人参糖基转移酶在合成甜菊糖中的应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及人参糖基转移酶在合成甜菊糖中的应用。

背景技术

甜菊糖苷作为提取自菊科多年生草本植物甜叶菊中的天然甜味剂，具有来源天然、甜度高、热量低、生理特性安全良好、稳定性高等优点。研究表明，甜菊糖苷在抗高血压、抗糖尿病、防治龋齿、抗肿瘤等方面均有应用潜力，因此其作为甜味剂应用于食品和饮料中受到广泛关注。目前甜菊糖苷已在欧盟和美国被批准作为食品添加剂使用。

目前，甜叶菊中已分离鉴定出超过35种甜菊糖苷，但大部分都具有后苦味和甘草异味，限制了甜菊糖苷作为食品添加剂的应用，寻求甜味更高口味更佳的甜菊糖是目前研究的热点。甜菊糖苷中的甜味成分，均含有相同的甜菊醇苷元结构，不同的甜味成分在甜菊醇苷元的C13羟基与C19羟基位置上结合的糖基种类与数量有所差异，甜叶菊中提取所得的主要甜菊糖苷成分的结构如式(I)所述，具体信息见表1：

表1甜叶菊中主要甜菊糖苷成分介绍

注：Glc表示葡萄糖基，Rha表示鼠李糖基。

甜菊醇苷元是甜菊糖苷特殊后苦涩味的来源，在其基础上，C13和C19羟基上结合的糖基个数及种类决定了其风味与甜度。

传统甜菊糖产品以甜叶菊提取为主要方法，主要以甜菊苷(ST)和莱鲍迪苷A(RA)作为主要成分。莱鲍迪苷E(RE)作为同样天然存在与甜菊糖中的莱鲍迪苷糖，其风味优于ST，但其在甜叶菊中干叶中的含量仅为约0.5％。而莱鲍迪苷D(RD)作为甜度更高，口味更优的甜菊糖苷成分，在甜叶菊干叶重仅为约0.3％。

甜菊糖苷葡糖基的结合依赖于糖基转移酶，植物来源的糖基转移酶具有较强的区域及对映体选择性，使自然界中许多的天然产物难以通过化学手段直接合成。目前研究发现的大部分糖基转移酶主要分为O-糖基转移酶及N-糖基转移酶，分别作用与羟基与氨基上。在甜菊糖苷合成过程中，ST与RA的C19羟基上结合一个葡糖基，以ST为底物生成RE及以RA为底物生成RD时，糖基转移酶需要在该葡糖基上通过1,2糖苷键进一步结合一个葡糖基。因此，目前在甜菊糖苷合成中可用于合成RD及RE的糖基转移酶种类较少。

专利申请CN202010447915.2中，报道了利用枯草芽孢杆菌发酵催化制备莱鲍迪苷A的方法，其中应用糖基转移酶UGT76G1催化ST合成RA。RA与RE为分别在C13和C19上添加葡糖基的同分异构体，其甜度性质不同，说明糖基转移酶具有特异性，不是所有的糖基转移酶均可实现ST合成RE及RA合成RD的过程。

专利申请CN201910095404.6中，报道了一种酶法合成莱鲍迪苷E的方法，其中通过番茄来源UDP-糖基转移酶与蔗糖合成酶联用，反应生产RE，该专利中RE的产率低于ST的转化率，说明其存在副产物。同一体系在专利CN20151013942.8中，显示该酶以RA为底物时，除了生成莱鲍迪苷D外，还会生成莱鲍迪苷M2。说明此糖基转移酶会同时将葡糖基转移至甜菊糖苷的C13及C19上的O-glc上，且形成的两种糖苷键种类不同，该酶专一性不强。

专利申请CN202010211656.3及CN20171087519.7中，分别提到两种糖基转移酶用于合成RD。其中CN202010211656.3中以ST为底物时，加入可合成RD的糖基转移酶时，产物中并未检测出RE。CN20171087519.7所提及的糖基转移酶，并未见RE合成的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于针对目前甜菊糖合成中糖基转移酶较少的不足，筛选人参来源的糖基转移酶PgUGT。实现其在大肠杆菌的异源表达，并发现其具有催化合成莱鲍迪苷E与莱鲍迪苷D的新功能，并具有较高的催化效率。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一方面，提供糖基转移酶在制备莱鲍迪苷D和/或莱鲍迪苷E中的应用，所述糖基转移酶的氨基酸序列为：

