细胞极化反应刺激物脂多糖相当，表明接枝合适量的环氧烷基季铵盐的阳离子型羧甲基壳聚糖具有促进巨噬细胞极化作用，可以促进高比例的M0细胞向M1细胞转化。X1和X2的NO表达量远高于Y1、Y3，说明相比于本发明的实施例X1和X2，接枝少量环氧烷基季铵盐的阳离子型羧甲基壳聚糖（Y1的羧甲基壳聚糖投料高于专利限定范围）和未改性羧甲基壳聚糖（Y3）不具备明显的促进巨噬细胞极化作用。

测试例3 大鼠伤口愈合效果对比

实验步骤：

1）将SD大鼠（雄性，270-300g）置于异氟烷诱导箱内，麻醉后剔除背部的毛，在脊柱两侧各开两个直径为1cm的圆形全层缺损伤口（每只老鼠四个伤口），在开伤口当天（第一天），对伤口拍照用于统计初始伤口面积和计算愈合率；

2）将SD大鼠分为五组，依次为X1组、X2组、Y1组、Y3组和空白对照组，每组各三只大鼠，每组大鼠的各伤口均立即涂抹100μL对应溶液（X1、X2、Y1、Y3溶液和生理盐水），然后用敷料贴覆盖、纱布包扎；

3）此后隔天给药两次（第三天、第五天），选择第七天作为最终观察点，拍照观察伤口计算伤口面积，取伤口组织切片用荧光染料对切片处巨噬细胞分型进行染色。

数据处理方法：

1）将不同处理组的大鼠在第七天的伤口面积和初始伤口面积相除，计算相对伤口面积百分比，用100%减去这一百分比，计算出伤口愈合率；

2）荧光染料可以分别将抗炎分型（M2）细胞和总的巨噬细胞（M1和M2）染色为红绿两种不同荧光，通过ImageJ软件统计两种荧光的比例，计算出M2细胞的相对比例。

表3 不同组大鼠的伤口愈合率

表4 不同组大鼠的伤口组织切片中M2细胞比例

伤口愈合率可以直观地指示不同样品处理后伤口的修复速度。从表3可以看出，X1组和X2组的愈合率远高于空白对照组，表明接枝环氧烷基季铵盐的阳离子型羧甲基壳聚糖具有显著的促进伤口修复效果。此外，X1组和X2组的愈合率远高于Y1组、Y3组，说明接枝少量环氧烷基季铵盐的阳离子型羧甲基壳聚糖（Y1组的羧甲基壳聚糖投料高于专利限定范围）和未改性羧甲基壳聚糖（Y3组）不具备明显的促进伤口修复效果。

M2细胞是抗炎分型巨噬细胞，可以发挥促进伤口组织修复的功能。一般来说，和空白对照组相比，在愈合中期（大鼠伤口愈合的第七天）M2细胞在巨噬细胞中比例越大，代表材料可以促进巨噬细胞更多、更早地向M2表型转变，越有利于伤口修复。从表4可以看出，X1组和X2组的M2细胞比例远高于空白对照组、Y1组和Y3组，表明接枝合适量的环氧烷基季铵盐的阳离子型羧甲基壳聚糖，可以更多、更早地向M2表型转变，这是其发挥显著促进伤口修复效果的关键作用之一。

特别指出的是，结合表2体外细胞实验数据以及表3和表4的动物实验结果，可以推断本发明阳离子型羧甲基壳聚糖促进伤口愈合作用机制为：其不仅可以促进巨噬细胞从休眠态（M0细胞）更多地向炎症分型（M1细胞）转变，也可以促进M1细胞更多地向抗炎分型（M2细胞）转变，这两步过程可能同时发生、也可能先后发生，但都有利于伤口快速修复。

综上所述，本发明的阳离子型羧甲基壳聚糖可促进伤口修复过程中巨噬细胞快速极化，包括巨噬细胞从休眠态向极化态的转变以及巨噬细胞快速从炎症分型M1到抗炎分型M2的转变两个过程，从而达到促进伤口修复、提高伤口愈合速度的效果，能够应用于伤口修复材料的制备。

尽管通过优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。