一种粪便中与营养物质代谢相关菌种的定量方法

技术领域

本发明属于微生物学和分子生物学技术领域，具体涉及一种粪便中与营养物质代谢相关菌种的定量方法。

背景技术

肠道微生物群落是人类肠道内共生的微生物群落，其在维护人体健康和代谢疾病的发生发展方面具有重要作用。已有研究表明，肠道微生物与营养物质的代谢之间存在密切关系，并且某些菌群对营养物质的代谢具有重要作用。因此，开发一种能够准确检测与营养物质代谢有关的菌群的定量方法，对于深入研究肠道微生物与营养物质代谢的相互作用有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的上述问题，首先提供一种基于粪便样本中与营养物质代谢有关的菌种进行绝对定量检测的方法，主要以青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、直肠真杆菌(Eubacterium rectale)、霍氏真杆菌(Eubacterium hallii)等与营养物质代谢有关的菌种作为检测对象。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种用于检测粪便样本中参与营养物质代谢的菌种的引物组，所述菌株为青春双歧杆菌、长双歧杆菌、直肠真杆菌、霍氏真杆菌；所述引物组序列如SEQ ID NO：1～8所示。

本发明还提供一种用于绝对定量粪便样本中参与营养物质代谢的菌种的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物组。

本发明还提供一种用于绝对定量粪便样本中参与养物质代谢的菌种的标准曲线，当所述菌株为青春双歧杆菌，其标准曲线公式为y＝-4.1192x+46.083，R

本发明还提供上述标准曲线构建的方法，包括以下步骤：

分别合成青春双歧杆菌、长双歧杆菌、直肠真杆菌、霍氏真杆菌的特异性片段并克隆到质粒上，提取重组质粒，测定浓度，制备一系列已知浓度的标准质粒，并将其浓度用分光光度计测定，制得重组质粒标准模板；将特异性引物加入到重组质粒标准模板中，进行荧光定量PCR检测，建立Ct值与拷贝数之间的转换关系，即得标准曲线。

本发明还提供所述引物组或所述试剂盒或所述标准曲线在对粪便样本中参与营养物质代谢的菌种进行绝对定量中的应用。

本发明还提供一种用于绝对定量粪便样本中参与营养物质代谢的菌种的方法，包括以下步骤：

S1、采集人粪便样本进行基因组提取；

S2、以人粪便样本基因组为模板，以权利要求1所述引物组对模板进行扩增，得到扩增曲线的Ct值；

S3、对应权利要求3所述的标准曲线，根据样本的Ct值和拷贝数之间的转换关系，得出样本中对应菌株的拷贝数。

优选的，S2扩增的反应体系为：2X SYBR qPCR Master Mix 10μL，引物各0.4μL，ddH

优选的，S2扩增的反应条件为：95℃，5min；95℃，10s 60℃，30s 72℃，30s，40个循环。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种可靠且准确的方法，该方法基于qPCR技术平台，针对不同菌种设计特异引物，结合标准曲线法对粪便样品中目标菌群的定量进行精准、快速、可靠的检测。

该方法能够可靠地评估肠道内与营养物质代谢相关的菌株的丰度，为个体化的营养干预措施和预防代谢相关疾病提供有力支持。通过这种方法，可以更好地了解肠道微生物群在人体健康和疾病中的作用。此外，这些特异引物的广泛适用性使得本发明在不同动物上都具有潜在的应用场景，包括但不限于人类、家畜和实验动物。因此，本发明为营养学、临床医学和微生物生态学等领域的研究提供了重要的工具和可靠的数据基础，拓展了我们对肠道微生物与营养代谢关联的认识，为相关研究领域的进一步发展提供了新的机会和方向。

附图说明

图1为实施例1中的特异性引物设计流程图；

图2是实验例2中实时荧光PCR引物特异性试验扩增曲线图；

图3是实验例2中实时荧光PCR引物特异性试验熔解曲线图；

图4是实验例3中实时荧光PCR标准曲线图；

图5是实验例4中脆弱拟杆菌、肠道拟杆菌、多形拟杆菌、假小链双歧杆菌、活泼瘤胃球菌、德氏乳酸杆菌在人类粪便中的存在量；

图6是实验例5中的粪便基因组的实时荧光PCR熔解曲线图；

图7是实验例5中的粪便基因组的实时荧光PCR熔解曲线图。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

实施例1引物对的设计和初步验证

根据

本实施例中初步验证合格的引物对的序列如表1所示。

表1

引物设计完成后先利用在NCBI网站的Primer-blast(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)和Nucleotide BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastn&PAGE_TYPE＝BlastSearch&LINK_LOC＝blasthome)对引物及引物所对应的特异性产物的特异性进行初步评价。

实施例2进一步检测引物特异性

本实施例的实时荧光PCR反应体系见表2。其中，SYBR实时荧光PCR反应的扩增程序为：95℃，5分钟预热；95℃，10s变性；60℃，30s退火；72℃，30s延伸；40个循环，熔解曲线的反应程序为：95℃，10s；65℃，60s；97℃，1s，1个循环。