(a)SEQ ID NO.1；或

(b)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相比具有90％以上序列一致性的氨基酸序列，且具有(a)所限定的氨基酸序列所具有的功能。

本发明的第二方面，提供一种糖基转移酶的制备方法，包含以下步骤：

S1：构建表达权利要求1所述糖基转移酶的重组菌；

S2：将重组菌液按0.5～2％的接种量转接至发酵培养基中，培养至OD600为0.6～0.8，加入诱导剂培养。

在本发明的一些优选实施方式中，所述接种量为1％。

在本发明的一些实施方式中，所述培养条件为：14～20℃，180～250rpm条件下培养20～30h。

在本发明的一些优选实施方式中，所述培养条件为：16℃，200rpm条件下培养30h。

在本发明的一些实施方式中，所述诱导剂为IPTG。

在本发明的一些实施方式中，所述诱导剂的浓度为0.2～0.5mM。

在本发明的一些优选实施方式中，所述诱导剂的浓度为0.5mM。

在本发明的一些实施方式中，所述菌为大肠杆菌。

本发明的第六个方面，提供一种制备莱鲍迪苷D和/或莱鲍迪苷E的方法，以甜菊苷和/或莱鲍迪苷A为底物，通过本发明第一方面所述糖基转移酶催化合成莱鲍迪苷D和/或莱鲍迪苷E。

在本发明的一些实施方式中，所述甜菊苷为底物催化合成莱鲍迪苷E；所述莱鲍迪苷A为底物催化合成莱鲍迪苷D。

在本发明的一些实施方式中，所述催化的条件为pH为6.5～9.5，温度为30～45℃，200～300rpm条件下反应30min～24h。

在本发明的一些优选实施方式中，所述催化的条件为pH为8.0，温度为40℃，250rpm条件下反应12h。

在本发明的一些实施方式中，当甜菊糖苷底物为甜菊苷时，所述糖基转移酶与甜菊苷的比例为20～800U/mM甜菊苷。

在本发明的一些实施方式中，当甜菊糖苷底物为甜菊苷时，所述糖基转移酶与甜菊苷的比例为200～400U/mM甜菊苷。

在本发明的一些优选实施方式中，当甜菊糖苷底物为甜菊苷时，所述糖基转移酶与甜菊苷的比例为300U/mM甜菊苷。

在本发明的一些实施方式中，当甜菊糖苷底物为莱鲍迪苷A时，所述糖基转移酶与莱鲍迪苷A的比例为15～700U/mM莱鲍迪苷A。

在本发明的一些实施方式中，当甜菊糖苷底物为莱鲍迪苷A时，所述糖基转移酶与莱鲍迪苷A的比例为150～350U/mM莱鲍迪苷A。

在本发明的一些优选实施方式中，当甜菊糖苷底物为莱鲍迪苷A时，所述糖基转移酶与莱鲍迪苷A的比例为250U/mM莱鲍迪苷A。

在本发明的一些实施方式中，所述底物浓度为0.1～20mM；糖基转移酶用量为200～6000U/L。

在本发明的一些实施方式中，所述催化反应的反应体系中还包含糖基供体。

在本发明的一些实施方式中，所述催化反应的反应体系包含：0.1～20mM底物，0.1～20mM糖基供体，1.5～6000U/L糖基转移酶。

在本发明的一些优选实施中，所述催化反应的反应体系包含：3mM底物，3mM糖基供体，1100U/L糖基转移酶。

在本发明的一些实施方式中，所述糖基供体为UDPG。

本发明的有益效果是：

本发明提供了一种人参来源的糖基转移酶在制备甜菊糖，特别是制备莱鲍迪苷D和/或莱鲍迪苷E中的应用。本发明提供的人参来源的糖基转移酶PgUGT具有催化合成莱鲍迪苷E与莱鲍迪苷D的新功能，通过酶法可催化合成获得大量的莱鲍迪苷E与莱鲍迪苷D，产率达到97.2％以上，转化率高，进一步降低成本，操作简便，适合大规模推广和工业化实施。而且本发明利用基因工程获得可以高产表达人参来源糖基转移酶，得到适合产业化的廉价易得的高活性生物酶。

