AtLecRK-VI.1基因及其编码蛋白在调控植物根长中的应用

技术领域

本申请涉及生物技术和育种领域，尤其涉及一种AtLecRK-VI.1基因及其编码蛋白在调控植物根长中的应用。

背景技术

根是高等植物的重要器官，不仅对植物体具有机械支撑作用，而且在植物体从土壤中吸收正常生命活动所需水分和矿物质营养的过程中起到关键作用。根系的发育状况直接影响着植物体的生长状况，在农业生产实践中十分关键，因此对根系发生和发育的研究既具有理论价值，也具有实践意义。

类受体激酶(Receptor-like kinases,RLKs)是一种普遍存在于植物体内的蛋白，能够感知和传递各种胞外信号。大部分类受体激酶属于细胞质膜蛋白，主要功能是通过其细胞外配体识别结构域和细胞内激酶结构域分别识别和传递各种信号，最终产生一系列细胞应答。凝集素类受体激酶(Lectin receptor-like kinases,LecRLKs)是类受体激酶家族中的一个亚族，主要包含凝集素结构域、跨膜结构域和激酶结构域。目前，虽有凝集素类受体激酶被报道参与生物/非生物胁迫响应和植物发育调控，但关于该类激酶参与调控植物根长发育还鲜有报道。

发明内容

本申请目的在于提供AtLecRK-VI.1基因的应用，通过对AtLecRK-VI.1基因的生物学功能的研究，发现AtLecRK-VI.1基因在拟南芥根长上具有调控作用，通过敲除该基因片段并获得相应的突变拟南芥植株，该突变拟南芥植株的根长较野生植株的根长明显降低，对研究拟南芥根长调节乃至植物根长调节具有重要意义。

第一方面，本申请提供AtLecRK-VI.1基因在调控植物根长上的应用，其中，AtLecRK-VI.1基因的核苷酸序列包括如下核苷酸序列中的一种：

(1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

(2)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能蛋白的编码核苷酸序列；

(3)在严格条件下可以与如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。

第二方面，本申请提供AtLecRK-VI.1蛋白在调控植物根长上的应用，其中，AtLecRK-VI.1蛋白包括如下蛋白中的一种：

(1)如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；

(2)如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、插入或缺失得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；(其中的所述多个为≤10)

(3)与如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列；优选地，所述同源性为至少90％；更优选为95％。

如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列为AtLecRK-VI.1蛋白的氨基酸序列，本领域技术人员可根据如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列以及氨基酸的保守性替换等本领域常规技术手段，在不影响其活性的前提下，通过取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸(几个为≤10)，得到与如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的AtLecRK-VI.1蛋白突变体。

第三方面，本申请提供一种调控拟南芥根长的方法，突变拟南芥中AtLecRK-VI.1基因，进而获得突变体植株。

优选的，构建AtLecRK-VI.1基因的CRISPR/Cas9敲除载体并转化拟南芥植株。

优选的，所述CRISPR/Cas9敲除载体为pHEE401E-AtLecRK-VI.1。

优选的，所述pHEE401E-AtLecRK-VI.1敲除载体的构建包括以下步骤：

S1.针对核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的AtLecRK-VI.1基因选择靶位点并设计PCR引物，采用三引物法进行PCR扩增，获得含所述靶位点序列的线性DNA片段；

S2.将上述线性DNA片段连入pHEE401E载体，构建得到pHEE401E-AtLecRK-VI.1敲除载体。

优选的，步骤S1中所述靶位点的序列为：5'-GTCGAGTGCTCACTATGTAA-3'。

优选的，步骤S1中采用的三引物分别为：AtLecRK-VI.1-BsF：5'-ATATATGGTCTCGATTGTCGAGTGCTCACTATGTAAGTT-3'；AtLecRK-VI.1-F0：5'-TGTCGAGTGCTCACTATGTAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3'；BsR：5'-ATTATTGGTCTCGAAACAATCTCTTAGTCGACTCTACCAAT-3'。

