细胞培养用微载体、其生产方法及使用其的细胞培养组合物

技术领域

相关申请的交叉引用

本申请要求于2021年9月28日提交的韩国专利申请第10-2021-0128333号和于2022年9月6日提交的韩国专利申请第10-2022-0112921号的权益，其全部内容通过引用并入本文。

本发明涉及细胞培养用微载体、用于生产其的方法和使用其的细胞培养组合物。

背景技术

随着生物制药和再生医学领域发展，对能够有效地生产细胞、组织、微生物等的大规模细胞培养技术的需求正在增长。

贴壁细胞在3D生物反应器中使用微载体培养。将细胞、培养基和微载体放入生物反应器中，并搅动培养基以使细胞与微载体接触，使得细胞粘附在微载体的表面上并进行培养。由于此时使用的微载体提供了细胞可以附着并生长的高表面积/体积比，因此其适合于细胞的大规模培养。

目前市售的微载体具有约1.1g/cm

因此，需要开发这样的新的微载体：其具有低密度以便实现细胞培养，并且在细胞培养之后对微载体和细胞进行分离并回收时也可以更容易地分离。

发明内容

技术问题

本发明的一个目的是提供这样的细胞培养用微载体：其具有低密度以便实现细胞培养，并且在细胞培养之后对微载体和细胞进行分离并回收时也可以更容易地分离。

本发明的另一个目的是提供用于生产所述细胞培养用微载体的方法。

本发明的又一个目的是提供使用所述细胞培养用微载体的细胞培养组合物。

技术方案

为了实现以上目的，本文提供了细胞培养用微载体，其包含基于聚苯乙烯的颗粒，所述基于聚苯乙烯的颗粒包含：具有12个或更多个碳原子的烃油或由其产生的空隙中的至少一者；以及磁性颗粒。

本文还提供了用于生产细胞培养用微载体的方法，所述方法包括以下步骤：使包含磁性颗粒和苯乙烯单体的单体组合物在具有12个或更多个碳原子的烃油的存在下进行悬浮聚合反应。

本文还提供了包含细胞和细胞培养用微载体的细胞培养组合物。

将在下面更详细地描述根据本发明的具体实施方案的细胞培养用微载体、用于生产其的方法和使用其的细胞培养组合物。

除非本文明确说明，否则本文使用的技术术语仅用于描述具体实施方案的目的，并且不旨在限制本发明的范围。

除非上下文另外明确指出，否则本文使用的单数形式“一个/一种”和“所述”旨在包括复数形式。

应理解，术语“包含”、“包括”、“具有”等在本文用于指定存在所述特征、区域、整数、步骤、动作、要素和/或组成部分，但不排除存在或添加一种或更多种其他特征、区域、整数、步骤、动作、要素、组成部分和/或组。

此外，包括序数例如“第一”、“第二”等的术语仅用于区分一个组成部分与另一组成部分的目的，并且不受序数限制。例如，在不脱离本发明的范围的情况下，第一组成部分可以被称为第二组成部分，或者类似地，第二组成部分可以被称为第一组成部分。

现在，将更详细地描述本发明。

根据本发明的一个实施方案，可以提供细胞培养用微载体，其包含基于聚苯乙烯的颗粒，所述基于聚苯乙烯的颗粒包含：具有12个或更多个碳原子的烃油或由其产生的空隙中的至少一者；以及磁性颗粒。

本发明人通过实验发现，在细胞培养用微载体的情况下，由于具有12个或更多个碳原子的烃油或由其产生的空隙中的至少一者包含在基于聚苯乙烯的颗粒的内部，因此不仅可以降低细胞培养用微载体的密度，而且还可以在高产率下确保均匀的球形微载体，并完成了本发明。

本发明人还通过实验发现，由于细胞培养用微载体包含磁性颗粒，因此在细胞培养之后对微载体和细胞进行分离并回收时，利用磁力可以更容易地进行分离和纯化，并完成了本发明。

具体地，细胞培养用微载体可以包含基于聚苯乙烯的颗粒，所述基于聚苯乙烯的颗粒包含：具有12个或更多个碳原子的烃油或由其产生的空隙中的至少一者；以及磁性颗粒。即，基于聚苯乙烯的颗粒可以包含一种类型的具有12个或更多个碳原子的烃油、一种类型的由具有12个或更多个碳原子的烃油产生的孔、或这两种类型的混合物。