附图说明

图1为表达PgUGT的大肠杆菌构建过程的PCR鉴定图。其中M为标准DNA markerDS5000；1为pET30a-PgUGT质粒PCR图谱；2、3、4为BL21(DE3)/PgUGT菌落PCR鉴定图。

图2为大肠杆菌表达PgUGT的SDS-PAGE图谱。其中M为标准蛋白质分子量；1为重组大肠杆菌BL21(DE3)/PgUGT破碎液；2为破碎的蛋白镍柱穿过液；3为纯化的重组PgUGT。

图3为实施例5中液相检测结果。其中图3(A)为以RA为底物的反应液的峰图；图3(B)为标准样品RD的峰图；图3(C)为以RA为底物，利用PgUGT纯化蛋白催化后的反应液峰图。

图4为实施例6中液相检测结果。其中图4(A)为以ST为底物的反应液的峰图；图4(B)为标准样品RE的峰图；图4(C)为以ST为底物，利用PgUGT纯化蛋白催化后的反应液峰图。

图5为温度对PgUGT合成甜菊糖的影响。

图6为pH对PgUGT合成甜菊糖的影响。

图7为PgUGT酶法合成RD的液相色谱图。

图8为PgUGT酶法合成RE的液相色谱图。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

实施例1表达PgUGT基因重组大肠杆菌的构建

1)合成大肠杆菌密码子优化的糖基转移酶PgUGT基因，将该基因通过分子生物学方法连接至pET30a，并转化到大肠杆菌Top10感受态中，涂布于LB卡那平板(50μg/mLkanamycin)中，对转化子进行菌落PCR鉴定，并提取质粒进行测序验证，结果表明构建获得pET30a-PgUGT质粒。

其中糖基转移酶的核苷酸序列为：ATGGATAATCAGAATGGTCGTATTTCAATTGCCCTGTTACCGTTTCTGGCACATGGCCATATTTCACCGTTTTTTGAATTAGCCAAACAGTTAGCCAAACGTAATTGTAATGTGTTTCTGTGTAGTACCCCGATTAATCTGTCAAGCATTAAAGATAAAGATAGCTCAGCCTCTATTAAACTGGTGGAACTGCATCTGCCGAGTAGTCCGGATCTGCCGCCGCATTATCATACCACCAATGGCTTACCCTCCCATCTGATGCTGCCGTTACGCAATGCCTTTGAAACCGCAGGTCCGACCTTTAGCGAAATTCTGAAAACCCTGAATCCGGATCTGCTGATTTATGATTTTAATCCGTCTTGGGCCCCGGAAATTGCCTCATCACATAATATTCCGGCAGTGTATTTTCTGACCACCGCCGCAGCAAGCTCTAGTATTGGCTTACATGCCTTTAAAAATCCGGGCGAAAAATATCCGTTTCCGGATTTTTATGATAATAGCAATATTACCCCGGAACCGCCGAGCGCCGATAATATGAAACTGTTACATGATTTTATTGCATGTTTTGAACGCTCTTGTGATATTATTCTGATTAAATCTTTTCGCGAACTGGAAGGTAAATATATTGATCTGCTGTCTACCCTGAGCGATAAAACCTTAGTTCCGGTGGGCCCGCTGGTTCAAGATCCGATGGGTCATAATGAAGATCCGAAAACCGAACAGATTATTAATTGGTTAGATAAACGTGCAGAATCAACCGTGGTGTTTGTGTGTTTTGGTAGCGAATATTTTCTGAGCAATGAAGAACTGGAAGAAGTTGCCATTGGCTTAGAAATTAGTACCGTTAATTTTATTTGGGCAGTGCGCCTGATTGAAGGTGAAAAAAAAGGCATTCTGCCGGAAGGCTTTGTTCAGCGCGTGGGTGATCGCGGCTTAGTTGTGGAAGGTTGGGCCCCGCAGGCACGTATTCTGGGTCATAGCTCAACCGGCGGCTTTGTGAGTCATTGTGGTTGGAGTAGCATTGCAGAATCTATGAAATTTGGCGTTCCGGTGATTGCTATGGCACGTCATTTAGATCAGCCGCTGAATGGTAAACTGGCAGCCGAAGTGGGCGTGGGTATGGAAGTGGTGCGCGATGAAAATGGCAAATATAAACGCGAAGGCATTGCAGAAGTGATTCGCAAAGTTGTGGTTGAAAAATCAGGCGAAGTTATTCGTCGCAAAGCACGCGAACTGTCAGAAAAAATGAAAGAAAAAGGCGAACAGGAAATTGATCGTGCACTGGAAGAATTAGTTCAGATTTGTAAAAAAAAAAAAGATGAACAG(SEQID No.2)。

