一种引物组合物、试剂盒和应用

本申请要求于2021年09月02日提交中国专利局、申请号为202111027244.5、发明名称为“一种引物组合物、试剂盒和应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。

技术领域

本申请涉及植物鉴定技术领域，特别是涉及一种引物组合物、试剂盒和应用。

背景技术

金银花为忍冬科植物忍冬(Lonicera japonica Thunb.)干燥花蕾或待初开的花，为我国常用大宗药材之一。忍冬科植物灰毡毛忍冬(Lonicera macranthoides)、红腺忍冬(Lonicera hypoglauca)、华南忍冬(Lonicera confuse)或黄褐毛忍冬(Lonicerafulvotomentosa)的干燥花蕾或待初开的花统称为山银花。淡红忍冬(Loniceraacuminata)的花是另一种忍冬科忍冬属植物的干燥花蕾或待初开的花。

在中药材市场上，金银花价格较高，导致中成药金银花成分中掺伪的情况较为严重，比如掺有灰毡毛忍冬的花、红腺忍冬的花、华南忍冬的花、黄褐毛忍冬的花或淡红忍冬的花等。由于这些物种的花的形状特征比较相似，加上中成药中添加的成分往往经过蒸煮、研磨、提取等工序，添加成分已失去原有性状特征，导致采用常规方法鉴定时，容易受到主观影响而判断不准确。因此，亟需一种更加客观准确的鉴定金银花中是否掺有混伪品的方法。

发明内容

本申请的目的在于提供一种引物组合物，以通过对金银花及其混伪品中psbA-trnH区域内特定序列的特异性扩增，从而实现金银花及其混伪品的准确鉴定。具体技术方案如下：

本申请提供了一种引物组合物，包括正向引物和反向引物，其中，正向引物的序列如SEQ ID NO:1所示，反向引物的序列如SEQ ID NO:2所示。

本申请还提供了上述引物组合物在鉴定金银花及其混伪品中的应用；其中，混伪品包括灰毡毛忍冬的花、红腺忍冬的花、华南忍冬的花、黄褐毛忍冬的花和淡红忍冬的花中的至少一种。

本申请还提供了一种采用上述引物组合物鉴定金银花及其混伪品的方法，包括步骤：提取待测样品的总DNA；采用引物组合物，以待测样品的总DNA为模板进行PCR扩增；对扩增产物进行测序，获得ASV序列；将ASV序列与金银花及其混伪品的psbA-trnH区域内相应基因序列进行比对，鉴定出金银花及其混伪品；其中，混伪品包括灰毡毛忍冬的花、红腺忍冬的花、华南忍冬的花、黄褐毛忍冬的花和淡红忍冬的花中的至少一种。

在一些实施例中，PCR扩增体系中包括：0.1-0.3μmol/L正向引物；0.1-0.3μmol/L反向引物；2-10ng/μL模板DNA；50-150μmol/L dNTPs；0.02-0.03U/μL DNA聚合酶。

在一些实施例中，PCR扩增的条件包括：预变性：97-98℃，50-70s；变性：97-98℃，8-12s；退火：54-56℃，13-17s；延伸：67-69℃，25-35s；35-45个循环；完成循环后继续67-69℃延伸4-6min。

本申请还提供了一种采用上述引物组合物定量鉴定金银花及其混伪品的方法，包括步骤：提取待测样品的总DNA；采用引物组合物，以待测样品的总DNA为模板进行PCR扩增；对扩增产物进行测序，获得ASV序列；将ASV序列与金银花及其混伪品的psbA-trnH区域内相应基因序列进行比对，鉴定出金银花及其混伪品；其中，混伪品包括灰毡毛忍冬的花、红腺忍冬的花、华南忍冬的花、黄褐毛忍冬的花和淡红忍冬的花中的至少一种；分别统计金银花和混伪品对应的ASV序列数目，然后经过换算金银花和混伪品的质量比值。

在一些实施例中，PCR扩增体系中包括：0.1-0.3μmol/L正向引物；0.1-0.3μmol/L反向引物；2-10ng/μL模板DNA；50-150μmol/L dNTPs；0.02-0.03U/μL DNA聚合酶。

在一些实施例中，PCR扩增的条件包括：预变性：97-98℃，50-70s；变性：97-98℃，8-12s；退火：54-56℃，13-17s；延伸：67-69℃，25-35s；35-45个循环；完成循环后继续67-69℃延伸4-6min。