当基于聚苯乙烯的颗粒包含一种类型的由具有12个或更多个碳原子的烃油产生的空隙，或者包含具有12个或更多个碳原子的烃油和由具有12个或更多个碳原子的烃油产生的空隙二者时，基于聚苯乙烯的颗粒可以对应于多孔基于聚苯乙烯的颗粒。

以与稍后描述的另一个实施方案的基于聚苯乙烯的颗粒的生产方法中相同的方式，在烃油的存在下进行悬浮聚合以合成基于聚苯乙烯的颗粒，使得烃油继续保持被截留在聚苯乙烯颗粒内部，或者在高速悬浮聚合和搅拌的条件下，被截留烃油中的部分或全部可以逃逸从而在聚苯乙烯颗粒内部形成空隙。

空隙是指基于聚苯乙烯的颗粒内部的空的空间，并且可以用于意指孔、空心、洞、空隙等。

空隙可以由具有12个或更多个碳原子的烃油产生。具体地，空隙对应于在悬浮聚合期间具有12个或更多个碳原子的烃油与聚苯乙烯相分离时所形成的空间。

因此，“基于聚苯乙烯的颗粒仅包含一种类型的具有12个或更多个碳原子的烃油”意指烃油在聚合过程期间已经完全相分离，但在聚合和洗涤过程期间未消失至颗粒的外部，以及“基于聚苯乙烯的颗粒仅包含一种类型的由具有12个或更多个碳原子的烃油产生的孔”意指烃油在聚合过程期间已经完全相分离，但在聚合和洗涤过程期间消失至颗粒的外部。此外，“基于聚苯乙烯的颗粒包含具有12个或更多个碳原子的烃油和由具有12个或更多个碳原子的烃油产生的空隙二者”意指烃油在聚合过程期间部分地相分离和消失，并且其部分保留。

具体地，空隙的直径可以为0.1μm或更大且5μm或更小。更具体地，空隙的直径可以为0.1μm或更大、0.5μm或更大、1μm或更大、且5μm或更小、4μm或更小、3μm或更小，并且具体地，其可以为0.1μm或更大且5μm或更小、0.5μm或更大且5μm或更小、1μm或更大且5μm或更小、0.1μm或更大且4μm或更小、0.5μm或更大且4μm或更小、1μm或更大且4μm或更小、0.1μm或更大且3μm或更小、0.5μm或更大且3μm或更小、或者1μm或更大且3μm或更小。

用于测量空隙的直径的方法没有特别限制，但是例如，在将细胞培养用微载体包埋在环氧树脂中之后，通过离子研磨制备截面，然后可以用SEM确定颗粒截面的形状以测量颗粒内部空隙的直径。

如上所述，由于空隙由具有12个或更多个碳原子的烃油产生，因此空隙的直径可以实现0.1μm或更大且5μm或更小的小尺寸孔，这使得可以容易地调节微载体的密度。

常规地，为了降低聚苯乙烯颗粒的密度，通过在聚苯乙烯聚合过程期间添加低沸点发泡剂，然后进行另外的发泡过程来生产泡沫苯乙烯，但在这样的情况下，形成了尺寸为数十μm的大空隙，这使得难以调节微载体的密度。

烃油的碳数可以为12或更大、或者12或更大且50或更小、或者12或更大且16或更小。当烃油的碳数过度减小至小于12时，存在的限制在于在悬浮聚合期间烃油与聚苯乙烯之间的相分离率降低，使得颗粒表面不均匀，并且产生大量凹状颗粒。

具体地，烃油可以包含具有12个或更多个且50个或更少个碳原子的线性或支化饱和烃化合物。具有12个或更多个碳原子且50个或更少个碳原子的线性或支化饱和烃化合物可以单独使用或组合使用。具有12个或更多个且50个或更少个碳原子的线性或支化饱和烃化合物的实例包括具有12至16个碳原子的正烷烃、具有12至16个碳原子的异烷烃、或其混合物。

