一种基于生物离子液体聚合的复合水凝胶及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种基于生物离子液体聚合的复合水凝胶及其制备方法，属于材料技术领域。

背景技术

伤口愈合是一个复杂而动态的过程，包括止血、炎症、增殖和重塑四个连续但重叠的阶段。在这个过程中，不受控制的出血、细菌感染和持续的炎症是最致命的问题，会引起伤口疼痛、愈合延迟甚至死亡。一方面，止血是至关重要的，因为短时间的大出血会带来休克或其他严重的并发症。另一方面，细菌可通过释放内毒素、增加促炎细胞因子或外毒素的释放、阻止血管生成和上皮化造成组织损伤。因此，设计一种能迅速控制出血并具有抑菌作用的创面敷料具有重要意义。

开发抗菌创面敷料的一种常见方法是将抗菌剂封装或吸附在敷料上。但其中一个问题是抗菌药物的浸出。敷料会在短时间内失去抗菌效果，使伤口暴露在高浓度药物中，对患者产生副作用。这促进了具有持久内在抗菌活性的创面敷料的构建。除上述要求外，还希望研制出生物相容性好、机械强度和组织粘连适宜、使用方便、易去除、保持环境湿润、水蒸汽透出性好的创面敷料。因此，设计一种有效的复合创面敷料是一项重大挑战，特别是要确保所需的性能成功组合。

水凝胶是由亲水性的天然或合成聚合物制成的三维聚合物网络，通过物理或化学交联使它不溶于水，具有成为伤口敷料的潜力。原因如下:首先，三维网络可以吸收和保留大量的水，保持一个潮湿的环境。第二，水凝胶可以吸收组织渗出液，对坏死的组织补水，增强自溶和清创。此外，水凝胶还能促进血栓的形成，在出血部位形成物理屏障，从而快速止血。水凝胶类似于细胞外基质，具有显著的生物相容性，它们的多孔结构有助于氧气运输到损伤区域。因为氧气是成纤维细胞分泌胶原蛋白和细胞外基质化合物、血管生成和组织形成所必需的。因此，水凝胶在生物医学领域有着广泛的应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是设计出一种具有多功能的伤口敷料，确保所需的性能成功组合，并将其制备成水凝胶。

一种基于生物离子液体聚合的复合水凝胶，所述复合水凝胶具有三维网络结构，且该三维网络结构由两种网络交织而成：

其一：生物离子液体与甲基丙烯酰化透明质酸聚合，及甲基丙烯酰化透明质酸自交联形成的网络；

其二：氧化透明质酸和ε-聚赖氨酸通过亚胺键形成的网络。

上述网络中，生物离子液体与甲基丙烯酰化透明质酸发生自由基聚合反应进行聚合，将结构中的不饱和双键打开，形成生物离子液体-CH

优选地，所述复合水凝胶是以甲基丙烯酰化透明质酸、氧化透明质酸、生物离子液体和ε-聚赖氨酸为原料，通过紫外光原位交联制备而成的。

进一步地，所述甲基丙烯酰化透明质酸与氧化透明质酸的质量比为7：1～7：2；甲基丙烯酰化透明质酸与ε-聚赖氨酸的质量比为7：1～7：2；甲基丙烯酰化透明质酸与生物离子液体的质量比为7：1～7：37.5。

更进一步地，优选所述甲基丙烯酰化透明质酸与氧化透明质酸的质量比为7：2；甲基丙烯酰化透明质酸与ε-聚赖氨酸的质量比为7：2；甲基丙烯酰化透明质酸与生物离子液体的质量比为7：37.5。

优选地，所述原料还包含水。进一步地，所述生物离子液体与水的质量比为1：49～3：1。更进一步地，优选所述生物离子液体与水的质量比为3：1。

本发明所述基于生物离子液体聚合的复合水凝胶在进行制备时，加入了光交联所需的光引发剂和光交联剂。光引发剂和光交联剂的用量满足使光交联反应能够反应充分即可，本领域技术人员可确定其用量。

