一种苹果果实大小基因功能的快速验证方法

技术领域

本发明涉及一种苹果基因功能的验证方法，具体涉及一种苹果果实大小基因功能的快速验证方法。

背景技术

我国是世界苹果栽培的起源中心，苹果种质资源丰富、栽培地域广泛，栽培面积和产量多年来始终位居世界第一位，年产量占世界总年产量的比重高达40%。解析苹果种质的遗传及其分子机理，利用分子生物学的技术方法，调控果实大小发育，提高苹果产量，需要对不同品种苹果的基因功能进行广泛深入的研究。然而，由于苹果为多年生作物，实生苗生长童期较长，播种后一般需要6～8年方可见果，因而，要通过苹果果实获取基因功能的表达特征、验证基因功能至少需要7～9年培育周期，如此漫长的试验周期严重制约了苹果性状基因功能的施行。目前，苹果中的基因功能验证，主要针对叶片或者植株等营养器官，而对于花果等生殖器官的验证则鲜有报道。传统的转基因功能验证的方法包括候选基因的克隆、转化农杆菌、菌液与叶片共培养、抗性培养基筛选稳定的转基因植株及qRT-PCR验证转基因效果等诸多步骤，操作过程复杂，验证成本偏高，试验周期仍然较长；而且，苹果品种还存在获得稳定的转基因体系及植株比较困难等问题，苹果果实大小性状的基因功能验证，获取准确的基因功能产生了不利影响，给苹果基因功能验证科学研究带来了极大的困扰，已经成为制约苹果果实科学研究的限制性因素。因此，有必要研究开发一种验证苹果果实大小性状的方法，通过瞬时基因表达特征快速验证候选基因功能，简化验证过程，缩短验证周期，降低验证成本，提高验证效率。

发明内容

本发明的目的是提供一种苹果果实大小基因功能的快速验证方法，缩短验证周期，提高验证效率。

一种苹果果实大小基因功能的快速验证方法，包括以下步骤：

步骤1、候选基因的克隆

设计拟验证候选基因的全长引物，扩增序列全长，连接T载体测序，将获得的所述候选基因序列与参考序列进行比较，明确所述候选基因的实际序列，初步分析所述候选基因可能的功能及其与果实大小差异的相关性以及负向或者正向表达及调节特性。

步骤2、候选基因的沉默或者过表达载体的构建

确定验证试验载体，根据所述候选基因所具有的负向或者正向表达及调节特性的差异，选择构建步骤1克隆候选基因的沉默或者过表达载体，然后，将构建好的所述候选基因沉默或者过表达载体转化到农杆菌中，经悬浮处理，制备载有所述候选基因的农杆菌验证菌液，同时预留未载有所述候选基因的农杆菌空载菌液备用。其中：

当所述验证试验载体选择为小果实样本，所述候选基因为负向表达及调节特性，或者所述验证试验载体选择为大果实样本，而所述候选基因为正向表达及调节特性时，构建所述候选基因的沉默载体；

当所述验证试验载体选择为小果实样本，所述候选基因为正向表达及调节特性，或者所述验证试验载体选择为大果实样本，而所述候选基因为负向表达及调节特性时，则构建所述候选基因的过表达载体。

步骤3、候选基因的侵染

针对选定的所述验证试验载体，在苹果果实生长的细胞增大起始期，分别选择数量相同、大小对应相近的苹果果实样本划分为试验组和对照组，采用外部注射侵染方式，将步骤2制备的所述农杆菌验证菌液和预留的所述农杆菌空载菌液分别注射进入所述试验组和所述对照组的苹果果实样本之中，注射操作要保持匀速稳定，当果实四周表皮有液体渗出时，表明所述农杆菌验证菌液和所述农杆菌空载菌液已在苹果果实样本中分布均匀，停止注射，完成侵染操作。

完成上述侵染操作后，再经过15～30天的生长，分组采摘试验组和对照组苹果果实样本备用。

步骤4、苹果果实样本的表型分析

取步骤3采摘的试验组和对照组各所述苹果果实样本，分别测量各所述苹果果实样本的横径、纵径大小，称量单体重量，对获取数据进行统计学分析后，分别计算获得所述苹果果实样本的试验组平均横径D