更具体地，作为烃油，可以使用具有12个碳原子的十二烷、具有16个碳原子的十六烷、或Isopar M(具有12个或更多个且14个或更少个碳原子的异烷烃和具有13个或更多个且16个或更少个碳原子的异烷烃的混合物)。

相对于包含苯乙烯单体的分散相组合物的总重量(100重量％)，烃油可以以30重量％或更少、或者10重量％或更多且30重量％或更少的量包含在内。具体地，烃油的含量的下限可以为10重量％或更多、或者11重量％或更多、或者12重量％或更多、或者13重量％或更多、或者14重量％或更多，以及其上限可以为例如30重量％或更少、或者25重量％或更少、或者21重量％或更少。

更具体地，相对于包含苯乙烯单体的分散相组合物的总重量(100重量％)，烃油可以以以下量包含在内：10重量％或更多且30重量％或更少、11重量％或更多且30重量％或更少、12重量％或更多且30重量％或更少、13重量％或更多且30重量％或更少、14重量％或更多且30重量％或更少、10重量％或更多且25重量％或更少、11重量％或更多且25重量％或更少、12重量％或更多且25重量％或更少、13重量％或更多且25重量％或更少、14重量％或更多且25重量％或更少、10重量％或更多且20重量％或更少、11重量％或更多且20重量％或更少、12重量％或更多且20重量％或更少、13重量％或更多且20重量％或更少、或者14重量％或更多且20重量％或更少。

当烃油的含量低于所述含量范围使用时，难以确保具有低密度特性的载体颗粒，而当含量范围过度超过时，基于聚苯乙烯的颗粒的形状难以具有球形形状，并且所生产的颗粒的均匀性降低。

烃油的密度可以为0.75g/cm

然而，当烃油的密度过度降低至小于0.75g/cm

微载体的表观密度可以为0.95g/cm

由于微载体具有上述低密度范围，因此在细胞培养之后对微载体和细胞进行分离并回收时，通过由于重力而引起的沉降速度的差异，可以容易地分离细胞和微载体。

用于测量微载体的表观密度的方法没有特别限制，但是例如，可以将处于干燥过程完成的条件下的微载体样品添加至密度已经被调节的乙醇水溶液和蒸馏水中，并且表观密度可以通过确定颗粒是漂浮还是沉降来测量。

更具体地，在室温(25℃)和大气压(1个大气压)的条件下，将处于干燥过程已经完成的条件下的微载体样品分别添加至密度为0.95g/cm

例如，可以评估：在密度为0.95g/cm

当微载体的密度大于1.05g/cm

应用该实施方案的细胞培养用微载体的细胞为贴壁动物细胞，并且其实例没有特别限制，但是例如，细胞可以为成纤维细胞、上皮细胞、成骨细胞、软骨细胞、肝细胞、人源脐带血细胞、源自人骨髓的间充质干细胞、CHO(中国仓鼠卵巢)细胞、肾细胞(HEK293、BHK21、MDCK、vero细胞等)、或者其两者或更多者的混合物。

细胞的密度可以为1.02g/cm

此外，细胞培养微载体与细胞之间的密度差异可以为0.02g/cm

同时，磁性颗粒可以包括经疏水性官能团表面处理的磁性颗粒。经疏水性官能团表面处理的磁性颗粒可以指其中疏水性官能团结合至磁性颗粒的表面的磁性颗粒。

具体地，表面处理意指为了防止磁性颗粒聚集并改善分散性，使磁性颗粒与包含疏水性官能团的化合物反应，以使疏水性官能团结合至磁性颗粒的表面。

在一个实施方案中，磁性颗粒是指表现出磁性特性的颗粒。所有材料都与磁场相互作用，产生吸引力或排斥力。即，如果将磁场施加于材料，则材料被磁化。根据对象被磁化的形式，磁化材料分为铁磁材料、顺磁材料、反铁磁材料和亚铁磁材料。

