一种检测血清中甲基化半胱氨酸的方法

技术领域

本发明涉及一种检测血清中甲基化半胱氨酸的方法，属于生物技术和分析测试领域。

背景技术

甲基化半胱氨酸(Hcy)是甲硫氨酸代谢产生的中间产物。在人体中，有大约98％-99％的Hcy通过二硫键与蛋白、氨基酸形成复合物，仅有1％-2％的Hcy以游离态存在。正常人血清中Hcy总量在5-15微摩每升(μM)，小于6微摩每升是最佳的数值。临床医学研究表明，Hcy浓度高于正常值，会导致患者患有心血管系统疾病、糖尿病、高血压等疾病的发病率增加。血液中的Hcy浓度与心脑血管疾病具有显著正相关性。因此，Hcy浓度检测已经成为心脑血管类疾病临床诊断和普通人健康体检的一项重要内容。现有检测Hcy的方法主要有高效液相色谱法、放射免疫分析法、酶循环法。其中，高效液相色谱法依赖高昂的仪器设备、熟练的技术人员，因此不便于在基层单位使用。放射免疫分析法需要使用放射性试剂，安全性差。

目前，最常用的检测Hcy总量的方法是酶循环法。如图1所示，其检测原理包括多个反应步骤。首先，将氧化型Hcy还原为游离型Hcy。然后，游离型Hcy在Hcy甲基转移酶的催化作用下，与S-腺苷甲硫氨酸(SAM)反应形成甲硫氨酸、S腺苷同型半胱氨酸(SAH)。SAH被SAH水解酶水解生成腺苷和Hcy。生成的Hcy加入下一轮循环反应，继续生成腺苷。腺苷水解为次黄苷和氨，氨在谷氨酸脱氢酶的作用下，使还原型辅酶I(NADH)转化为氧化型辅酶I(NAD)。样本中的Hcy浓度与NAD浓度的变化呈正比。通过检测NAD在340纳米(nm)处的紫外可见吸收，来实现对Hcy的定量检测。酶循环法检测中需要的试剂种类较多，成本较高，目前只能在实验室进行检测，且检测结果易受内源性干扰。因此，迫切需要快速、灵敏、廉价的检测Hcy的方法。

核酸适配体是一种具有独特空间构型、可以特异性识别靶标的单链DNA或RNA分子。核酸适配体通过体外筛选技术获得，可以通过化学合成得到，批次之间性能差异较小，而且成本较低。近些年来，基于核酸适配体的快速检测方法备受关注，目前已经实现对抗生素、毒素等多种小分子靶标的快速、灵敏检测。Hcy的DNA核酸适配体文献中已有报道(5’ACCAGCACATTCGATTATACCAGCTTATTCAATTCACAGCTATGTCCTATACCAGCTTATTCAATT-3’,RSC Adv.,2013,3,24415–24422)，解离常数为600±300纳摩尔每升(nM)。将该核酸适配体与纳米金结合，实现了对游离Hcy的比色检测。在10％血清中标准添加游离Hcy,检测限(LOD)为0.5μM(对100％血清相当于5μM)，动力学区间为0.5–3.0μM(RSC Adv.,2013,3,24415–24422)。将该核酸适配体与电化学传感器结合，实现了对游离Hcy的电化学检测，在缓冲液中的LOD为0.01μM，动力学区间为0.05–20.0μM(Bioelectrochemistry,2020,134,107497)。但是该方法受血清基质的影响很大，对50％血清中游离Hcy的检出限高于1μM(对100％血清相当于2μM)。正常人血清中游离Hcy的浓度约为50nM-0.3μM，因此上述两篇文献所报道的方法的灵敏度差，均无法检测出血清中游离Hcy。

倏逝波光纤传感器是一种可以用于连续检测的光学传感器，它利用光波在光纤内以全反射的方式传输时，在光疏介质一侧的界面上产生的倏逝波激发光纤表面上的荧光基团，通过荧光强度的变化来实现对待测物含量的连续定量检测。近期我们将核酸适配体与倏逝波传感器相结合，利用原位富集检测的策略，实现了对多种小分子靶标的超灵敏检测(国家发明专利申请：201910509959.0；PCT/CN2020/079442)。