氨基酸序列为：MDNQNGRISIALLPFLAHGHISPFFELAKQLAKRNCNVFLCSTPINLSSIKDKDSSASIKLVELHLPSSPDLPPHYHTTNGLPSHLMLPLRNAFETAGPTFSEILKTLNPDLLIYDFNPSWAPEIASSHNIPAVYFLTTAAASSSIGLHAFKNPGEKYPFPDFYDNSNITPEPPSADNMKLLHDFIACFERSCDIILIKSFRELEGKYIDLLSTLSDKTLVPVGPLVQDPMGHNEDPKTEQIINWLDKRAESTVVFVCFGSEYFLSNEELEEVAIGLEISTVNFIWAVRLIEGEKKGILPEGFVQRVGDRGLVVEGWAPQARILGHSSTGGFVSHCGWSSIAESMKFGVPVIAMARHLDQPLNGKLAAEVGVGMEVVRDENGKYKREGIAEVIRKVVVEKSGEVIRRKARELSEKMKEKGEQEIDRALEELVQICKKKKDEQ(SEQ ID NO.1)。

2)将构建获得的pET30a-PgUGT质粒转化E.coli BL21(DE3)中，通过电泳结果(图1)可以看到成功获得工程菌BL21(DE3)/PgUGT。

实施例2重组大肠杆菌发酵产酶

将重组大肠杆菌接种至10mL含有50mg/L Kanamycin的LB培养基中，37℃，250rpm条件下培养过夜。将培养菌液按1％接种量转接至100mL含有50mg/L Kanamycin的LB培养基中，培养至OD

实施例3大肠杆菌表达PgUGT纯化蛋白的获取

离心收集发酵后大肠杆菌菌体，清水洗涤两遍后，加入缓冲液，利用超声破碎仪破碎细胞。于4℃，10000rpm低温离心30min获得上清，获得蛋白破碎液。通过镍柱对蛋白破碎液进行纯化，结果见图2，表明目的蛋白可以有效结合在镍柱上，通过含有20mM咪唑的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)洗脱结合能力较弱的杂蛋白，用含有200mM咪唑的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)洗脱PgUGT。纯化蛋白PgUGT保存于4℃待用。

实施例4通过优化发酵条件，提高PgUGT可溶蛋白表达量

将重组大肠杆菌接种至10mL含有50mg/L Kanamycin的LB培养基中，37℃，250rpm条件下培养过夜。将培养菌液按1％接种量转接至100mL含有50mg/L Kanamycin的LB培养基中，培养至OD

表2发酵条件优化及蛋白产量

实施例5 PgUGT酶活测定

反应体系中加入3mM ST/RA，3mM UDPG及50mM磷酸盐缓冲液(pH8)至终体积0.19mL。反应液在40℃预热5min，加入10μL酶液，在40℃，250rpm条件下反应15min。反应结束后，沸水煮10min，离心取反应液上清检测产物。PgUGT酶活定义为1min反应生成1μM RE/RD的酶量为1U。

实施例6 PgUGT对莱鲍迪苷A的催化功能验证

反应体系中加入1mM RA，1mM UDPG，200U/L PgUGT蛋白及50mM磷酸盐缓冲液(pH8)至终体积0.2mL，在40℃，250rpm条件下反应30min。反应结束后，沸水煮10min，离心取上清稀释过滤后进行高效液相色谱检测，产物中生成RD(图3)。

实施例7 PgUGT对甜菊苷的催化功能验证

反应体系中加入1mM ST，1mM UDPG，200U/L PgUGT蛋白及50mM磷酸盐缓冲液(pH8)至终体积0.2mL，在40℃，250rpm条件下反应30min。反应结束后，沸水煮10min，离心取上清稀释过滤后进行高效液相色谱检测，产物中生成RE(图4)。