优选地，所述光引发剂是1-羟基环己基苯基酮，所述光交联剂为聚乙二醇双丙烯酸酯。

本发明所述复合水凝胶是以甲基丙烯酰化透明质酸，氧化透明质酸、生物离子液体和ε-聚赖氨酸(必要时还包括水)为原料，通过紫外光交联制备而成的。该复合水凝胶具有三维网络结构，主要由两种网络交织而成：一个是，生物离子液体与甲基丙烯酰化透明质酸聚合，及甲基丙烯酰化透明质酸自交联形成的网络，通过光交联实现；另一个是：氧化透明质酸和ε-聚赖氨酸通过亚胺键形成的网络，通过席夫碱反应实现。所制备的复合水凝胶具有良好的生物相容性，抗菌活性，止血作用，还能促进伤口愈合。

优选地，所述的复合水凝胶是通过以下步骤制备的：

用水稀释生物离子液体，搅拌均匀，得到澄清均一的溶液A，作为反应的溶剂；将甲基丙烯酰化透明质酸，氧化透明质酸均匀混合，得到混合物B；将混合物B缓慢地加入到溶液A中，搅拌均匀，得到混合物C；将ε-聚赖氨酸溶液加入到混合物C中，混合均匀，得到混合物D；在混合物D中加入光引发剂和光交联剂，混合均匀，得到混合物E；将混合物E置于紫外灯下，进行交联。

进一步地，光交联时间为600s，波长为365nm。

进一步地，所述光引发剂是1-羟基环己基苯基酮，所述光交联剂为聚乙二醇双丙烯酸酯。

进一步地，所述ε-聚赖氨酸溶液的浓度为0.5g/mL。

进一步地，所述生物离子液体按下述方法制得：将氢氧化胆碱与丙烯酸混合进行反应；将产物通过有机溶剂多次洗涤，真空干燥即得；

其中，氢氧化胆碱与丙烯酸的摩尔比为1:1～1:2，所述反应的反应温度为4℃，反应时间为24h；所述有机溶剂为乙醚和乙酸乙酯。

进一步地，所述甲基丙烯酰化透明质酸按下述方法制得：将甲基丙烯酸酐加入到透明质酸溶液中进行反应，反应条件为冰浴，反应体系的pH保持在8-10的范围内；反应结束后，将反应液透析，冻干，即得，

其中，透明质酸溶液中透明质酸的浓度为0.1-0.2g/mL，所述透明质酸溶液为由体积比为3：2的水和N,N二甲基甲酰胺组成的混合液；透明质酸与甲基丙烯酸酐的摩尔比为1：3～1：10。

更进一步地，所述甲基丙烯酰化透明质酸的接枝率为12％-30％；最优先地，接枝率为22％。

进一步地，所述氧化透明质酸按下述方法制得：将高碘酸钠加入到透明质酸水溶液中反应，反应条件为室温避光反应；反应结束后，将反应液透析，冻干，即得，

其中，透明质酸水溶液中透明质酸的浓度为0.1-0.2g/mL，透明质酸与高碘酸钠的摩尔比为1：0.25-1：1。

更进一步地，所述氧化透明质酸的氧化度为20％-80％；最优选地，氧化度为30％。

本发明有一方面提供上述基于生物离子液体聚合的复合水凝胶作为伤口愈合敷料的应用。

本发明的有益效果为：本发明涉及一种基于生物离子液体聚合的多功能复合水凝胶及其制备方法。多功能复合水凝胶是由合成的甲基丙烯酰化透明质酸，氧化透明质酸，生物离子液体和ε-聚赖氨酸作为原料，通过紫外交联制备而成的水凝胶，具有良好的止血和抗菌能力，并能促进伤口愈合。透明质酸衍生物具有促进凝血和伤口愈合的特性。ε-聚赖氨酸具有长效广谱抗菌性能，还可以通过席夫碱反应与醛基结合。胆碱基生物离子液体是细胞膜中磷脂双分子层的结构前体，将其交联到聚合物上可显著提高聚合物的粘附力。此外，潮湿的环境也有利于伤口愈合。本发明所制备的水凝胶可应用于出血部分，可以起到快速止血，长效抗菌进而促进伤口愈合的作用。

