一株黄杆菌属细菌及其在低温堆肥中的应用

技术领域

本发明涉及一株促进低温堆肥发酵的黄杆菌(Flavobacterium sp.)的发酵与应用，属于生物技术领域。

背景技术

畜牧业会产生大量粪肥，粪肥需要经过堆肥发酵才能安全返田。生粪中含有大量有害微生物，寄生虫卵等，直接施用会导致病虫害的传播，污染环境；同时，生粪直接施用于土壤后，粪便发酵产生的NH

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速启动低温堆肥发酵的菌株，并阐明相应的应用方法，解决冬季堆肥发酵困难的问题，促进种植业和养殖业的良性循环。

本发明采用如下技术方案实现。

一株细菌，所述细菌为黄杆菌属(Flavobacterium sp.)4.8东1-14；保藏单位为：广东省微生物菌种保藏中心；保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；保藏编号为GDMCC No:62812；保藏时间为2022年9月19日。

本发明所述细菌的应用为使用菌株本身促进牧草生长。

本发明所述细菌在低温条件下使用该细菌作为发酵剂应用于堆肥发酵。

本发明所述细菌的应用为施用完成发酵的堆肥促进盆栽黑麦草的生长。

本发明所述细菌发酵剂的制备方法步骤为：步骤1：将Flavobacterium sp.4.8东1-14进行活化培养：将菌种4.8东1-14在牛肉膏蛋白胨培养基上培养，15～30℃恒温培养箱中黑暗培养1-3天，获得活化后的菌株；

步骤2：将活化后的菌株进行一次发酵培养：将活化后的菌株于牛肉膏蛋白胨培养基中进行一次发酵获得种子液，培养条件为：温度为15～30℃，转速为180～240r/min下振荡发酵培养18～72h；

步骤3：将一次发酵培养后的种子液进行二次发酵培养：将所述一次发酵培养获得的种子液以4～10wt％的接种量接种于牛肉膏蛋白胨培养基中进行二次发酵获得培养液，培养条件为：温度为15～30℃，转速为180～240r/min下振荡发酵培养18～72h制得发酵剂。

本发明所述发酵剂的使用方法为，将发酵剂均匀撒到堆肥原料上，翻拌均匀，用量为堆体质量的0.2％-4％。

本发明所述发酵剂的使用方法为，将发酵剂加入灭菌后的辅剂，低温干燥后制成菌粉，在堆肥时按比例加入至堆肥堆体中。

本发明所述辅剂为麦麸。

本发明该细菌从中国东北黑龙江省鹤岗市黑土耕地表层土壤中分离得到。

本发明该细菌的培养基为牛肉膏蛋白胨培养基。

本发明该细菌能够在0℃条件下生长，且能够在堆肥中生长，用于在低温条件下启动堆肥发酵。

本发明该细菌发酵剂能用于低温堆肥发酵。

本发明的有益效果为，1、该菌株应用到堆肥中，使堆肥在0℃的条件下能够快速升温，进而带动中温菌和高温菌的繁殖，实现了堆肥在低温条件下的顺利启动；2、本菌株本身对牧草具有显著的促生长效应，利用本菌株制备的堆肥对黑麦草也具有良好的促生长效果，提高了堆肥质量。

下面结合附图和具体实施方式本发明做进一步解释。

附图说明

图1为本发明菌株的正面图与反面图；

图2为本发明菌株的系统发育树；

图3为本发明使用菌株本身对牧草生长起到促进作用的对比图(左起1、2为未使用本发明菌株；左起3、4、5为已使用本发明菌株)；

图4为本发明菌株发酵剂在雪天使用时的堆肥现场图；

图5为本发明菌株发酵剂对比使用实验，堆肥温度变化对照图；

图6为本发明菌株发酵剂对比使用实验，堆肥pH变化对照图；

图7为本发明菌株发酵剂对比使用实验，堆肥含水率变化对照图；

图8为本发明使用完成堆肥发酵后进行的堆肥盆栽实验对照图。

具体实施方式

见图1，图2所示。

一株细菌，所述细菌为黄杆菌属(Flavobacterium sp.)4.8东1-14；保藏单位为：广东省微生物菌种保藏中心；保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；保藏编号为GDMCC No:62812；保藏时间为2022年9月19日。

菌株名：4.8东1-14

以细菌16SrDNA的通用引物进行PCR扩增

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1.细菌总DNA的提取

在100ml无菌水中加入5g chelex-100混匀，用灭菌竹签在每个斜面培养基中挑取适量菌体置于PCR管中，各加入100μl chelex-100水溶液，充分震荡使菌体分散后，使用PCR仪，99℃孵育20min，离心取上清即为菌体总DNA，可直接用于细菌16srRNA的扩增。

2.PCR扩增

反应体系：总体系为 25.0μl

PA 1.0μl

PB 1.0μl

无菌水 9.5μl

DNA模板1.0μl

2xmix酶12.5μL

PCR反应程序如下：

3.PCR产物的检测——1％琼脂糖凝胶电泳

(1)配制1％琼脂糖凝胶：称量琼脂糖0.4g，量取1×TAE缓冲液40ml，共同倒入三角瓶内，微波炉加热熔化后，加入0.5μl核酸染料混匀，倒入凝胶槽，插入25孔制胶梳，待凝胶冷却后拔出梳子，确保凝固过程中不要产生气泡。