发明内容

本发明中，我们首次实验证实了血清中游离Hcy的浓度与按照酶循环法测得的总Hcy浓度存在极高的线性相关性。对病人血清样本进行检测时，游离Hcy浓度均为酶循环法测得的总Hcy浓度的1.36％，线性相关系数为0.9893。因此通过检测血清中游离Hcy的浓度xμM，按照公式y＝73.5x+0.919,就可以计算出血清中Hcy总量yμM。

本发明提供一种检测血清中甲基化半胱氨酸的方法，该方法是通过检测血清样本中游离甲基化半胱氨酸的浓度，根据游离甲基化半胱氨酸的浓度和总甲基化半胱氨酸浓度呈线性正相关性，由此计算出血清中甲基化半胱氨酸总量。

进一步，上述检测血清中甲基化半胱氨酸的方法，通过检测血清样本中游离甲基化半胱氨酸的浓度xμM，按照公式y＝73.5x+0.919,计算出血清中甲基化半胱氨酸总量yμM。

进一步，上述检测血清中甲基化半胱氨酸的方法，将测试得到的阳性样本相对阴性样本的荧光信号下降百分比代入标准曲线中的拟合方程y＝10.29x+96.5，R

进一步，上述检测血清中甲基化半胱氨酸的方法，检测血清样本中游离甲基化半胱氨酸的浓度的步骤如下：缓冲液A为50mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、100mM氯化钠、1mM氯化镁、20mM氯化钾、1mM氯化钙，pH 7.4，仅用缓冲液A将血清样本稀释1万倍即可，无需血清样本前处理，然后将其与20nM的荧光基团Cy 5.5标记的甲基化半胱氨酸核酸适配体的互补链c-Hcy 40-Cy 5.5：GATGCCTGTGAA-Cy5.5混合、孵育后，经过以下三个步骤将混合物引入倏逝波光纤传感系统。步骤1：泵入缓冲液A 30秒清洗进样管道和光纤反应池，保证基线平稳；步骤2：将血清样本和c-Hcy 40-Cy5.5：GATGCCTGTGAA-Cy5.5的混合物泵入光纤反应池，耗时20秒，并保持180秒，实时测定荧光信号；步骤3：通入洗涤缓冲液0.5％SDS,pH 1.9冲洗30秒，冲洗掉与光纤表面结合的c-Hcy 40-Cy 5.5：GATGCCTGTGAA-Cy5.5。

进一步，上述检测血清中甲基化半胱氨酸的方法，该方法是基于核酸适配体固定的倏逝波传感器利用了光纤表面对甲基化半胱氨酸的原位富集作用，以及核酸适配体对甲基化半胱氨酸的原位纯化作用，基于样品中靶标和荧光标记的互补DNA链与核酸适配体的竞争结合关系，实现对甲基化半胱氨酸的检测，还包括如下光纤制备步骤：通过光纤表面的羟基化、硅烷化、醛基化、偶联核酸适配体、还原步骤进行光纤制备，测试前，用浓度为1％(w/v)的吐温80对光纤进行封闭。

