通过优化基因敲入与递送方式提高基因编辑效率的方法

技术领域

本发明涉及基因编辑技术领域，具体涉及一种通过优化基因敲入与递送方式提高基因编辑效率的方法。

背景技术

传统的技术由CRISPR-Cas9介导的基因组编辑技术，设计与靶标基因碱基互补配对的sgRNA 序列，sgRNA序列与PAM序列共同决定基因组上的靶点，并引导Cas9蛋白在sgRNA序列内部距离PAM元件 3’端 3 bp处切割 DNA 双链。在体外水平，稳定的慢病毒（lentivirus，LV）转染、瞬时质粒转染是通过直接DNA或RNA注射或用纯化的核糖核蛋白（ribonucleprotein complex，RNP）转染来实现，其中，慢病毒转染需要Cas9质粒与sgRNA质粒共同转染，脱靶效率高。当LV用于承载CRISPR-Cas9时，LV的整合基因组的能力会持续维持Cas9和sgRNA的表达，最终可能造成很高的脱靶效应。而瞬时质粒转染由于存在宿主细胞选择的局限性，因此存在转染效率低的问题。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种通过优化基因敲入与递送方式提高基因编辑效率的方法，可以解决转染效率低与脱靶效率高的问题，凝血酶可高度特异性结合适配体实现Cas9与donor质粒在哺乳动物细胞中连接，利用VLP打破传统基因递送方式，可快速高效，低成本的实现基因编辑技术，通过此方式可实现All in one基因编辑技术及试剂盒的开发。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

通过优化基因敲入与递送方式提高基因编辑效率的方法，包括如下步骤：

S1、根据Cas9和Thrombin的序列信息，设计并合成引物，以pCMV-MMLV-3xNES-Cas9和BIC-gag-Cas9-LgK-Thrombin为模板，PCR扩增得Cas9和Thrombin基因完整编码序列，无缝克隆获得pCMV-MMLVgag-3xNES-cas9-Thrombin质粒；

S2、根据Cherry和生物素-HA的序列信息，设计并合成引物，以plentiguide-ef-lacor-cherry-T2A-BSD和pUC-AAVSA-EGFP-210302为模板，PCR扩增得cherry和生物素-HA基因完整编码序列，无缝克隆获得pUC19-AAVS1-donor-EGFP-Puro-EF1a-cherry质粒；

S3、确定目的基因靶序列设计sgRNA，设计并合成引物，退火后通过序列两端的BsmbI粘性末端与酶切的pCDNA3.1-V5-AAVS1载体连接,构建载体pCDNA3.1-V5-AAVS1-sgRNA；

S4、HEK293T细胞汇合度达到90%时进行转染，取100uLOpti-MEM加入1.5ml的EP管中,加入pCMV-MMLVgag-3xNES-cas9-Thrombin、pUC19-AAVS1-donor-EGFP-Puro-EF1a-cherry、pCDNA3.1-V5-AAVS1-gRNA转移质粒、VSV-G包膜质粒、MLVgag-pro-pol包装质粒混匀A管；

再取100uLOpti-MEM加入1.5ml的EP管中，加入7ul的脂质体转染试剂混匀室温静止3min标B管；

将A管加入B管混匀室温放20min，取出HEK293T细胞换成新鲜10%的FBS的DMEM，逐滴加入静置好的混合物，放37度CO2培养箱培养6-8h后换液；48h后收取培养基上清；经293T包装MLV-VLP，感染哺乳动物细胞。

进一步地，所述步骤S1中，PCR扩增得到Cas9-Thrombin序列，通过酶切位点BamhI和KpnI将Cas9-Thrombin片段插入到pCMV-MMLVgag-3xNES-zsgreen,获得VLP单质粒Cas9-Thrombin载体质粒pCMV-MMLVgag-3xNES-cas9-Thrombin。

进一步地，Cas9和Thrombin的融合基因Cas9-Thrombin经过293T细胞密码子优化。

进一步地，所述步骤S2中，PCR扩增得到Cherry和生物素-HA序列，通过酶切位点KpnI将生物素-HA-Cherry片段插入到pUC-AAVS1-EGFP,获得VLP单质粒生物素-HA-Cherry载体质粒pUC19-AAVS1-donor-EGFP-Puro-EF1a-cherry。

进一步地，所述步骤S3中，通过上下游引物退火获得sgRNA序列，通过酶切位点BsmbI将sgRNA片段插入到pCDNA3.1-V5-AAVS1,获得VLP单质粒sgRNA载体质粒pCDNA3.1-V5-AAVS1-sgRNA。