(2)点样：各取5μl PCR扩增产物加入点样孔中，最后一个点样孔加入5μlDL2000Marker。

(3)电泳：设置程序140V、20min，按“start”开始运行。

(4)取出凝胶块，使用凝胶成像分析仪观察，目的片段长度在1500bp左右，对比DL2000Marker看是否有正确条带。

4.菌种16srRNA鉴定

扩增成功的PCR产物于擎科生物科技有限公司进行测序，如下：GGTCATGCGTGGCTTACCATGCAGTCGAGGGGTAGAGGGAGCTTGCTCCCTTGAGACCGGCGCACGGGTGCGTAACGCGTATGCAATCTACCTTTTACAAAGGAATAGCCCAGAGAAATTTGGATTAATGCCTTATAGTTTATGCTTGTGGCATCACATACATAATAAAGATTTATCGGTAAAAGATGAGCATGCGTCCCATTAGCTAGTTGGTATGGTAACGGCATACCAAGGCAATGATGGGTAGGGGTCCTGAGAGGGAGATCCCCCACACTGGTACTGAGACACGGACCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGAGGCAACTCTGAACCAGCCATGCCGCGTGCAGGAAGACGGTCCTATGGATTGTAAACTGCTTTTATACAGGAATAAACCTACCCTCGTGAGGGTAGCTGAAGGTACTGTAGGAATAAGGATCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGATCCAAGCGTTATCCGGAATCATTGGGTTTAAAGGGTTCGTAGGCGGTTTAATAAGTCAGTGGTGAAATCTCCTAGCTTAACTAGGAAATGGCCATTGATACTGTTAGACTTGAATTATTGGGAAGTAACTAGAATATGTAGTGGTAGCGGTGAAATGCTTAGATATTACATGGAATACCAATTGCGAAGGCAGGTTACTATCAGTATATTGACGCTGATGAACGAAAGCGTGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGGAATACTAGCTGTTCGACCGCAAAGGTTGAGTGGCTAAAGCGAAAAGTGATAAGTATCCCACCTGGGGGGAGTACGTT。

5.系统发育树构建

测序结果通过EZbiocloud进行序列比对，去LPSN下载黄杆菌科的所有序列。以黄杆菌科(Flavobacterium)为本系群，白色链霉菌(Streptomyces albus)作为其外群，在黄杆菌科水平上使用软件MEGA构建其NJ系统发育树。

见图3，图4，图5，图6，图7，图8所示。

本发明所述细菌的应用为使用菌株本身促进牧草生长。

本发明所述细菌在低温条件下使用该细菌作为发酵剂应用于堆肥发酵。

本发明所述细菌的应用为施用完成发酵的堆肥促进盆栽黑麦草的生长。

本发明所述细菌发酵剂的制备方法步骤为：步骤1：将Flavobacterium sp.4.8东1-14进行活化培养：将菌种4.8东1-14在牛肉膏蛋白胨培养基上培养，15～30℃恒温培养箱中黑暗培养1-3天，获得活化后的菌株；

步骤2：将活化后的菌株进行一次发酵培养：将活化后的菌株于牛肉膏蛋白胨培养基中进行一次发酵获得种子液，培养条件为：温度为15～30℃，转速为180～240r/min下振荡发酵培养18～72h；培养结束时OD600为1.0-1.2；

步骤3：将一次发酵培养后的种子液进行二次发酵培养：将所述一次发酵培养获得的种子液以4～10wt％的接种量接种于牛肉膏蛋白胨培养基中进行二次发酵获得培养液，培养条件为：温度为15～30℃，转速为180～240r/min下振荡发酵培养18～72h制得发酵剂。

本发明所述发酵剂的使用方法为，将发酵剂均匀撒到堆肥原料上，翻拌均匀，用量为堆体质量的0.2％-4％。

配方设计：取新鲜牛粪1吨，4.8东1-14菌液20L，作物秸秆粉30kg。

建立堆体：先在地上铺一层谷草，然后将部分发酵菌液用喷壶均匀喷洒在秸秆粉上，接着覆盖一层牛粪，再铺一层秸秆粉，洒菌，再铺牛粪，重复操作，直至将菌液完全加入堆内，该操作的目的是使菌液在堆肥中分布均匀。将堆体中牛粪与谷草翻拌均匀，堆成高1.2m的四棱柱形堆体，用大棚布将其覆盖防止落入雨雪。

后续的翻堆和其他管理措施和普通堆肥相同。

本发明所述发酵剂的使用方法为，将发酵剂加入灭菌后的辅剂，低温干燥后制成菌粉，在堆肥时按比例加入至堆肥堆体中。本发明所述辅剂为麦麸。

本发明该细菌从中国东北黑龙江省鹤岗市黑土耕地表层土壤中分离得到。

本发明该细菌的培养基为牛肉膏蛋白胨培养基。

本发明该细菌能够在0℃条件下生长，且能够在堆肥中生长，用于在低温条件下启动堆肥发酵。

本发明该细菌发酵剂能用于低温堆肥发酵。

以上所述的仅是本发明的部分具体实施例(由于本发明包含数值范围，故实施例不能穷举，本发明所记载的保护范围包含本发明的数值范围和其他技术要点范围)，方案中公知的具体内容或常识在此未作过多描述(包括但不仅限于简写、缩写、本领域惯用的单位)。应当指出，上述实施例不以任何方式限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。