一种制备右旋糖酐蔗糖酶的方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵领域，尤其涉及一种制备右旋糖酐蔗糖酶的方法。

背景技术

右旋糖酐蔗糖酶又名葡萄糖基转移酶(Glucosyltransferase)和葡聚糖蔗糖酶(Glucansucrases)，属于糖苷水解酶，它能够以蔗糖为底物合成不同结构的右旋糖酐。右旋糖酐蔗糖酶可用于医药、食品等领域，如防治龋齿、酶解高分子右旋糖酐制备血浆代用品等。该酶多由肠膜状明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)和链球菌(Streptococcussp.)及乳酸杆菌(Lactobacillus sp.)产生。

右旋糖酐蔗糖酶目前主要用来制备右旋糖酐，右旋糖酐能改善微循环，消除血管内红细胞聚集，防止血栓形成及渗透利尿的作用，可用于治疗急性失血性休克、心肌梗塞、脑血栓、脑供不足、周围血管病及防止弥散性血管内凝血和肾功能衰竭等功效，广泛应用于医药、食品、化工等行业。利用固定化右旋糖酐蔗糖酶可以合成一些功能性低聚糖，这些糖常作为益生元广泛应用于食品行业。

目前制备右旋糖酐蔗糖酶主要利用肠膜状明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)发酵得到。因为培养肠膜状明串珠菌的碳源与右旋糖酐蔗糖酶反应的底物为同一种物质即蔗糖，导致在培养过程中随着右旋糖酐蔗糖酶的出现也生成了右旋糖酐，右旋糖酐与酶缠绕在一起很难分离，导致发酵液的粘度较大，难以获得游离酶，影响酶活性，因此，如何获得活性较高的右旋糖酐蔗糖酶是本领域亟需解决的问题。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种制备右旋糖酐蔗糖酶的方法，在肠膜状明串珠菌发酵过程中添加裂褶多糖，制备的右旋糖酐蔗糖酶活力高。

本发明的目的采用如下技术方案实现：

一种制备右旋糖酐蔗糖酶的方法：包括以下步骤：将活化的肠膜状明串珠菌体接种至发酵培养基中，培养10-15h后向发酵培养基中添加裂褶多糖，所述裂褶多糖在培养基中的浓度为1-5mmoL/L，继续培养20-25h，结束发酵培养，离心后取上清液，经超滤后得到右旋糖酐蔗糖酶液。

优选的，所述裂褶多糖的平均分子量为10-50KD。

优选的，所述发酵培养基的成分为：蔗糖5-10％、牛肉膏0.02-0.04％、磷酸氢二钠0.1-0.3％、磷酸氢二钾0.1-0.3％、硫酸镁0.05-0.1％、余量为水。

优选的，所述肠膜状明串珠菌为肠膜状明串珠菌Lm-1226。

优选的，所述肠膜状明串珠菌体的体积为所述发酵培养基的2-5％。

优选的，所述发酵培养基的pH为7.5-8.0。

优选的，发酵培养温度为：25-30℃。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明提供一种制备右旋糖酐蔗糖酶的方法，先在发酵培养基中将肠膜状明串珠菌发酵培养一段时间，然后加入裂褶多糖，继续发酵培养，添加的裂褶多糖可以提高最终发酵液中游离右旋糖酐蔗糖酶的含量和酶活力，提高右旋糖酐蔗糖酶的产量，降低生产成本。

具体实施方式

下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。

实施例1

一种制备右旋糖酐蔗糖酶的方法：包括以下步骤：将活化的肠膜状明串珠菌体Lm-1226接种至发酵培养基中，肠膜状明串珠菌体Lm-1226的体积为所述发酵培养基的2％，所述发酵培养基的pH为7.5，发酵培养基的成分为：蔗糖5％、牛肉膏0.02％、磷酸氢二钠0.1％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.05％、余量为水；在25℃培养10h后向发酵培养基中添加平均分子量为10KD裂褶多糖，所述裂褶多糖在培养基中的浓度为1mmoL/L，继续培养20h，结束发酵培养，离心后取上清液，经超滤后得到右旋糖酐蔗糖酶液。

实施例2

一种制备右旋糖酐蔗糖酶的方法：包括以下步骤：将活化的肠膜状明串珠菌体Lm-1226接种至发酵培养基中，肠膜状明串珠菌体Lm-1226的体积为所述发酵培养基的3％，所述发酵培养基的pH为7.7，发酵培养基的成分为：蔗糖8％、牛肉膏0.03％、磷酸氢二钠0.2％、磷酸氢二钾0.2％、硫酸镁0.08％、余量为水；在28℃培养12h后向发酵培养基中添加平均分子量为30KD裂褶多糖，所述裂褶多糖在培养基中的浓度为3mmoL/L，继续培养23h，结束发酵培养，离心后取上清液，经超滤后得到右旋糖酐蔗糖酶液。