进一步，上述检测血清中甲基化半胱氨酸的方法中，光纤制备步骤如下：

首先，通过以下步骤进行光纤界面修饰：

步骤1、羟基化：用超声波清洗仪清洗光纤后，将光纤置于食人鱼溶液H

步骤2、硅烷化：将光纤置于2％(v/v)3-氨丙基三乙氧基硅烷的甲苯溶液中，室温反应1小时后，用无水甲苯清洗光纤并用空气泵吹干，放入烘箱，180℃烘干1小时；

步骤3、醛基化：将光纤置于2％(v/v)戊二醛-水溶液中，室温反应3小时后，用超纯水清洗；

随后，将光纤浸入氨基修饰的甲基化半胱氨酸的核酸适配体溶液NH

为了实现对血清中游离Hcy浓度的高灵敏和高特异性检测，我们将合作单位军事医学科学院筛选出的游离Hcy的DNA核酸适配体进行截短，构建了基于核酸适配体固定的倏逝波光纤传感器。传感器对缓冲液中游离Hcy的检出限(S/N＝3)为8.4fM，对血清样本中的检出限(S/N＝3)为0.20nM。对游离Hcy具有极高的特异性，比Hcy浓度高10万倍的人血清白蛋白及各种氨基酸(甲硫氨酸、组氨酸、精氨酸、半胱氨酸)未见交叉响应。对血清中Hcy的检测仅需要1微升血清，稀释后直接进行检测，检测时间5分钟，且传感器具有良好的界面再生性能，可以重复使用20次以上。各项性能均显著优于酶循环法，具有极好临床应用价值。

另外，为了与常规的倏逝波传感器进行对比，本发明还构建了基于Hcy靶标固定的倏逝波传感器。该传感器在缓冲液中的检出限(S/N＝3)为9.3pM，在血清样本中的检出限(S/N＝3)为206nM。传感器对Hcy的选择性是其它干扰物(人血清白蛋白、半胱氨酸Cys)的100倍。检测灵敏度和特异性均优于文献报道的基于核酸适配体的生物传感器，但远差于上述基于核酸适配体固定的倏逝波传感器。

本发明方法具有如下优势：

1)对病人血清样本进行检测时，本发明方法所检测到的游离Hcy浓度均为酶循环法测得的总Hcy浓度的1.36％，线性相关系数为0.9893。因此本发明方法通过检测血清中游离Hcy的浓度xμM，按照公式y＝73.5x+0.919,就可以计算出血清中Hcy总量yμM。避免了酶循环法需要多种检测试剂、样品需要还原、检测结果受内源性物质干扰大的问题。

2)本发明中构建的两种用于游离Hcy检测的倏逝波光纤核酸适配体传感器，均能够实现对血清中游离Hcy的高灵敏、高特异性检测。其中基于靶标固定的倏逝波光纤核酸适配体传感器，对血清中的Hcy检测时，检出限为206nM，比文献报道的基于核酸适配体的Hcy比色和电化学传感器分别低25和10倍(RSC Adv.,2013,3,24415–24422；Bioelectrochemistry,2020,134,107497)。其中基于核酸适配体固定的倏逝波光纤核酸适配体传感器，对血清中的Hcy检测时，检出限为0.20nM，比文献报道的基于核酸适配体的Hcy比色和电化学传感器分别低25000和10000倍。是目前唯一灵敏度达到临床检测血清中Hcy需求的核酸适配体传感器。