表2SYBR实时荧光PCR反应体系

收集粪便样本，并提取样本中的基因组；如表2所示体系准备PCR反应混合液，每对引物设置两个加入模板的技术重复和一个不加模板的空白对照(确认引物是否会产生引物二聚体)；将反应混合液装入实时荧光PCR仪器，并按照扩增程序进行PCR扩增；在PCR扩增过程中，实时监测荧光信号，并记录荧光信号的强度；扩增结束后，进行熔解曲线分析(曲线平滑，单峰)，通过不同温度下荧光信号的变化情况确定目标菌株的特异性。

判断标准：引物对不会产生引物二聚体，且该引物对及其扩增产物在复杂的动物粪便中都具有较高的特异性(扩增曲线和熔解曲线分别如图2和图3所示)。本实施例中最终验证合格的引物对的序列如表3所示。

表3

实施例3实时荧光PCR标准曲线的构建和检测限的划定

包括以下步骤：

步骤一：合成特异性片段。利用基因合成技术，合成青春双歧杆菌、长双歧杆菌、直肠真杆菌、霍氏真杆菌的特异性片段，并将其克隆到质粒上。

步骤二：制备标准质粒。提取重组质粒，并测定其浓度。根据浓度，制备一系列已知浓度的标准质粒。浓度范围涵盖目标菌株的丰度范围，并使用分光光度计对其浓度进行准确测定，得到重组质粒标准模板。

步骤三：进行PCR扩增与荧光定量。将特异性引物加入到标准质粒中，进行荧光定量PCR检测。通过记录荧光信号的阈值周期数(Ct值)，建立Ct值与特异性引物拷贝数之间的转换关系。根据已知浓度的标准质粒，可以得出Ct值与特异性引物拷贝数之间的标准曲线。

我们根据实施例3中筛选完成的特异性引物，选择其所对应的片段为特异性片段进行后续实验。首先，我们需要将这些特异性片段克隆到质粒上，以便进行进一步的操作。为此我们委托了擎科生物有限公司(南京)合成完成特异性片段的合成并选定pUC-19为我们的质粒载体，采用限制酶双酶切的方式5'端选定HindIII为酶切位点，3'端选定BamHI为酶切位点，将特异性片段与载体连接；其次我们从含有目的片段的克隆子中提取质粒DNA，将重组质粒梯度稀释成20ng/μL、2ng/μL、0.2ng/μL、0.02ng/μL、0.002ng/μL、0.0002ng/μL、0.00002ng/μL、0.000002ng/μL共八个浓度梯度。

结果：qPCR得到的6株菌的qPCR扩增活菌数对数lgCFU与Ct值的关系如图4所示，由标准曲线可知这6株菌的Ct值检测范围在5～31之间，具有很高的灵敏度与特异性。

实施例4样本中青春双歧杆菌、长双歧杆菌、直肠真杆菌、霍氏真杆菌的绝对定量检测方法

结合实施例1和实施例2的步骤，可以进行以下步骤：

1、收集粪便样本，并提取样本中的基因组DNA。

2、进行青春双歧杆菌、长双歧杆菌、直肠真杆菌、霍氏真杆菌的qPCR检测，根据第一实施方法中建立的标准曲线，确定目标菌株的拷贝数。

3、结合第二实施方法中建立的标准曲线，根据样品中各目标菌株的拷贝数，精确地对粪便中的青春双歧杆菌、长双歧杆菌、直肠真杆菌、霍氏真杆菌进行定量分析，具体可见图5。

实施例5在不同物种粪便样本中的特异性验证

1、随机采集猪、牛、兔、狗、鸡、猫、羊、鼠的粪便提取粪便基因组。

2、按照第二实施例进行qPCR反应液的配制与扩增。

3、在qPCR扩增过程中，实时监测荧光信号，并记录荧光信号的强度。

4、扩增结束后，进行熔解曲线分析，通过不同温度下荧光信号的变化情况确定目标菌株的特异性。

结果：4株菌的特异性引物在不同物种来源的粪便样本的特异性如图6、7所示，熔解曲线平滑单峰，Ct值在5～31之间则判断为阳性结果，长双歧杆菌特异性引物主要对：牛、兔、猪、鸡、羊表现出高特异性；霍氏真杆菌特异性引物主要对：牛、鸡、鼠、猪、羊表现出高特异性；直肠真杆菌特异性引物主要对：牛、猪表现出高特异性；青春双歧杆菌的特异性引物主要对：狗、猫、鼠、牛、兔、猪表现出高特异性。

通过上述实施方法，本发明能够可靠地评估粪便中与营养物质代谢相关的菌株的丰度，为个体化的营养干预措施和预防代谢相关疾病提供有力支持。同时，该方法还能为营养学、临床医学和微生物生态学等领域的研究提供重要的工具和数据基础，促进对肠道微生物与营养代谢关联的进一步认识。此外，本发明的引物在不同动物上的特异性验证为该方法在广泛的应用场景中具备潜力，并为相关领域的研究提供了新的机会和方向。

以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。