步骤5、苹果果实样本的基因鉴定

将步骤3采摘的试验组和对照组各所述苹果果实进行液氮迅速冷冻制备冷冻样本，提取各所述苹果果实的总RNA并分别将其分步转变为cDNA，然后，检测所述候选基因在各所述苹果果实样本cDNA中的表达量，对检测数据进行统计学分析后，分别计算获得所述苹果果实样本的试验组候选基因平均表达量N

步骤6、候选基因的验证分析

分别将步骤4获得的所述苹果果实样本试验组平均横径D

在选择小果实样本为验证试验载体验证负向表达及调节基因时，当所述试验组平均横径D

在选择大果实样本为验证试验载体验证负向表达及调节基因时，当所述试验组平均横径D

在选择小果实样本为验证试验载体验证正向表达及调节基因时，当所述试验组平均横径D

在选择大果实样本为验证试验载体验证正向表达及调节基因时，当所述试验组平均横径D

所述一种苹果果实大小基因功能的快速验证方法，其中：

在步骤1中，优选所述候选基因的全长引物一次性设计1～2对，从中挑选扩增效率高的引物进行扩增，筛选基因；

在步骤2中，在将所述沉默载体转化到农杆菌中后，优选利用通用引物进行PCR扩增，筛选阳性菌株，摇菌培养所述候选基因的农杆菌菌液。

在步骤3中，对所述苹果果实样本进行外部注射侵染的时期优选为盛花后30～36天期间。

在步骤3中，进一步，优选硬度适中、距离果心较远的苹果果实胴部作为注射部位，以该部位为注射区域不会因伤害果实关键结构而引起苹果果实的激素水平发生变化，对验证结果产生影响。

在步骤3中，更进一步，针对所述苹果果实的注射优选使用1毫升注射器注射针头，所述注射针头插入所述苹果果实的深度为0.7～1厘米，注射速度保持0.05～0.15毫升/秒匀速注入。

本发明的有益效果是，提供一种苹果果实大小的基因功能快速验证方法。该方法采用瞬时功能验证技术，在目标样本苹果果实发育特定时期，以注射方式直接向苹果果实中侵染候选基因，通过农杆菌在果实发育的关键时期直接侵染目标部位，达到快速表达验证基因功能的目的，解决了现有技术中苹果童期长果实基因功能验证周期长，操作过程复杂，验证成本偏高的问题，使苹果果实基因功能验证周期由7～9年缩减至1年以内，满足了当前苹果等多年生作物科研生产领域对果实基因功能验证快速高效的要求，同时，还能够简化验证过程，低验证成本，提高验证效率。

附图说明

图1、“龙丰”和“大果龙丰”苹果注射侵染生长25天后试验组与对照组样本果实表型对照图。

图2、“龙丰”和“大果龙丰”苹果注射侵染生长25天后试验组与对照组样MdAux/IAAa基因表达量对照图。

具体实施方式

下面结合具体实施案例对本发明请求保护的技术方案作进一步的描述。

实施例1

针对定植于黑龙江省宁安市的“龙丰”苹果及以“龙丰”大果型芽变培育的“大果龙丰”苹果之间果实存在的差异，以“龙丰”苹果为验证试验载体，对二者之间可能存在的苹果果实大小相关基因进行功能瞬时验证，具体采取以下步骤：

步骤1、候选基因的确定

利用CTAB法，分别提取所述“龙丰”和所述“大果龙丰”果实中的总RNA，RNA提取要保证28S和18S半定量检测清晰可见，并且保证28S带是18S带粗度的2倍，然后，利用反转试剂盒将RNA经两步分别转变为cDNA，再利用内参基因MdActin、MdActin-F和MdActin-R作为引物分别对所述cDNA进行PCR检测，保证cDNA的浓度一致，经转录组测序可见二者之间MdAux/IAAa基因存在差异表达，进一步采用primer premier 6设计MdAux/IAAa基因的表达引物，经qRT-PCR鉴定显示所述“大果龙丰”苹果中的MdAux/IAAa基因的转录水平低于所述“龙丰”苹果，初步判断所述MdAux/IAAa基因可能为具有苹果果实大小控制功能的负向表达及调节基因，确定所述MdAux/IAAa基因为验证候选基因。