3)本发明中构建的Hcy倏逝波光纤核酸适配体传感器，检测的动力学区间比酶循环法(一般仅为2个数量级)宽，对于Hcy含量高的样品无需进行样品稀释和二次检测。

4)本发明中构建的Hcy倏逝波光纤核酸适配体传感器，具有操作过程简单、样品前处理极为简单(仅需进行样品稀释)的优点。

5)本发明中构建的Hcy倏逝波光纤核酸适配体传感器，检测时间短，仅需5分钟。

6)本发明中构建的Hcy倏逝波光纤核酸适配体传感器，一根光纤可以重复使用23次，检测成本远低于现有检测方法。

附图说明

图1是酶循环法检测Hcy的原理图。

图2是基于靶标固定的Hcy倏逝波光纤传感器的构建与检测原理图，其中图2中的Signal off为信号关，Time为时间。

图3是利用倏逝波传感器测试Hcy核酸适配体的解离常数(K

图4是基于靶标固定的倏逝波光纤传感器检测Hcy的工作曲线图。

图5是基于靶标固定的倏逝波光纤传感器的靶标特异性检测结果图。

图6是基于靶标固定的倏逝波光纤传感器进行血清中标准添加的Hcy检测的工作曲线图。

图7是基于核酸适配体固定的Hcy倏逝波光纤传感器的构建与检测原理图，其中图7中的Signal off为信号关，Time为时间。

图8是基于核酸适配体固定的倏逝波光纤传感器检测Hcy的工作曲线图。

图9基于核酸适配体固定的倏逝波光纤传感器的靶标特异性检测结果图。

图10是基于核酸适配体固定的倏逝波光纤传感器的界面再生能力测试结果图。

图11是基于核酸适配体固定的倏逝波光纤传感器进行血清中标准添加的Hcy检测的工作曲线图。

图12是病人血清中游离Hcy浓度与总Hcy浓度的对照图，其中游离Hcy利用核酸适配体固定的倏逝波光纤传感器检测,总Hcy由北京市安贞医院通过酶循环法检测得到。

具体实施方式

本发明的总体技术方案是提供一种检测血清中甲基化半胱氨酸的方法，该方法是通过检测血清样本中游离甲基化半胱氨酸的浓度，根据游离甲基化半胱氨酸的浓度和总甲基化半胱氨酸浓度呈线性正相关性，由此计算出血清中甲基化半胱氨酸总量。

将测试得到的阳性样本相对阴性样本的荧光信号下降百分比代入标准曲线中的拟合方程y＝10.29x+96.5，R

检测血清样本中游离甲基化半胱氨酸的浓度的步骤如下：缓冲液A为50mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、100mM氯化钠、1mM氯化镁、20mM氯化钾、1mM氯化钙，pH 7.4，仅用缓冲液A将血清样本稀释1万倍即可，无需血清样本前处理，然后将其与20nM的荧光基团Cy 5.5标记的甲基化半胱氨酸核酸适配体的互补链c-Hcy 40-Cy 5.5：GATGCCTGTGAA-Cy5.5混合、孵育后，经过以下三个步骤将混合物引入倏逝波光纤传感系统。步骤1：泵入缓冲液A 30秒清洗进样管道和光纤反应池，保证基线平稳；步骤2：将血清样本和c-Hcy 40-Cy5.5：GATGCCTGTGAA-Cy5.5的混合物泵入光纤反应池，耗时20秒，并保持180秒，实时测定荧光信号；步骤3：通入洗涤缓冲液0.5％SDS,pH 1.9冲洗30秒，冲洗掉与光纤表面结合的c-Hcy40-Cy 5.5：GATGCCTGTGAA-Cy5.5。

上述检测血清中甲基化半胱氨酸的方法是基于核酸适配体固定的倏逝波传感器利用了光纤表面对甲基化半胱氨酸的原位富集作用，以及核酸适配体对甲基化半胱氨酸的原位纯化作用，基于样品中靶标和荧光标记的互补DNA链与核酸适配体的竞争结合关系，实现对甲基化半胱氨酸的检测，还包括如下光纤制备步骤：通过光纤表面的羟基化、硅烷化、醛基化、偶联核酸适配体、还原步骤进行光纤制备，测试前，用浓度为1％(w/v)的吐温80对光纤进行封闭。

光纤制备步骤如下：

首先，通过以下步骤进行光纤界面修饰：

步骤1、羟基化：用超声波清洗仪清洗光纤后，将光纤置于食人鱼溶液H

步骤2、硅烷化：将光纤置于2％(v/v)3-氨丙基三乙氧基硅烷的甲苯溶液中，室温反应1小时后，用无水甲苯清洗光纤并用空气泵吹干，放入烘箱，180℃烘干1小时；

步骤3、醛基化：将光纤置于2％(v/v)戊二醛-水溶液中，室温反应3小时后，用超纯水清洗；

随后，将光纤浸入氨基修饰的甲基化半胱氨酸的核酸适配体溶液NH

表1本发明所使用的DNA探针

Cy5.5:荧光基团

以下实施例中所有测试，均在缓冲液A(50mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、100mM氯化钠、1mM氯化镁、20mM氯化钾、1mM氯化钙，pH 7.4)中进行。