附图说明

图1为实施例1中生物离子液体的核磁图谱及结构式。

图2为实施例1中甲基丙烯酰化透明质酸的核磁图谱及结构式。

图3为实施例1中氧化透明质酸的核磁图谱及结构式。

图4为实施例1所制备的复合水凝胶的核磁图谱。

图5为实施例1，2，3，4所制备的复合水凝胶的合成流程图。

图6为实施例1所制备的复合水凝胶在扫描电镜下的微观结构图像。

图7为实施例1，2，3，4所制备的复合水凝胶的溶胀率随时间变化的曲线。

图8为实施例1，2，3，4所制备的复合水凝胶的孔隙率和水蒸气透过率。

图9为实施例1，2，3，4所制备的复合水凝胶的溶血率。

图10为实施例1，2，3，4所制备的复合水凝胶对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的抗菌效果直观图。

图11为实施例1，2，3，4所制备的复合水凝胶的体外凝血指数。

图12为实施例1所制备的复合水凝胶应用于大鼠断尾模型时，断尾处的失血量及止血时间。

图13为实施例1所制备的复合水凝胶应用于大鼠背部伤口处，在第0，3，6，9，12和15天的伤口愈合率。

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

下述实施例中所述试验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

具体实施方式之一：

一、新方法合成的生物离子液体，所述的生物离子液体，是通过以下步骤完成的：

(A)将氢氧化胆碱与丙烯酸混合进行反应；

(B)将产物通过有机溶剂多次洗涤，真空干燥即得。

所述步骤(A)中氢氧化胆碱与丙烯酸的摩尔比为1:1-1:2，所述的反应，反应温度为4℃，反应时间为24h。

所述步骤(B)中有机溶剂为乙醚，乙酸乙酯。

二、合成甲基丙烯酰化透明质酸的方法，所述的甲基丙烯酰化透明质酸，是通过以下步骤完成的：

(A)将透明质酸溶于去离子水得到混合液A；

(B)加入N,N二甲基甲酰胺到混合液A中，搅拌均匀，得到混合液B；

(C)将甲基丙烯酸酐加入到混合液B中，进行反应；

(D)反应结束后，将反应液透析，冻干，即得。

所述步骤(A)中透明质酸的浓度为0.1-0.2g/mL。

所述步骤(B)中水与N,N二甲基甲酰胺的体积比为3:2。

所述步骤(C)中透明质酸与甲基丙烯酸酐的摩尔比为1：3-1：10，反应条件是冰浴，反应时间为24h，反应过程中体系的pH保持在8-10的范围内。

所述步骤(D)中，透析时间为3d，产物在室温下保存。

三、合成氧化透明质酸的方法，所述的氧化透明质酸，是通过以下步骤完成的：

(A)将透明质酸溶于去离子水得到混合液A；

(B)将高碘酸钠加入到混合液A中，进行反应；

(C)反应结束后，将反应液透析，冻干，即得。

所述步骤(A)中透明质酸的浓度为0.1-0.2g/mL，透明质酸与甲基丙烯酸酐的摩尔比为1：0.25-1：1。

所述步骤(B)中反应条件是室温避光反应，反应时间为2h。

所述步骤(C)中，透析时间为3d，产物在室温下保存。

四、用于伤口抗菌，止血的复合水凝胶的合成方法，所述的复合水凝胶，是通过以下步骤制备的：

(A)使用纯净水稀释生物离子液体，搅拌均匀，得到澄清均一的溶液A，作为反应的溶剂；

(B)将甲基丙烯酰化透明质酸，氧化透明质酸均匀混合，得到混合物B；

(C)将混合物B缓慢地加入到溶液A中，搅拌均匀，得到混合物C；

(D)将ε-聚赖氨酸溶液加入到混合物C中，混合均匀，得到混合物D；

(E)在混合物D中加入光引发剂和光交联剂，混合均匀，得到混合物E；

(F)将混合物E置于紫外灯下，进行交联，即得。

所述步骤(A)中，溶液A中，生物离子液体与水的质量比为1：49～3：1，优选的质量比为3：1；甲基丙烯酰化透明质酸与生物离子液体的质量比为7：1～7：37.5，优选为7：37.5。