本申请还提供了一种用于鉴定金银花及其混伪品的试剂盒，试剂盒中包括上述引物组合物；其中，混伪品包括灰毡毛忍冬的花、红腺忍冬的花、华南忍冬的花、黄褐毛忍冬的花和淡红忍冬的花中的至少一种。

在一些实施例中，试剂盒中还包括PCR缓冲液、DEPC水、DNA聚合酶、dNTPs，及操作说明书。

本申请提供的引物组合物，可以用于特异性扩增金银花、灰毡毛忍冬的花、红腺忍冬的花、华南忍冬的花、黄褐毛忍冬的花和淡红忍冬的花的psbA-trnH区域内特定序列，从而准确鉴定出金银花中是否掺有灰毡毛忍冬的花、红腺忍冬的花、华南忍冬的花、黄褐毛忍冬的花或淡红忍冬的花。

当然，实施本申请的任一产品或方法并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。

附图说明

为了更清楚地说明本申请或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的实施例。

图1为本申请实施例2中5个待测样品扩增得到的PCR产物的凝胶电泳结果图；

图2为本申请实施例3中各待测样品中金银花和灰毡毛忍冬的花的ASV序列数目比与各待测样品中金银花和灰毡毛忍冬的花质量比的相关性分析结果图；

图3为本申请实施例4中10个待测样品扩增得到的PCR产物的凝胶电泳结果图。

具体实施方式

下面将结合本申请中的附图，对本申请中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员基于本申请所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

本申请第一方面提供了一种引物组合物，包括正向引物和反向引物，其中，正向引物为5’-GTCAATCTTCTTATTTTTAG-3’(SEQ ID NO:1)；反向引物为5’-ACAATTATAGATAAGTCAGC-3’(SEQ ID NO:2)。

本申请第二方面提供了本申请第一方面所提供的引物组合物在鉴定金银花及其混伪品中的应用；其中，混伪品包括灰毡毛忍冬的花、红腺忍冬的花、华南忍冬的花、黄褐毛忍冬的花和淡红忍冬的花中的至少一种。

发明人在研究中发现，本申请的引物组合物，能够同时用于扩增金银花及其混伪品的具有不同碱基序列的DNA片段。因此，如果待测样品中包括金银花和任意一种或多种混伪品，那么对待测样品的总DNA进行PCR扩增的产物中就会出现金银花的DNA片段和相应的混伪品的DNA片段。将扩增得到的PCR产物进行测序，测序分析得到的ASV(Ampliconsequence variant，扩增子序列变异)序列分别与金银花及其混伪品的psbA-trnH区域内相应基因序列进行比对；如果序列相似度大于97％，即认定为含有对应的物种，从而确定待测样品金银花中是否含有灰毡毛忍冬的花、红腺忍冬的花、华南忍冬的花、黄褐毛忍冬的花和淡红忍冬的花中的一种或多种。

本申请第三方面提供了一种采用本申请第一方面提供的引物组合物鉴定金银花及其混伪品的方法，包括以下步骤：

1)提取待测样品的总DNA；

2)采用引物组合物，以待测样品的总DNA为模板进行PCR扩增；

3)对扩增产物进行测序，获得ASV序列；

4)将ASV序列与金银花及其混伪品的psbA-trnH区域内相应基因序列进行比对，鉴定出金银花及其混伪品；其中，混伪品包括灰毡毛忍冬的花、红腺忍冬的花、华南忍冬的花、黄褐毛忍冬的花和淡红忍冬的花中的至少一种。

本申请中，对待测样品总DNA的提取方法不做限定，只要能够实现本申请的目的即可，例如可以采用市售的植物基因组提取试剂盒即可，如TIANGEN公司的SK8732磁珠法基因组DNA抽提试剂盒(植物)。

本申请中，对引物组合物的合成方法不做限定，只要能够根据核苷酸序列合成得到引物组合物即可，例如可以采用固相亚磷酰胺三酯法、β-乙腈亚磷酰胺化学合成法等方法进行引物合成。

对待测样品的总DNA进行PCR扩增可采用常规的PCR扩增体系，例如25μL扩增体系或50μL扩增体系等，本申请在此不做限定。

在本申请第三方面的一些实施方式中，步骤2)中，PCR扩增体系中包括：0.1-0.3μmol/L正向引物；0.1-0.3μmol/L反向引物；2-10ng/μL模板DNA；50-150μmol/L dNTPs；0.02-0.03U/μL DNA聚合酶。

dNTPs以及DNA聚合酶均为PCR体系的常规通用试剂，均可市售获得。DNA聚合酶可以选择PCR扩增用的常规DNA聚合酶，本申请在此不做限定，例如Tks Gflex DNA聚合酶。