实施例1.利用基于靶标固定的倏逝波传感器测定Hcy核酸适配体的解离常数(K

首先，通过以下步骤进行光纤界面修饰(修饰步骤及原理如图2所示)：

1、羟基化：用超声波清洗仪清洗光纤后，将光纤置于食人鱼溶液(H

2、硅烷化：将光纤置于2％(v/v)3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTS)的甲苯溶液中，室温反应1小时后，用无水甲苯清洗光纤并用空气泵吹干，放入烘箱，180℃烘干1小时；

3、醛基化：将光纤置于2％(v/v)戊二醛-水溶液中，室温反应3小时后，用超纯水清洗；

4、偶联靶标：将光纤置于Hcy水溶液(1μM)中，室温反应6小时后；用超纯水清洗；

5、还原：将光纤置于3％(m/v)硼氢化钠水溶液中，室温反应0.5小时后；用超纯水清洗；制得的光纤置于低温(4℃)储存。

然后，在缓冲液A中分别配置浓度为0.1、1、10、50、100、200、500nM(纳摩尔每升)的荧光基团Cy5.5修饰的Hcy核酸适配体溶液(Hcy 88-Cy 5.5，见表1)。经过以下两个步骤将不同浓度的Hcy 88-Cy5.5溶液依次引入倏逝波光纤传感系统，实现对K

实施例2.利用基于靶标固定的倏逝波光纤核酸适配体传感器进行游离Hcy的超灵敏、高特异性检测

光纤制备流程与实施例1相同，通过光纤表面的羟基化、硅烷化、醛基化、偶联Hcy、还原等步骤将Hcy偶联在光纤表面。在缓冲液A中配置不同终浓度的Hcy标准溶液(10pM、100pM、1nM、10nM、100nM、1μM)。然后将Hcy标准溶液分别与20nM的荧光基团Cy 5.5标记的Hcy核酸适配体(Hcy 88-Cy 5.5，见表1)混合、孵育。然后，经过以下三个步骤将混合物引入倏逝波光纤传感系统。(1)泵入缓冲液30秒清洗进样管道和光纤反应池，保证基线平稳；(2)将靶标和Hcy 88-Cy 5.5的混合物泵入光纤反应池(耗时20秒)并保持180秒，实时测定荧光信号；(3)通入洗涤缓冲液(0.5％十二烷基磺酸钠(SDS),pH 1.9)冲洗30秒，冲洗掉与光纤表面结合的Hcy 88-Cy5.5。重复(1)-(3)，其中(2)中的靶标浓度依次升高。

进行特异性测试时，用100nM的各种其它靶标(人血清白蛋白HSA、半胱氨酸Cys)代替上述步骤中的Hcy，其它测试步骤同上。

对血清样本中加标Hcy进行测试时，无需样品前处理，只需在血清中加入不同浓度的Hcy混匀，其终浓度分别为100nM、1μM、10μM、100μM、1mM、10mM、100mM。然后，在缓冲液中将加标后的血清样本稀释1万倍，再将其与20nM的Hcy 88-Cy 5.5混合，检测步骤与上述缓冲液中Hcy的检测相同。

结果表明，工作曲线的测试结果如图4所示。利用基于靶标固定的倏逝波光纤核酸适配体传感器，进行缓冲液中游离Hcy的检测时，按照3倍信噪比得出的检出限(LOD)为9.3pM，半对数线性动力学区间为10pM到1μM(y＝12.8*x+155.1,R

对血清中标准添加的Hcy的检测结果如图6所示。检出限LOD为205.7nM(已换算为100％血清中的浓度)，半对数线性动力学区间为1μM到100μM(y＝13.6*x+97，R

实施例3.利用基于核酸适配体固定的倏逝波光纤核酸适配体传感器进行Hcy的超灵敏、高特异性检测及传感器再生性能测试

基于核酸适配体固定的超灵敏倏逝波传感器利用了光纤表面对Hcy的原位富集作用，以及核酸适配体对Hcy的原位纯化作用。基于样品中靶标和荧光标记的互补DNA链与核酸适配体的竞争结合关系，实现对Hcy的超灵敏检测(图7)。如图7所示，光纤的表面羟基化、硅烷化、醛基化修饰步骤与实施例1相同。随后，将光纤浸入氨基修饰的Hcy的核酸适配体溶液(NH