所述步骤(B)中，甲基丙烯酰化透明质酸，接枝率为12％-30％，优选接枝率为22％；氧化透明质酸，氧化度为20％-80％，优选氧化度为30％。

所述步骤(B)中，甲基丙烯酰化透明质酸与氧化透明质酸的质量比为7：1～7：2，优选的质量比为7：2。

所述步骤(D)中，ε-聚赖氨酸溶液(0.5g/mL)，使用纯净水溶解ε-聚赖氨酸得到，甲基丙烯酰化透明质酸与ε-聚赖氨酸的质量比为7：1～7：2，优选的质量比为7：2。

所述步骤(E)中，光引发剂是1-羟基环己基苯基酮，光交联剂为聚乙二醇双丙烯酸酯。

所述步骤(F)，中的交联是指通过紫外光进行交联，时间为600s-1200s，波长为365nm，其中，最佳时长为600s。

实施例1

一、生物离子液体的制备

(1)将氢氧化胆碱(8.096g)缓缓加入到丙烯酸(2.219g)中，在4℃下反应24h，然后用乙醚和乙酸乙酯多次洗涤，真空干燥纯化产物，室温保存。

(2)取5.00mg生物离子液体溶解在D

(3)在

二、甲基丙烯酰化透明质酸的制备

(1)称取透明质酸(2.0g)完全溶解于200mL蒸馏水。然后，加入135mLN,N二甲基甲酰胺。在4℃冰浴中反应，滴加2.46g甲基丙烯酸酐到溶液中。同时，用2M NaOH保持溶液pH值为8-9。下一步，将得到的溶液转移到透析袋(8-14kDa)中，去离子水透析72h。最后，将冷冻干燥得到的纯化产物，室温保存。

(2)取5.00mg制备的甲基丙烯酰化透明质酸溶解在D

(3)在

三、氧化透明质酸的制备

(1)称取透明质酸(2.0g)完全溶解于200mL蒸馏水。在室温下避光反应，加入0.535g高碘酸钠到溶液中，反应2h。为了停止反应，在反应溶液中加入过量的乙二醇(1.0g)，再搅拌1h。下一步，将得到的溶液转移到透析袋(8-14kDa)中，去离子水透析72h。最后，将冷冻干燥得到的纯化产物，室温保存。

(2)取5.00mg氧化透明质酸溶解在D

(3)在

四、复合水凝胶的制备及表征

1、复合水凝胶的制备

(1)将甲基丙烯酰化透明质酸(1.4g)和氧化透明质酸(0.4g)在室温下溶解在10g生物离子液体溶液(由7.5g生物离子液体和2.5g水配制)中。搅拌均匀后，加入ε-聚赖氨酸溶液(0.5g/mL，800μL)。其次，在溶液中分别加入，聚乙二醇双丙烯酸酯(120μL)和1-羟基环己基苯基酮(10mg)作为光交联剂和光引发剂。最后，将混合物转移到波长为365nm的紫外灯下，进行600s快速光交联。