当然，PCR扩增体系中还包括PCR缓冲液和ddH

本领域中，PCR缓冲液通常为浓缩的PCR缓冲液，例如可以是2×PCR缓冲液、10×PCR缓冲液等，本申请对此不做限定，示例性的，对于50μL扩增体系而言，如果采用2×PCR缓冲液，其用量通常为25μL，如果采用10×PCR缓冲液，其用量通常为5μL；此为PCR扩增的常规用法，本申请在此不做限定。PCR扩增体系中，除缓冲液、引物、模板、dNTP及DNA聚合酶，剩余体积以双蒸水(ddH

在本申请第三方面的一些实施方式中，步骤2)中，PCR扩增的条件包括：预变性：97-98℃，50-70s；变性：97-98℃，8-12s；退火：54-56℃，13-17s；延伸：67-69℃，25-35s；35-45个循环；完成循环后继续67-69℃延伸4-6min。

其中，“35-45个循环”是指变性、退火、延伸三个过程的循环，此为本领域常规操作，本申请在此不做赘述。

本申请中采用的测序方法为第二代测序技术，是本领域公知的测序方法，本申请在此不做赘述。

本申请中，测序获取ASV序列的方法为本领域的常规操作，本申请在此不做限定，只要能够实现本申请的目的即可，例如，可以将测序数据采用DADA2算法进行聚类分析，得到ASV及对应的ASV表，ASV表中包括ASV序列及其数量等信息。

本申请中，将ASV序列与金银花及其混伪品的psbA-trnH区域内相应基因序列进行比对，如果序列相似度大于97％，即认定为含有对应的物种。序列比对的方法为本领域的常规操作，本申请在此不做限定，只要能够实现本申请的目的即可，例如，可以将ASV序列采用NCBI(National center for biotechnology information，美国国立生物技术信息)核酸序列数据库(https://ftp.ncbi.nih.gov/blast/db/FASTA/nt.gz)在线Blast进行比对，如果序列相似度大于97％，即认定为含有对应的物种，从而实现物种的鉴定。

本申请第四方面提供了一种采用本申请第一方面提供的引物组合物定量鉴定金银花及其混伪品的方法，包括以下步骤：

1)提取待测样品的总DNA；

2)采用引物组合物，以待测样品的总DNA为模板进行PCR扩增；

3)对扩增产物进行测序，获得ASV序列；

4)将ASV序列与金银花及其混伪品的psbA-trnH区域内相应基因序列进行比对，鉴定出金银花及其混伪品；其中，混伪品包括灰毡毛忍冬的花、红腺忍冬的花、华南忍冬的花、黄褐毛忍冬的花和淡红忍冬的花中的至少一种；

5)分别统计金银花和混伪品对应的ASV序列数目，然后经过换算得到金银花及其混伪品的质量比值。

发明人在研究中发现，本申请的引物组合物，在定性鉴定出待测样品中金银花中是否含有灰毡毛忍冬的花、红腺忍冬的花、华南忍冬的花、黄褐毛忍冬的花和淡红忍冬的花中的一种或多种的基础上，通过换算，还能定量鉴定出金银花及其混伪品在待测样品中的质量比值。

本申请中，换算的公式为：Y＝aX-b；其中，X为金银花对应的ASV序列数目和混伪品对应的ASV序列数目的比值，Y为金银花和混伪品的质量比值。

若混伪品为灰毡毛忍冬的花时，a取3.815，b取0.9937，即换算的公式为：Y＝3.815X-0.9937；其中，X为金银花对应的ASV序列数目和混伪品对应的ASV序列数目的比值，Y为金银花和混伪品的质量比值。

在本申请第四方面的一些实施方式中，步骤2)中，PCR扩增体系中包括：0.1-0.3μmol/L正向引物；0.1-0.3μmol/L反向引物；2-10ng/μL模板DNA；50-150μmol/L dNTPs；0.02-0.03U/μL DNA聚合酶。

在本申请第四方面的一些实施方式中，步骤2)中，PCR扩增的条件包括：预变性：97-98℃，50-70s；变性：97-98℃，8-12s；退火：54-56℃，13-17s；延伸：67-69℃，25-35s；35-45个循环；完成循环后继续67-69℃延伸4-6min。