实施例8温度对PgUGT在甜菊糖合成的影响

反应体系中加入3mM RA，1.5mM UDPG，600U/L PgUGT蛋白及50mM磷酸盐缓冲液(pH7)至终体积0.2mL，分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃，250rpm条件下反应30min，检测温度对PgUGT在甜菊糖合成的影响。

反应结束后，沸水煮10min，离心取上清过滤后进行高效液相色谱检测。可以看出，随着温度增加，RD产量是先上升后下降的过程，在PgUGT在温度为40℃时，RD产量最高，为0.513mg/mL，PgUGT在甜菊糖合成中最适温度为40℃(图5)。

实施例9 pH对PgUGT在甜菊糖合成中的影响

反应体系中加入3mM RA，1.5mM UDPG，600U/L PgUGT蛋白，50mM磷酸盐缓冲液，其中pH设定为6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5，至终体积0.2mL，在40℃，250rpm条件下反应30min。反应结束后，沸水煮10min，离心取上清过滤后进行高效液相色谱检测。PgUGT在pH为8时，RD产量最高，为0.697mg/mL，PgUGT在甜菊糖合成中最适pH为8(图6)。

实施例10大肠杆菌表达PgUGT酶法催化莱鲍迪苷A合成莱鲍迪苷D

反应体系中加入3mM RA，3mM UDPG，适量大肠杆菌蛋白破碎液(1000U/L总蛋白量)及50mM磷酸盐缓冲液(pH 8)至终体积0.2mL，在40℃，250rpm条件下反应12h。反应结束后，沸水煮10min，离心取上清稀释过滤后进行高效液相色谱检测。RA转化率为94.3％，生成RD2.75mM，RD产率为97.2％(图7)。

实施例11大肠杆菌表达PgUGT酶法催化甜菊苷合成莱鲍迪苷E

反应体系中加入3mM ST，3mM UDPG，适量大肠杆菌蛋白破碎液(1100U/L总蛋白量)及50mM磷酸盐缓冲液(pH8)至终体积0.2mL，在40℃，250rpm条件下反应12h。反应结束后，沸水煮10min，离心取上清稀释过滤后进行高效液相色谱检测。ST转化率为96.8％，生成RE2.86mM，RE产率为98.5％(图8)。

上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南理工大学

<120> 人参糖基转移酶在合成甜菊糖中的应用

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 442

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Asp Asn Gln Asn Gly Arg Ile Ser Ile Ala Leu Leu Pro Phe Leu