2、复合水凝胶形态观察

(1)用扫描电镜观察复合水凝胶的微观结构。

(2)如图6所示，复合水凝胶具有三维网络结构。

3、复合水凝胶的溶胀曲线

(1)用模具制作圆形水凝胶样品(W

(2)复合水凝胶的溶胀性随时间的变化如图7所示。所有浓度的样品4h内基本达到溶胀平衡，且在24h后溶胀率均无显著增加。

4、复合水凝胶的水蒸气透过率考察

(1)将含有纯净水的瓶子称量(w

(2)从图8的结果可以看出，复合水凝胶随着生物离子液体浓度的增加，孔隙率逐渐降低，这与SEM结果一致。

5、复合水凝胶的孔隙率考察

(1)采用乙醇取代法，测定了水凝胶样品的孔隙率。首先，称量10mL含5mL无水乙醇的离心管的质量(m

(2)复合水凝胶由于亲水性和多孔结构，具有良好的水蒸气渗透性(如图8所示)。

6、复合水凝胶的血液相容性考察

(1)制备出含有不同浓度的复合水凝胶，用生理盐水浸提，得到不同浓度浸提液。然后，将浸提液与大鼠的红细胞(RBCs，2％v/v)在37℃恒温条件下共孵育3h。生理盐水处理的红细胞混悬液作阴性对照，纯净水处理的红细胞混悬液作阳性对照。孵育完成后，将产物在13000rpm离心5min，测量上清液在545nm处的吸光度值。每组平行测量三次。溶血率(Hemolysis ratio,％)的计算公式如下：

(2)如图9所示，复合水凝胶的溶血率都远小于5％，具有良好的血液相容性。

7、复合水凝胶的抗菌效果考察

(1)制备不同浓度的复合水凝胶，采用平板法考察复合水凝胶的抗菌活性。取复合水凝胶加入到含有2000μL的细菌悬液的24孔板中(10

(2)如图10直观图所示，复合水凝胶对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有很强的杀伤作用。说明复合水凝胶具有良好的抗菌活性。

8、复合水凝胶的动态凝血效果考察

(1)将复合水凝胶分别置于培养皿中，37℃预热5min。然后，在水凝胶表面缓慢加入100μL含EDTA-K2的新鲜大鼠全血，然后立即加入20μL CaCl

(2)如图11所示，与纱布组的对比显示，复合水凝胶均显著提高了体外凝血率。

9、复合水凝胶的体外止血性能考察

(1)采用大鼠断尾模型对制备的水凝胶的止血能力进行评价。选取6只SD大鼠(200-280g)，随机分为2组，称量后用10％水合氯醛(腹腔注射，5mL/kg)麻醉。在大鼠尾尖3cm处做标记，用剪刀剪断，待不受控制的出血1min后，立即在断尾上涂布水凝胶，并用预称的多层滤纸在下方吸取多余的血液。对照组采用纱布治疗。

(2)从图12中可以发现，复合水凝胶稳定地附着在出血部位，没有脱落。并且复合水凝胶的止血效果优于纱布。

10、复合水凝胶的伤口愈合效果考察

(1)本研究以SD大鼠为模型，评价复合水凝胶的创面愈合性能。所有大鼠(200-280g)随机分为对照组和复合水凝胶组，每组3只。麻醉是通过在密闭室中吸入乙醚气体进行的。麻醉后，对大鼠背部脱毛，然后用外科剪刀在其背部剪出一个直径约15mm的全层伤口。水凝胶组大鼠伤口用复合水凝胶处理，对照组不作处理。分别在治疗后0、3、6、9、12、15天记录创面光学图像。采用专业软件(ImageJ 1.8.0)准确测量创面面积。伤口愈合率(wound healing ratio,％)按下式计算:

(2)如图13所示，复合水凝胶组的创面愈合速度始终快于空白组，且经过15天的治疗，复合水凝胶组的创面愈合率几乎达到100％。

实施例2

复合水凝胶的制备

制备过程同实施例1，生物离子液体的配制发生变化，变成由5g生物离子液体和5g水配制。制备得到复合水凝胶具有优良的性质。

实施例3

复合水凝胶的制备

制备过程同实施例1，生物离子液体的配制发生变化，变成由2.5g生物离子液体和7.5g水配制。制备得到复合水凝胶具有优良的性质。

实施例4

复合水凝胶的制备

制备过程同实施例1，生物离子液体的配制发生变化，变成由0.2g生物离子液体和9.8g水配制。制备得到复合水凝胶具有优良的性质。