本申请第四方面采用的待测样品总DNA的提取方法、PCR扩增体系、dNTPs以及DNA聚合酶、PCR缓冲液和ddH

本申请第五方面提供了一种用于鉴定金银花及其混伪品的试剂盒，包括本申请第一方面所提供的引物组合物；其中，混伪品包括灰毡毛忍冬的花、红腺忍冬的花、华南忍冬的花、黄褐毛忍冬的花和淡红忍冬的花中的至少一种。

在本申请第五方面的一些实施方式中，试剂盒中还包括PCR缓冲液、ddH

以下结合具体实施例对本申请进行详细说明。

本申请中采用的主要仪器和主要试剂分别如下表1和表2所示。

1、主要仪器

表1实验主要仪器

2、主要试剂

表2实验主要试剂

实施例1

1、引物工作液制备

根据正向引物核苷酸序列5’-GTCAATCTTCTTATTTTTAG-3’(SEQ ID NO:1)、反向引物核苷酸序列5’-ACAATTATAGATAAGTCAGC-3’(SEQ ID NO:2)，采用固相亚磷酰胺三酯法合成得到引物粉末，然后制备引物工作液，包括如下步骤：

①将装有引物粉末的离心管用离心机离心，5000rpm离心1min，使管内附着于管口和管壁的引物粉末离心集中至离心管底部；

②离心后的离心管置于管架上，在紫外灭菌后的超净台中根据引物质量加入相应体积高压灭菌的TE溶液，使其终浓度为100μM；涡旋混匀后简短离心，得到引物母液；

③取10μM引物母液于1.5ml灭菌离心管中，按照1:10比例进行稀释，向各管内加入90μM DEPC水，涡旋混匀后简短离心，使其终浓度为10μM，即得到引物工作液，用于后续PCR实验。

2、DNA提取

从安国中药材市场购买金银花和灰毡毛忍冬的花，然后分别提取金银花和灰毡毛忍冬的花的总DNA。根据TIANGEN公司的SK8732磁珠法基因组DNA抽提试剂盒(植物)的产品说明书，DNA提取具体操作流程如下：

①向各样品管加入600μL Buffer MPCB，30μL Proteinase K，浓度为20mg/ml，涡旋混匀后，水浴锅中65℃过夜消化，每组设置空白对照管；

②水浴结束后，离心机离心，12000rpm离心10min，吸取500μL上清液至新的1.5ml离心管中；

③加入500μL Buffer MPL和MagicMag Beads，涡旋混匀后，离心管静置1min，置于磁力架上30s，吸弃上清液；

④加入500μL Buffer MPW，涡旋混匀，置于磁力架上30s，吸弃上清液；

⑤加入900μL 70％乙醇，震荡，置于磁力架上30s，吸弃上清液；

⑥重复步骤⑤，后置于室温干燥30min；

⑦加入100μL TE Buffer，水浴65℃，10min，置于磁力架上30s，吸取上清液转移至新的1.5ml离心管中。利用NanoDrop 2000来检测提取的DNA浓度，其中，金银花样品的DNA浓度为24.1ng/μL，灰毡毛忍冬的花样品的DNA浓度为26.3ng/μL。

3、PCR扩增

PCR实验中样品组和一个空白对照管为一组，每组PCR实验添加一个负对照管。

扩增体系(50μL)：

扩增条件：

预变性：98℃，60s；变性：98℃，10s；退火：56℃，15s；延伸：68℃，30s；40个循环；完成循环后继续68℃延伸5分钟。

4、PCR产物检测

使用1.5％的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测，设定电泳电压110V，电泳时间30min。

①琼脂糖凝胶制备：

称取0.75g琼脂糖、50ml 0.5×TBE(Tris-硼酸)倒入锥形瓶，微波炉加热至瓶内琼脂糖粉末全部溶于TBE中，锥形瓶对光透视，溶液内无明显琼脂糖颗粒即可，稍稍放凉后向瓶内加入5μL DuRed核酸染料，轻轻摇晃，混合均匀后沿一侧倒入制胶模具中，模具一端插入鲨鱼齿梳，放置30min，凝固后取出。

②PCR产物上样电泳

准备和PCR产物数量相同的洁净灭菌的100μL离心管，管内添加1μL 6×loadingbuffer，吸取PCR产物4μL于离心管内，涡旋混匀，简短离心，使PCR产物集中于管底部，PCR产物上样5μL，按组号顺序依次上样，Trans2K Plus DNA Marker直接上样5μL，电泳仪电压110V，时间30min。