进一步地，同源定向修复载体供体donor载体和生物素结合形成生物素-donor质粒经过哺乳动物细胞细胞表达特异性结合Cas9-Thrombin。

进一步地，小鼠白血病毒（MLV）的病毒样颗粒（VLP）利用逆转录衣壳蛋白(MLVgag)经哺乳动物细胞包装出MLV-VLP。

进一步地，VLP通过瞬转包装VLP及感染哺乳动物细胞完成基因敲入。

进一步地，构建pCMV-MMLVgag-3xNES-cas9-Thrombin、pUC19-AAVS1-donor-EGFP-Puro-EF1a-cherry、pCDNA3.1-V5-AAVS1-gRNA转移质粒、VSV-G包膜质粒、MLVgag-pro-pol包装质粒，HEK293T细胞汇合度达到90%时进行转染，取100uLOpti-MEM加入1.5ml的EP管中,加入pCMV-MMLVgag-3xNES-cas9-Thrombin、pUC19-AAVS1-donor-EGFP-Puro-EF1a-cherry、pCDNA3.1-V5-AAVS1-gRNA转移质粒、VSV-G包膜质粒、MLVgag-pro-pol包装质粒混匀A管。再取100uLOpti-MEM加入1.5ml的EP管中，加入7ul的脂质体转染试剂混匀室温静止3min标B管；将A管加入B管混匀室温放20min；取出HEK293T细胞换成新鲜10%的FBS的DMEM，逐滴加入静置好的混合物，放37度CO2培养箱培养6-8h后换液。48h后收取培养基上清，经293T包装MLV-VLP，感染哺乳动物细胞。

本发明具有以下有益效果：

1）.本发明利用Cas9质粒中的Thrombin可高度特异性结合生物素实现在哺乳动物细胞表达中donor质粒中的生物素，在切割的同时可准确进行敲入，大大降低脱靶率，敲入一步法可实现。

2）.本发明采用小鼠白血病毒（MLV）的病毒样颗粒（VLP）实现基因敲入，与传统病毒递送方式对比Cas9与gRNA复合物整合在基因组中存在持续切割造成基因脱靶效率高，而MLV-VLP属于瞬转不存在这个原因导致的脱靶。与传统质粒转染递送方式对比，传统转染方式存在细胞转染的局限性，转染效率存在很大差异，甚至出现无法转染现象，而MLV-VLP利用感染方式递送，可实现90%的感染效率，打破常规细胞转染不进去的缺陷，提高了基因编辑效率，缩短工作时间，降低成本。

3）.传统基因编辑技术每更换一个靶标基因需从头开始实验，耗时长，成本高，效率低，而本发明可借助Thrombin与生物素作用实现基因敲入与敲除一体化(All in one)，再借助MLV-VLP实现高效率递送提高编辑效率，借助以上优势组装成基因编辑试剂盒，可实现快速高效，低成本及简便化基因编辑。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为pCMV-MMLVgag-3xNES-cas9-Thrombin载体结构图谱；

图2为pUC19-AAVS1-donor-EGFP-Puro-EF1a-cherry载体结构图谱；

图3为pCDNA3.1-V5-AAVS1-sgRNA载体结构图谱。

图4为VLP感染NK92的照片。

图5为VLP感染A459细胞。

图6为AAVS1测序双峰图。

图7为碱基序列对比图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1

材料：

载体购于System Biosciences公司。DH5α感受态细胞购于北京全式金生物技术公司。Lipofectamine 3000转染试剂购自Thermo Fisher Scientific公司。PCR酶、限制性内切酶和无缝克隆酶等购自Takara（大连）公司。

LB液体培养基配方（1 L）：胰蛋白胨 10g；酵母提取物 5g；NaCl 10g。加1 L ddH2O搅拌至完全溶解，高压灭菌。

LB固体培养基配方（1 L）：胰蛋白胨 10g；酵母提取物 5g；NaCl 10g。加1 L ddH2O搅拌至完全溶解，高压灭菌。

氨苄青霉素（100 mg/mL）:1 g溶于10 mL ddH2O，0.22 μm滤器过滤除菌。

方法：

S1、构建载体pCMV-MMLVgag-3xNES-cas9-Thrombin

1）设计并合成以下引物：

F1: 5’-aattcctcgagggccggatccGAATTCCTGTATTTGTCTGAA-3’

R1: 5’-TGACCCCCCGCTGACT-3’

F2:5’-ggaaagtcagcggggggtcaATGGAGACAGACACACTCCT-3’

R2:5’-gcctgcacctgaggatgcaggtaccAGCCTGCACCTGAGGAT-3’

以质以pCMV-MMLV-3xNES-Cas9和BIC-gag-Cas9-LgK-Thrombin为模板，使用该引物对进行PCR反应获得Cas9-Thrombin片段。核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

2)PCR反应条件为：95 ℃， 3 min; 95 ℃, 30 Sec, 57 ℃, 30 Sec, 72 ℃ 1min，25个循环；72 ℃，3 min。胶回收Cas9-MSA产物。使用BamH1和Kpn1酶切割1 μg的pCMV-MMLVgag-3xNES-zsgreen质粒，胶回收酶切产物。

3)酶切后回收的pCMV-MMLVgag-3xNES-zsgreen骨架载体与片段按照1：5的摩尔比无缝克隆。

4)连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布含100 μg/mL氨苄青霉素的LB平板，37 ℃过夜培养，挑取单克隆进行扩大培养和质粒提取。