步骤2、候选基因的克隆

利用primer premier 6设计候选基因MdAux/IAAa全长引物，利用常规PCR法扩增序列全长，连接T载体委托生工生物工程（上海）股份有限公司测序，利用Sequencher软件将获得的序列与参考基因组中MdAux/IAAa进行序列比对，明确步骤1确定所述候选基因MdAux/IAAa的基因序列，发现MdAux/IAAa基因与器官大小相关的基因亲缘关系较近，推测候选基因MdAux/IAAa可能与果实大小差异有关。

步骤3、候选基因MdAux/IAAa沉默载体的构建

由于所述候选基因MdAux/IAAa为负向表达及调节基因，选择将步骤2克隆的所述MdAux/IAAa基因连接pRI101（35S启动子驱动）载体，构建所述候选基因MdAux/IAAa的沉默载体，进一步，将所述沉默载体转化到农杆菌中，利用通用引物进行PCR扩增，筛选阳性菌株，摇菌培养所述候选基因MdAux/IAAa的农杆菌菌液，经悬浮处理，制备载有所述MdAux/IAAa基因的农杆菌验证菌液，同时预留不载有所述MdAux/IAAa基因的农杆菌空载菌液备用。

步骤4、候选基因MdAux/IAAa的侵染

在所述验证试验载体“龙丰”苹果生长盛花后30天，分别选择各10个大小对应相近的苹果果实样本组成试验组和对照组，采用外部注射的方式，向试验组10个所述苹果果实样本中注射步骤3制备的所述农杆菌验证菌液，向对照组10个所述苹果果实样本中注射步骤3预留的所述农杆菌空载菌液，注射操作使用1 毫升注射器，注射部位为苹果果实样本的胴部，针头垂直扎入果实，插入深度控制为0.8厘米，保持0.1毫升/秒速度匀速注入，以保证菌液渗透效果，防止伤害果肉细胞组织，注射过程中观察苹果果实四周表皮有液体渗出时，表明所述农杆菌验证菌液和所述农杆菌空载菌液已在苹果果实样本中分布均匀，停止注射，完成侵染操作。

完成上述侵染操作后再经过25天生长，分组采摘试验组和对照组苹果果实样本备用。

步骤5、苹果果实样本的表型分析

取步骤4采摘的试验组和对照组所述苹果果实样本，使用数显游标卡尺分别依次测量各所述苹果果实样本的横径、纵径大小，利用电子天秤称量所述苹果果实样本的单体重量，采用SPSS软件对获取的两组数据进行统计学分析，结果显示P﹤0.01，数据差异具有显著的统计学意义，如图1所示，经数据统计计算，所述苹果果实样本的试验组平均横径D

步骤6、苹果果实样本的基因鉴定

将步骤4采摘的试验组和对照组各所述苹果果实切片进行液氮迅速冷冻，制备冷冻样本，采用CTAB法提取各所述苹果果实的总RNA，利用反转录试剂盒将所述总RNA分步转变为cDNA，然后，利用qRT-PCR检测所述候选基因MdAux/IAAa在各所述苹果果实样本cDNA中的表达量，采用SPSS软件对获取的两组数据进行统计学分析，结果显示P﹤0.01，数据差异具有显著的统计学意义，如图2所示，分别计算获得所述苹果果实样本的试验组候选基因平均表达量N

步骤7、候选基因的验证分析

由于“龙丰”苹果为小果实样本验证试验载体，而所述候选基因MdAux/IAAa为负向表达及调节基因，对比步骤5得出的实验组和对照组所述苹果果实样本表型分析数据可见，所述试验组平均横径D

实施例2

针对定植于黑龙江省宁安市的“龙丰”苹果及以“龙丰”大果型芽变培育的“大果龙丰”苹果之间果实存在的差异，以“大果龙丰”苹果为验证试验载体，对二者之间可能存在的苹果果实大小相关基因进行功能瞬时验证，具体采取以下步骤：