电泳检测结果显示，2个样本均扩增成功，且空管和负管均无污染。

5、测序

将PCR产物及引物工作液进行Sanger法双端测序。将测序数据导入GeneiousPrime 2020.2进行双端数据De Novo Assemble拼接，拼接后的一致性序列用NCBI核酸序列数据库在线Blast进行物种鉴定。结果如表3所示。

表3金银花和灰毡毛忍冬的花Sanger测序鉴定结果

Sanger测序结果显示金银花鉴定物种为忍冬，灰毡毛忍冬的花鉴定物种为灰毡毛忍冬，鉴定得到的物种结果和实际物种一致，说明本申请提供的引物组合物物种鉴定能力表现良好，能有效鉴定出单一物种样品为灰毡毛忍冬的花还是金银花。

实施例2

将金银花和灰毡毛忍冬的花按下表4的比例进行混样，得到5个待测样品，其中金银花和灰毡毛忍冬的花购自于安国中药材市场。

表4金银花和灰毡毛忍冬的花的混样比例

1、提取待测样品的总DNA

上述5份待测样品，各取100mg采用TIANGEN公司的SK8732磁珠法基因组DNA抽提试剂盒(植物)进行DNA提取，提取方法同实施例1中步骤2DNA提取中的方法，在此不再重复。

2、采用引物组合物，以待测样品的总DNA为模板进行PCR扩增

为了后续分析区分样品，在正向引物和反向引物的5’端均加上barcode序列，不同待测样品及barcode序列对应信息如表5所示。

表5待测样品及barcode序列对应信息表

合成添加有barcode的引物序列，制备引物工作液，具体制备方法同实施例1中步骤1引物工作液制备中的方法，在此不再重复。

5份待测样品的PCR扩增方法同实施例1中步骤3PCR扩增中的方法，PCR产物检测方法同实施例1中步骤4PCR产物检测中的方法，在此不再重复。

其中PCR产物检测得到的凝胶电泳结果图如图1所示，从图1中可以看出5个待测样品均扩增成功，且空管和负管均无污染。

3、对扩增产物进行测序，获得ASV序列

将PCR扩增产物根据浓度按等摩尔数进行混样建库，使用Illumina Miseq平台PE150模式进行测序。将测序数据采用DADA2算法进行聚类分析，得到ASV及对应的ASV表，ASV表中包括ASV序列及其数量信息。

4、将ASV序列与金银花和灰毡毛忍冬的花的psbA-trnH区域内相应基因序列进行比对，鉴定出金银花和灰毡毛忍冬的花

将ASV序列采用NCBI核酸序列数据库在线Blast进行比对，如果ASV序列与金银花或灰毡毛忍冬的花的psbA-trnH区域内相应基因序列相似度大于97％，即认定为对应物种的序列。

鉴定结果：该实施例的5个待测样品，经过数据分析和序列比对，不同待测样品中ASV鉴定结果具体如表6所示。

表6不同待测样品中ASV鉴定结果

从上述结果可知，5个待测样品中都鉴定到忍冬和灰毡毛忍冬，即5个待测样品中都包括金银花和灰毡毛忍冬的花，鉴定得到的结果和实际一致，说明本申请提供的引物组合物能有效鉴定出混合样品中的金银花和灰毡毛忍冬的花。

实施例3

对实施例2的测序数据进一步分析，5个待测样品中金银花和灰毡毛忍冬的花分别对应的ASV序列数目以及对应的比值、质量比如下表7所示。

表7不同待测样品中不同物种的ASV序列比和质量比

对金银花和灰毡毛忍冬的花在各待测样品中的ASV序列数目比与在各待测样品中金银花和灰毡毛忍冬的花实际混合质量比进行相关性分析。结果如图2所示，其中X轴为金银花和灰毡毛忍冬的花对应的ASV序列数目的比值，Y轴为金银花和灰毡毛忍冬的花的质量比值。结果显示金银花和灰毡毛忍冬的花在5个待测样品中占有的序列数比例与人工混样时金银花和灰毡毛忍冬的花的混样占比成显著相关(R

实施例4

从药店购买10批次含有金银花成分的中成药样品，具体样品信息如下表8所示。

表8待测样品信息表

1、提取待测样品的总DNA

取上述10份待测样品，分别采用TIANGEN公司的SK8732磁珠法基因组DNA抽提试剂盒(植物)进行DNA提取，提取方法同实施例1中步骤2DNA提取中的方法，在此不再重复。