5)提取的质粒进行电泳鉴定，结果见。电泳检测阳性的质粒进行DNA测序，验证序列方向和核苷酸准确性。

S2、构建载体pUC19-AAVS1-donor-EGFP-Puro-EF1a-cherry

1）设计并合成以下引物：

F1: 5’-agcaggcatgctggggaACTCGAGgggcagagcgcacatc-3’；

R1: 5’-ggcaactagaaggcacagtAGATCTTTACTTGTACAGCTCGTCCA-3’

F2:5’-CTGTGCCTTCTAGTTGCC-3’

R2:5’-GGCCAGTGAATTCGAGCTCGGTACCagagcagagccaggaaccc-3’。

以质以pCMV-MMLVgag-3xNES-Cas9和plentiGuide-ef-1acor-mCherry-T2A-BSD为模板，使用该引物对进行PCR反应获得生物素-HA-Cherry片段。核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

2)PCR反应条件为：95 ℃， 3 min; 95 ℃, 30 Sec, 57 ℃, 30 Sec, 72 ℃ 1min，25个循环；72 ℃，3 min。胶回收Cas9-MSA产物。使用Kpn1酶切割1 μg的pUC-AAVS1-EGFP-210302质粒，胶回收酶切产物。

3)酶切后回收的pUC-AAVS1-EGFP-210302骨架载体与片段按照1：5的摩尔比无缝克隆。

4)连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布含100 μg/mL氨苄青霉素的LB平板，37 ℃过夜培养，挑取单克隆进行扩大培养和质粒提取。

5)提取的质粒进行电泳鉴定，电泳检测阳性的质粒进行DNA测序，验证序列方向和核苷酸准确性。

S3、构建载体pCDNA3.1-V5-AAVS1-sgRNA

1）设计并合成以下引物：

F1: 5’-Caccgggggccactagggacaggat-3’；

R1: 5’-aaacatcctgtccctagtggcccc-3’；

上下游引物进行退火，反应条件为37 ℃， 30 min; 95 ℃,5 min; 95 ℃,缓慢降至室温，稀释退火后的oligo，按照1：200用ddH2O稀释待用。

2）使用BsmbI酶切割1 μg的pCDNA3.1-V5-AAVS1骨架载体，胶回收酶切产物。gRNA和线性化pCDNA3.1-V5-AAVS1骨架载体按照1：5的摩尔比连接。

3）连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布含100 μg/mL氨苄青霉素的LB平板，37 ℃过夜培养，挑取单克隆进行扩大培养和质粒提取。

4）提取的质粒进行电泳鉴定，电泳检测阳性的质粒进行DNA测序，验证序列方向和核苷酸准确性。pCDNA3.1-V5-AAVS1-sgRNA完整序列如SEQ.ID.NO.3所示。

S5、无内毒素大量提取pCMV-MMLVgag-3xNES-cas9-mSA、pUC19-AAVS1-donor-EGFP-Puro-EF1a-cherry、pCDNA3.1-V5-AAVS1-sgRNA质粒；

1)取测序验证正确的pCMV-MMLVgag-3xNES-cas9-Thrombin、pUC19-AAVS1-donor-EGFP-Puro-EF1a-cherry、pCDNA3.1-V5-AAVS1-sgRNA菌液200微升，接种至含100 μg/mL氨苄青霉素的100 mL LB液体培养基中，37℃摇床过夜培养。

2)无内毒素质粒大提试剂盒中培养的菌液中的pCMV-MMLVgag-3xNES-cas9-Thrombin、pUC19-AAVS1-donor-EGFP-Puro-EF1a-cherry、pCDNA3.1-V5-AAVS1-sgRNA质粒，测定浓度。

S6、目的基因表达和敲低效率验证

1)将HEK293T细胞按适当浓度传代到60 mm培养皿中，转染时细胞密度在60-70%。

2)用lipofectamine 3000转染试剂将pCMV-MMLVgag-3xNES-cas9-Thrombin、pUC19-AAVS1-donor-EGFP-Puro-EF1a-cherry、pCDNA3.1-V5-AAVS1-sgRNA、VSV-G、pCMC-gag-pol质粒转染293T细胞。

3)转染48小时后，收集上清，5000转离心5min，0.45um过虑。

4)超虑管浓缩上清液，盲接于靶细胞观察感染后是否出现绿色应该，出现荧光说明包装成功，见图4图5。如图4所示，用包装的VLP上清感染NK92细胞后在荧光显微镜下可观察到荧光，说明VLP包装成功并可以感染哺乳动物细胞。如图5所示，用包装的VLP上清感染A459细胞后在荧光显微镜下可观察到荧光，说明VLP包装成功并可以感染哺乳动物细胞。

5)48小时后收取细胞检测敲入效率可通过测序检测目的条带，结果如图6和图7所示，图6为AAVS1测序双峰图，图中框内区域为gRNA处。图7为碱基序列对比图，图中框内区域为gRNA 双峰处。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。