第四方面，本申请提供一种采用上述方法获得的拟南芥在植物育种中的应用，其中育种方法包括转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。

第五方面，本申请提供AtLecRK-VI.1基因的CRISPR/Cas9敲除载体或质粒在调控植物根长中的应用。

借由上述技术方案，本申请至少具有下列优点及有益效果：

本申请通过基因敲除实验验证了AtLecRK-VI.1基因的在调控上植物根长上的功能；通过构建CRISPR/Cas9基因敲除载体转化拟南芥，获得突变体植株，突变体植株根长与野生型植株相比显著性降低，表明AtLecRK-VI.1基因具有调控植物根长的功能，本申请首次揭示了AtLecRK-VI.1基因于调控植物根长上的生物学功能，为阐明根长这一农艺性状相关的分子机制提供了新的思路，为进一研究植物根系性状改良奠定理论基础，同时也为根系性状改良提供了潜在的新基因资源。

附图说明

图1是AtLecRK-VI.1基因敲除表达载体的靶位点。(红色三角形指示靶位点)

图2是T2代突变株系的突变位点序列分析。(青色底纹标记靶位点序列；紫红色底纹标记不同突变体株系的突变序列)

图3是AtLecRK-VI.1敲除突变体拟南芥植株根长表型图。

其中，A：生长10天的AtLecRK-VI.1敲除突变体株系根长表型。(标尺：1cm)

B：生长10天的AtLecRK-VI.1敲除突变体株系根长长度统计。

(AtLecRK-VI.1-3和AtLecRK-VI.1-10表示获得的敲除突变体不同株系，WT表示野生型对照)

具体实施方式

为使本申请的目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合实施例对本申请的具体实施方式做详细的说明。以下给出了本申请的若干实施例。但是，本申请可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本申请的公开内容更加透彻全面：

对序列表的说明：对序列表的说明：

序列表SEQ ID NO:1是AtLecRK-VI.1基因的CDS序列，序列长度为2145bp。

序列表SEQ ID NO:2是AtLecRK-VI.1基因编码的蛋白质序列，序列长度为714个氨基酸。

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本申请，但实施例并不对本申请做任何形式的限定。

pCBC-DT1T2和pHEE401E载体来自于中国农业大学生物学院陈其军教授馈赠(WangZP,Xing HL,Dong L,Zhang HY,Han CY,Wang XC,Chen QJ.Egg cell-specific promoter-controlled CRISPR/Cas9 efficiently generates homozygous mutants for multipletarget genes in Arabidopsis in a single generation.Genome Biol.2015,16(1):144)。

除非特别说明，本申请采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1：凝集素类受体激酶基因AtLecRK-VI.1敲除转基因拟南芥的获得

1、CRISPR/Cas9拟南芥敲除载体的构建

利用CRISPR靶位点设计网站(http://skl.scau.edu.cn/targetdesign/)设计靶位点，用于构建单靶点敲除载体，如图1所示，对应引物为：

AtLecRK-VI.1-BsF(SEQ ID NO.3)：5'-ATATATGGTCTCGATT

(1)PCR扩增：以稀释100倍的pCBC-DT1T2(含gRNA)为模板进行三引物PCR扩增，获取PCR片段(靶点+gRNA)。AtLecRK-VI.1-BsF和BsR为正常引物浓度；AtLecRK-VI.1-F0稀释20倍。

PCR扩增条件是：94℃预变性3min；98℃变性30s，61℃退火30s，68℃延伸1min，30个循环；68℃延伸5min。

(2)纯化回收PCR产物后采用如下酶切-连接方法克隆：

反应条件：5hours at 37℃；5min at 50℃；10min at 80℃

(3)转化大肠杆菌及质粒测序：将上述连接产物转化到DH5α感受态中，涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基上，37℃过夜培养。挑取平板上单菌落，用引物U626-IDF和U629-IDR序列在PCR中扩增，电泳出现目的条带后送往广州睿博生物技术有限公司进行测序验证，获得阳性菌株。提取质粒。菌落用U626-IDF和U629-IDR进行PCR扩增，得到726bp的条带；U626-IDF用于测序。引物序列如下：