1 5 10 15

Ala His Gly His Ile Ser Pro Phe Phe Glu Leu Ala Lys Gln Leu Ala

20 25 30

Lys Arg Asn Cys Asn Val Phe Leu Cys Ser Thr Pro Ile Asn Leu Ser

35 40 45

Ser Ile Lys Asp Lys Asp Ser Ser Ala Ser Ile Lys Leu Val Glu Leu

50 55 60

His Leu Pro Ser Ser Pro Asp Leu Pro Pro His Tyr His Thr Thr Asn

65 70 75 80

Gly Leu Pro Ser His Leu Met Leu Pro Leu Arg Asn Ala Phe Glu Thr

85 90 95

Ala Gly Pro Thr Phe Ser Glu Ile Leu Lys Thr Leu Asn Pro Asp Leu

100 105 110

Leu Ile Tyr Asp Phe Asn Pro Ser Trp Ala Pro Glu Ile Ala Ser Ser

115 120 125

His Asn Ile Pro Ala Val Tyr Phe Leu Thr Thr Ala Ala Ala Ser Ser

130 135 140

Ser Ile Gly Leu His Ala Phe Lys Asn Pro Gly Glu Lys Tyr Pro Phe

145 150 155 160

Pro Asp Phe Tyr Asp Asn Ser Asn Ile Thr Pro Glu Pro Pro Ser Ala

165 170 175

Asp Asn Met Lys Leu Leu His Asp Phe Ile Ala Cys Phe Glu Arg Ser

180 185 190

Cys Asp Ile Ile Leu Ile Lys Ser Phe Arg Glu Leu Glu Gly Lys Tyr

195 200 205

Ile Asp Leu Leu Ser Thr Leu Ser Asp Lys Thr Leu Val Pro Val Gly

210 215 220

Pro Leu Val Gln Asp Pro Met Gly His Asn Glu Asp Pro Lys Thr Glu

225 230 235 240

Gln Ile Ile Asn Trp Leu Asp Lys Arg Ala Glu Ser Thr Val Val Phe

245 250 255

Val Cys Phe Gly Ser Glu Tyr Phe Leu Ser Asn Glu Glu Leu Glu Glu

260 265 270

Val Ala Ile Gly Leu Glu Ile Ser Thr Val Asn Phe Ile Trp Ala Val

275 280 285

Arg Leu Ile Glu Gly Glu Lys Lys Gly Ile Leu Pro Glu Gly Phe Val

290 295 300

Gln Arg Val Gly Asp Arg Gly Leu Val Val Glu Gly Trp Ala Pro Gln

305 310 315 320

Ala Arg Ile Leu Gly His Ser Ser Thr Gly Gly Phe Val Ser His Cys

325 330 335

Gly Trp Ser Ser Ile Ala Glu Ser Met Lys Phe Gly Val Pro Val Ile

340 345 350

Ala Met Ala Arg His Leu Asp Gln Pro Leu Asn Gly Lys Leu Ala Ala

355 360 365

Glu Val Gly Val Gly Met Glu Val Val Arg Asp Glu Asn Gly Lys Tyr

370 375 380

Lys Arg Glu Gly Ile Ala Glu Val Ile Arg Lys Val Val Val Glu Lys

385 390 395 400

Ser Gly Glu Val Ile Arg Arg Lys Ala Arg Glu Leu Ser Glu Lys Met

405 410 415

Lys Glu Lys Gly Glu Gln Glu Ile Asp Arg Ala Leu Glu Glu Leu Val

420 425 430

Gln Ile Cys Lys Lys Lys Lys Asp Glu Gln

435 440

<210> 2

<211> 1326

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggataatc agaatggtcg tatttcaatt gccctgttac cgtttctggc acatggccat 60

atttcaccgt tttttgaatt agccaaacag ttagccaaac gtaattgtaa tgtgtttctg 120

tgtagtaccc cgattaatct gtcaagcatt aaagataaag atagctcagc ctctattaaa 180

ctggtggaac tgcatctgcc gagtagtccg gatctgccgc cgcattatca taccaccaat 240

ggcttaccct cccatctgat gctgccgtta cgcaatgcct ttgaaaccgc aggtccgacc 300

tttagcgaaa ttctgaaaac cctgaatccg gatctgctga tttatgattt taatccgtct 360

tgggccccgg aaattgcctc atcacataat attccggcag tgtattttct gaccaccgcc 420

gcagcaagct ctagtattgg cttacatgcc tttaaaaatc cgggcgaaaa atatccgttt 480

ccggattttt atgataatag caatattacc ccggaaccgc cgagcgccga taatatgaaa 540

ctgttacatg attttattgc atgttttgaa cgctcttgtg atattattct gattaaatct 600

tttcgcgaac tggaaggtaa atatattgat ctgctgtcta ccctgagcga taaaacctta 660

gttccggtgg gcccgctggt tcaagatccg atgggtcata atgaagatcc gaaaaccgaa 720

cagattatta attggttaga taaacgtgca gaatcaaccg tggtgtttgt gtgttttggt 780

agcgaatatt ttctgagcaa tgaagaactg gaagaagttg ccattggctt agaaattagt 840

accgttaatt ttatttgggc agtgcgcctg attgaaggtg aaaaaaaagg cattctgccg 900

gaaggctttg ttcagcgcgt gggtgatcgc ggcttagttg tggaaggttg ggccccgcag 960

gcacgtattc tgggtcatag ctcaaccggc ggctttgtga gtcattgtgg ttggagtagc 1020

attgcagaat ctatgaaatt tggcgttccg gtgattgcta tggcacgtca tttagatcag 1080

ccgctgaatg gtaaactggc agccgaagtg ggcgtgggta tggaagtggt gcgcgatgaa 1140

aatggcaaat ataaacgcga aggcattgca gaagtgattc gcaaagttgt ggttgaaaaa 1200

tcaggcgaag ttattcgtcg caaagcacgc gaactgtcag aaaaaatgaa agaaaaaggc 1260

gaacaggaaa ttgatcgtgc actggaagaa ttagttcaga tttgtaaaaa aaaaaaagat 1320

gaacag 1326