实施例3

一种制备右旋糖酐蔗糖酶的方法：包括以下步骤：将活化的肠膜状明串珠菌体Lm-1226接种至发酵培养基中，肠膜状明串珠菌体Lm-1226的体积为所述发酵培养基的5％，所述发酵培养基的pH为8.0，发酵培养基的成分为：蔗糖10％、牛肉膏0.04％、磷酸氢二钠0.3％、磷酸氢二钾0.3％、硫酸镁0.1％、余量为水；在30℃培养15h后向发酵培养基中添加平均分子量为50KD裂褶多糖，所述裂褶多糖在培养基中的浓度为5mmoL/L，继续培养25h，结束发酵培养，离心后取上清液，经超滤后得到右旋糖酐蔗糖酶液。

对比例1

一种制备右旋糖酐蔗糖酶的方法，包括以下步骤：将活化的肠膜状明串珠菌体Lm-1226接种至发酵培养基中，肠膜状明串珠菌体Lm-1226的体积为所述发酵培养基的2％，所述发酵培养基的pH为7.5，发酵培养基的成分为：蔗糖5％、牛肉膏0.02％、磷酸氢二钠0.1％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.05％、余量为水；25℃连续培养30h，结束发酵，离心后取上清液，经超滤后得到右旋糖酐蔗糖酶液。

对比例2

一种制备右旋糖酐蔗糖酶的方法，包括以下步骤：将活化的肠膜状明串珠菌体Lm-1226接种至发酵培养基中，肠膜状明串珠菌体Lm-1226的体积为所述发酵培养基的2％，调节发酵培养基的pH为7.5，发酵培养基的成分为：蔗糖5％、牛肉膏0.02％、磷酸氢二钠0.1％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.05％、余量为水，向发酵培养基中添加平均分子量为10KD裂褶多糖，裂褶多糖在培养基中的浓度为1mmoL/L，在25℃培养30h，结束发酵培养，离心后取上清液，经超滤后得到右旋糖酐蔗糖酶液。

对比例3

一种制备右旋糖酐蔗糖酶的方法，包括以下步骤：将活化的肠膜状明串珠菌体Lm-1226接种至发酵培养基中，肠膜状明串珠菌体Lm-1226的体积为所述发酵培养基的2％，所述发酵培养基的pH为7.5，发酵培养基的成分为：蔗糖5％、牛肉膏0.02％、磷酸氢二钠0.1％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.05％、余量为水；在25℃培养10h后向发酵培养基中添加平均分子量为5KD裂褶多糖，所述裂褶多糖在培养基中的浓度为1mmoL/L，继续培养20h，结束发酵培养，离心后取上清液，经超滤后得到右旋糖酐蔗糖酶液。

对比例4

一种制备右旋糖酐蔗糖酶的方法，包括以下步骤将活化的肠膜状明串珠菌体Lm-1226接种至发酵培养基中，肠膜状明串珠菌体Lm-1226的体积为所述发酵培养基的2％，所述发酵培养基的pH为7.5，发酵培养基的成分为：蔗糖5％、牛肉膏0.02％、磷酸氢二钠0.1％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.05％、余量为水；在25℃培养10h后向发酵培养基中添加平均分子量为60KD裂褶多糖，所述裂褶多糖在培养基中的浓度为1mmoL/L，继续培养20h，结束发酵培养，离心后取上清液，经超滤后得到右旋糖酐蔗糖酶液。

分别取实施例1至3，对比例1至4中的右旋糖酐蔗糖酶液1mL，加入质量浓度5％的蔗糖溶液2mL混合反应30min，取出200微升加入130微升DNS试剂，沸水加热5min，冷却至室温后加入蒸馏水，在波长520nm处测吸光度，以灭菌后的酶液与底物反应作为对照，每分钟催化蔗糖产生1μmoL果糖所需要的的酶量定义为一个酶活力单位，检测各组的酶活力，结果如表1所示。

表1

由表1可以看出实施例1至3中的右旋糖酐蔗糖酶活力较高，对比例1至4中酶活力均有不同程度的下降。其中对比例1中不添加裂褶多糖，右旋糖酐蔗糖酶活力最低。对比例2中改变了裂褶多糖的添加时机，右旋糖酐蔗糖酶活力不及实施例1。对比例3和对比例4中改变了添加的裂褶多糖的分子量，右旋糖酐蔗糖酶活力优于其他对比例，但是不及实施例1，由此可知，在右旋糖酐蔗糖酶的制备过程中添加平均分子量10-50KD的裂褶多糖可以显著提高右旋糖酐蔗糖酶的产量。

将实施例1制备的右旋糖酐蔗糖酶用于制备右旋糖酐，过程如下：取实施例1中的右旋糖酐蔗糖酶液以1:3的体积比和蔗糖反应体系混合，蔗糖反应体系的组成为：醋酸钠0.70g/L、氯化钙0.025g/L，蔗糖230g/L，用盐酸调节pH为5.4，在30℃，反应1h，将反应液经过滤、超滤后用无水乙醇醇沉淀，真空冷冻干燥，得到右旋糖酐，经计算得到摩尔转化率为80％，所制备的右旋糖酐的平均分子量为3000-4000kDa。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。