步骤1和步骤2分别采用与实施例1完全相同的操作方法确定并克隆候选基因MdAux/IAAa。

步骤3、候选基因MdAux/IAAa过表达载体的构建

由于所述候选基因MdAux/IAAa为负向表达及调节基因，选择将步骤2克隆的所述MdAux/IAAa基因连接pRI101（35S启动子驱动）载体，构建所述候选基因MdAux/IAAa的过表达载体，进一步，将所述过表达载体转化到农杆菌中，利用通用引物进行PCR扩增，筛选阳性菌株，摇菌培养所述候选基因MdAux/IAAa的农杆菌菌液，经悬浮处理，制备载有所述MdAux/IAAa基因的农杆菌验证菌液，同时预留不载有所述MdAux/IAAa基因的农杆菌空载菌液备用。

步骤4、候选基因MdAux/IAAa的侵染

在所述验证试验载体“大果龙丰”苹果生长盛花后30天，分别选择各10个大小对应相近的苹果果实样本组成试验组和对照组，采用外部注射的方式，向试验组10个所述苹果果实样本中注射步骤3制备的所述农杆菌验证菌液，向对照组10个所述苹果果实样本中注射步骤3预留的所述农杆菌空载菌液，注射操作使用1毫升注射器，注射部位为苹果果实样本的胴部，针头垂直扎入果实，插入深度控制为0.8厘米，保持0.1毫升/秒速度匀速注入，以保证菌液渗透效果，防止伤害果肉细胞组织，注射过程中观察苹果果实四周表皮有液体渗出时，表明所述农杆菌验证菌液和所述农杆菌空载菌液已在苹果果实样本中分布均匀，停止注射，完成侵染操作。

完成上述侵染操作后再经过25天生长，分组采摘试验组和对照组苹果果实样本备用。

步骤5、苹果果实样本的表型分析

采用与实施例1相同的操作方法对试验组和对照组所述苹果果实样本进行表型分析，如图1所示，经数据统计计算，所述苹果果实样本的试验组平均横径D

步骤6、苹果果实样本的基因鉴定

采用与实施例1相同的操作方法对试验组和对照组所述苹果果实样本进行基因鉴定，如图2所示，分别计算获得所述苹果果实样本的试验组候选基因平均表达量N

步骤7、候选基因的验证分析

由于“大果龙丰”苹果为大果实样本验证试验载体，而所述候选基因MdAux/IAAa为负向表达及调节基因，对比步骤5得出的实验组和对照组所述苹果果实样本表型分析数据可见，所述试验组平均横径D

实施例3

以“龙丰”苹果为验证试验载体，开展不同苹果生长时期候选基因MdAux/IAAa侵染效果的对比试验。

在苹果果实生长的细胞增大起始期中，分别选择盛花后30天、盛花后51天、盛花后72天和盛花后93天为注射试验期，每个所述注射试验期内分别选取10个苹果果实样本，采用与实施例1步骤4相同的注射方式，对选择的所述苹果果实样本分别进行侵染注射，注射2小时后检测所述苹果果实样本的完整性和农杆菌分布情况，检测数据统计情况参见表1。

试验结果表明，在盛花期后的51、72、93天注射农杆菌，由于果实硬度较高，一方面各苹果果实样本的可注射农杆菌菌液量较小，另一方面也不易于侵染菌液的渗入和有效扩散，数据显示，所述侵染时期内注射侵染农杆菌菌液，样本的平均侵染比例最高只能达到果实体积的40%，不能满足基因功能验证试验的要求；而且，还由于果实脆性较大，农杆菌菌液的少量注入即可因内部应力变化导致产生裂果现象，影响果实的进一步生长，使基因功能验证试验无法继续进行。

同时，本实施例试验充分证实，在盛花后30天，果实硬度相对于前期和后期软硬适度，脆性适中，该时期内进行农杆菌菌液的注射侵染机械阻力适中，果裂倾向性低，菌液渗透性好，在不移动针头情况下即可较为均匀地分布渗透到整个果实，本实施例试验中，该时期注射侵染苹果果实样本没有发生果实样本的开裂情况，而果实样本的平均侵染率也达到了100%，盛花后30天是对所述苹果果实样本进行注射侵染的最佳时期，也是实现本发明技术方案的一个关键技术环节。