在缓冲液A中配置不同终浓度的Hcy标准溶液(1fM、10fM、100fM、1pM、10pM、100pM、1nM、10nM)。然后将Hcy标准溶液分别与20nM的荧光基团Cy 5.5标记的Hcy核酸适配体的互补链(c-Hcy 40-Cy 5.5，表1)混合。经过以下三个步骤将混合物引入倏逝波光纤传感系统。(1)泵入缓冲液A 30秒清洗进样管道和光纤反应池，保证基线平稳；(2)将靶标和c-Hcy 40-Cy 5.5的混合物泵入光纤反应池(耗时20秒)并保持180秒，实时测定荧光信号；(3)通入洗涤缓冲液(0.5％SDS,pH 1.9)冲洗30秒，冲洗掉与光纤表面结合的c-Hcy 40-Cy 5.5。重复(1)-(3)，其中(2)中的靶标浓度依次升高。

进行特异性测试时，用100nM的各种其它靶标(人血清白蛋白HSA、甲硫氨酸Met、组氨酸His、精氨酸Arg、半胱氨酸Cys)代替上述步骤中的Hcy，其它测试步骤同上。进行传感器再生性能测试时，循环测试只含20nM的c-Hcy 40-Cy 5.5的空白样品以及添加了100nM Hcy后的样品，测试步骤同上。

对血清样本中加标Hcy进行测试时，无需样品前处理，只需在血清中加入不同浓度的Hcy混匀，其终浓度分别为10pM，100pM，1nM，10nM，100nM，1μM，10μM，100μM。然后，在缓冲液中将加标后的血清样本稀释1万倍，再将其与20nM的c-Hcy 40-Cy 5.5混合，检测步骤与缓冲液中Hcy的检测相同。

结果表明，工作曲线的测试结果如图8所示。利用基于核酸适配体固定的倏逝波光纤传感器，对缓冲液中Hcy进行检测时，按照3倍信噪比得出的检出限为8.4fM，半对数线性动力学区间为10fM到1nM(y＝10.34x+151.7,R

特异性测试结果如图9所示，1pM的Hcy的信号响应，高于100nM的其它氨基酸、蛋白，表明该传感器具有极高的靶标特异性(>100000倍)。传感器的再生性能测试结果如图10所示。传感器可进行23次“开关性”检测，空白样品(不含Hcy)和阳性样品(含100nM Hcy)的信号响应均未发生显著变化(±5％以内)。第24-30次测试时，空白信号和样品信号均出现较大幅度下降。说明在未进行系统矫正的情况下，该传感器至少可以重复使用23次。

对血清中标准添加的Hcy的检测结果如图11所示，检出限为0.20nM(已换算为100％血清中的浓度)，半对数线性动力学区间分别为10pM到10nM(y＝4.69x+50.12,R

实施例4.利用基于核酸适配体固定的倏逝波光纤核酸适配体传感器进行真实病人血清样本中游离Hcy的检测

光纤制备步骤与实施例3相同，通过光纤表面的羟基化、硅烷化、醛基化、偶联核酸适配体、还原步骤进行制备。测试前，用浓度为1％(w/v)的吐温80对光纤进行封闭。

用缓冲液A将病人血清样本稀释1万倍，然后将其与20nM的荧光基团Cy 5.5标记的Hcy核酸适配体的互补链(c-Hcy 40-Cy 5.5，表1)混合、孵育后，检测步骤与实施例3相同。将测试得到的阳性样本相对阴性样本的荧光信号下降百分比代入标准曲线中的拟合方程(y＝10.29x+96.5，R

以上实施例只为说明本发明的技术构思和特点，目的在于让本领域的技术人员了解本发明的内容并加以实施，并不能以此来限制本发明的保护范围，凡是根据本发明实质所作出的等效变化或修饰均属于本发明的保护范围。