2、采用引物组合物，以待测样品的总DNA为模板进行PCR扩增

为了后续分析区分样品，在正向引物和反向引物的5’端均加上barcode序列，不同待测样品及barcode序列对应信息如表9所示。

表9待测样品及barcode序列对应信息表

合成添加有barcode的引物序列，制备引物工作液，具体方法同实施例1中步骤1引物工作液制备中的方法，在此不再重复。

10份待测样品的PCR扩增方法同实施例1中步骤3PCR扩增中的方法，PCR产物检测方法同实施例1中步骤4PCR产物检测中的方法，在此不再重复。

其中PCR产物检测得到的凝胶电泳结果图如图3所示。从图3中可以看出，10个待测样品均扩增成功，且空管和负管均无污染。

3、对扩增产物进行测序，获得ASV序列

测序获得ASV序列的方法同实施例2步骤3中的方法，在此不再重复。

4、将ASV序列与金银花及其混伪品的psbA-trnH区域内相应基因序列进行比对，鉴定出金银花及其混伪品

比对方法同实施例2步骤4中的方法，在此不再重复。

鉴定结果：该实施例的10个待测样品，经过数据分析和序列比对，不同待测样品中ASV鉴定结果具体如表10所示。

表10不同待测样品中ASV鉴定结果

从上述结果可知，YQJD4、LQBD13、YXC1、LQJD2、JSSJ1、NHQG 5个待测样品中鉴定到灰毡毛忍冬、忍冬2个物种，即包括灰毡毛忍冬的花和金银花；ZZJH2、QGW、JSKY 3个待测样品中鉴定到灰毡毛忍冬、黄褐毛忍冬、忍冬3个物种，即包括灰毡毛忍冬的花、黄褐毛忍冬的花和金银花；LDP1待测样品中鉴定到忍冬、淡红忍冬、黄褐毛忍冬、灰毡毛忍冬4个物种，即包括金银花、淡红忍冬的花、黄褐毛忍冬的花、灰毡毛忍冬的花。

实施例5

对实施例4的测序数据进一步分析，统计金银花和灰毡毛忍冬的花在各待测样品中的ASV序列数目，具体如下表11所示。

表11不同待测样品中不同物种的ASV序列数目

计算每个待测样品中金银花和灰毡毛忍冬的花对应的ASV序列数目的比值，然后采用换算的公式：Y＝3.815X-0.9937，Y为金银花和灰毡毛忍冬的花的质量比值，X为金银花和灰毡毛忍冬的花对应的ASV序列数目的比值，得到每个待测样品中金银花和灰毡毛忍冬的花的质量比值，得到的结果如表11所示。

从表11中金银花和灰毡毛忍冬的花的质量比值中可以看出，10个待测样品中，NHQG待测样品中金银花和灰毡毛忍冬的花的质量比值为5.2768，说明这个待测样品中存在较多灰毡毛忍冬的花，YQJD4待测样品中金银花和灰毡毛忍冬的花的质量比值为14.7296，说明这个待测样品中存在少量灰毡毛忍冬的花；其他8个待测样品中金银花和灰毡毛忍冬的花的质量比值均在35以上，说明这8个待测样品中存在微量灰毡毛忍冬的花。

从上述实施例可知，本申请提供的引物组合物，能够特异性扩增金银花、灰毡毛忍冬的花、红腺忍冬的花、华南忍冬的花、黄褐毛忍冬的花和淡红忍冬的花的psbA-trnH区域内特定序列，从而准确鉴定出金银花中是否掺有灰毡毛忍冬的花、红腺忍冬的花、华南忍冬的花、黄褐毛忍冬的花或淡红忍冬的花；并且能够定量鉴定出金银花和混伪品的质量比。

本说明书中的各个实施例均采用相关的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。

以上仅为本申请的较佳实施例，并非用于限定本申请的保护范围。凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本申请的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津中医药大学

<120> 一种引物组合物、试剂盒和应用

<130> PP211348

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtcaatcttc ttatttttag 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acaattatag ataagtcagc 20

<210> 3

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggatataaag ggatataaag atttttcata acagaataaa aaatgaaagc ccaaaacaca 60

atcaggaccc gccc 74

<210> 4

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaaaaaattc caacagtttt tcttttattt tacttttatt ttagaggata taaagatttt 60

tcatacagaa tcaaaaatga aagcccaaaa tacaatcagg acccgccc 108