U626-IDF(SEQ ID NO.6)：5'-TGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC-3'；

U629-IDR(SEQ ID NO.7)：5'-AGCCCTCTTCTTTCGATCCATCAAC-3'。

2、农杆菌介导的拟南芥CRISPR/Cas9敲除载体的转化

用含有敲除载体的农杆菌转化野生型Col-0花序，成熟后收种T0代种子。

(1)组培筛选：用无菌水清洗T0代种子1遍后加入75％乙醇清洗1min；用清水清洗3遍后加入3％NaClO溶液摇10min，220rpm。无菌水漂洗5～8次后铺于含有潮霉素的1/2MS培养基中，吹干后置于23℃，光周期为16小时光照/8小时黑暗的培养箱中生长。

(2)移苗：种子在含潮霉素的1/2MS培养基上生长7-10d，若转化成功，则在培养基上长出转基因抗性幼苗，此时可将幼苗移栽到温室。

3、转基因阳性拟南芥株系检测及突变植株的筛选

利用农杆菌介导的拟南芥花序侵染转基因法，转化Col-0野生型，通过潮霉素选择，获得11株独立的转化株系。CTAB法提取拟南芥叶片的总DNA，使用2×Taq Master Mix和潮霉素检测引物Hyg-F、Hyg-R按如下体系进行PCR扩增，检测引物Hyg-F、Hyg-R的序列为：

Hyg-F(SEQ ID NO.8)：5'-TGAACTCACCGCGACGTCTGT-3'；

Hyg-R(SEQ ID NO.9)：5'-CGGCGAGTACTTCTACACAG-3'。PCR反应体系如下：

PCR程序设置：94℃3min；94℃10s，58℃15s，72℃1min，72℃7min。第二步进行30个循环。PCR结束后对扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，观察每个植株对应的扩增结果是否产生一条968bp的条带，如果产生目的条带，则说明敲除载体已整合至该模版DNA对应植株的染色体上。用潮霉素特异引物检测T0转基因植株，获得转基因阳性单株9株。

鉴定突变体植株的类型，在靶位点序列上下游位置使用Primer Premier 5设计了突变体检测引物AtLecRK-VI.1-F、AtLecRK-VI.1-R，其序列分别为：

AtLecRK-VI.1-F(SEQ ID NO.10)：5'-AGAGCGGCGAACCAATCCGAGT-3'；

AtLecRK-VI.1-R(SEQ ID NO.11)：5'-TCAATCTCCCAATCCTCTAGAG-3'。提取阳性植株的DNA，使用2×Taq Master Mix和引物AtLecRK-VI.1-F、AtLecRK-VI.1-R按下列体系进行PCR反应：

PCR程序设置：94℃3min；94℃10s，56℃15s，72℃1min，72℃7min。第二步进行30个循环。PCR产物送往广州睿博生物技术有限公司测序；突变体和野生型的测序结果用Snapgene软件进行序列比对。如图2，成功获得AtLecRK-VI.1基因的2个纯合突变株AtLecRK-VI.1-3和AtLecRK-VI.1-10，其中AtLecRK-VI.1-2缺失4个碱基，AtLecRK-VI.1-10缺失1个碱基。

实施例2：AtLecRK-VI.1基因敲除突变体根长表型观察

对AtLecRK-VI.1基因敲除拟南芥株系及野生型对照进行根长分析。结果显示，本申请的AtLecRK-VI.1基因敲除拟南芥株系与野生型(WT)相比，AtLecRK-VI.1基因敲除拟南芥株系2和10的植株根长均显著性短于野生型对照(图3)。该结果表明，AtLecRK-VI.1基因敲除拟南芥株系可以减短根长。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互结合。

以上所述仅是对本申请的较佳实施例而已，并非对本申请作任何形式上的限制，凡是依据本申请的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本申请技术方案的范围。