磁性颗粒可以通过以下制造：溶液合成、共沉淀、溶胶-凝胶法、高能散裂、水热合成、微乳液合成、通过热分解的合成、或声化学合成，但不限于此。

经疏水性官能团表面处理的磁性颗粒的直径可以为0.1nm或更大且1000nm或更小。即，经疏水性官能团表面处理的磁性颗粒可以为经疏水性官能团表面处理的磁性纳米颗粒。

纳米颗粒是指具有纳米(nm)尺寸的颗粒。纳米尺寸为微米尺寸(10

如果磁性材料的尺寸减小至纳米，则纳米颗粒形成其各自的磁性区域。在包含这些颗粒的胶体溶液中，由于颗粒的热波动，其磁偶极子在不规则方向上取向，使得表面净磁力可能为“0”。然而，当外加磁场的磁力大于内部热能时，颗粒的磁偶极子在一个方向上对齐，从而成为磁性材料。

磁性颗粒的类型没有特别限制，并且可以使用金属纳米颗粒。其实例可以包括选自以下中的一种或更多种金属或其氧化物：金(Au)、银(Ag)、钴(Co)、铜(Cu)、铁(Fe)、铬(Cr)、镍(Ni)、钯(Pd)、铂(Pt)和锡(Sn)。具体地，磁性颗粒可以包括铁(Fe)颗粒。

磁性颗粒可以包含在磁性颗粒的表面上的含有疏水性官能团的疏水性配体。即，经疏水性官能团表面处理的磁性颗粒可以包含在磁性颗粒的表面上的含有疏水性官能团的疏水性配体。

与包含未经表面处理的磁性颗粒的微载体相比，由于所述微载体包含经疏水性官能团表面处理的磁性颗粒，因此金属颗粒独立地分散从而防止颗粒聚集以及改善氧化稳定性。

配体是指结合在被配位的化合物的中心金属离子周围的分子或离子，并且可以意指在为配合物化合物中的中心金属原子提供电子对的同时形成配位键的原子或原子团。

即，疏水性配体可以指结合在经疏水性官能团表面处理的磁性颗粒的中心磁性颗粒离子周围的疏水性分子或疏水性离子。

具体地，疏水性配体可以包括选自以下中的一种或更多种配体：具有2至20个碳原子的脂肪酸或其衍生物；以及具有2至20个碳原子的脂肪酸胺或其衍生物。

脂肪酸衍生物可以包括脂肪酸离子，以及脂肪酸胺衍生物可以包括脂肪酸胺离子。

脂肪酸为包含烃链和在其末端的羧基(-COOH)的化合物，其中烃链保持其疏水性，但可以通过在其末端的羧基与亲水性材料相互作用。脂肪酸可以为不饱和脂肪酸或饱和脂肪酸。

不饱和脂肪酸为具有一个或更多个双键的脂肪酸，其中在其末端的-COOH或-COO-可以与暴露在磁性颗粒的表面和/或磁性颗粒的不饱和配位位点上的亲水性基团形成氢键、离子键、共价键等。

由于不饱和脂肪酸包含双键，因此不饱和脂肪酸的弯曲烃链可以向磁性颗粒的外部取向从而形成疏水通道。

即，上述疏水性官能团可以包含源自具有2至20个碳原子的脂肪酸或其衍生物、或者具有2至20个碳原子的脂肪酸胺或其衍生物的烃链。更具体地，疏水性官能团可以包含具有2至50个碳原子的烷基或具有2至50个碳原子的烯基。

因此，疏水性配体可以包含疏水性官能团和键合至其末端的-COOH或-COO-。

具有2至20个碳原子的脂肪酸的类型没有特别限制，但是例如，其可以包括油酸、己酸和硬脂酸中的任一者。

此外，具有2至20个碳原子的脂肪酸胺的类型没有特别限制，但是例如，其可以包括油胺、丁胺和辛胺中的任一者。

例如，经疏水性官能团表面处理的磁性颗粒可以具有如图1中所示的键合结构。

在经疏水性官能团表面处理的磁性颗粒的生产期间，将具有2至20个碳原子的脂肪酸添加至碱性水溶液中以形成具有2至20个碳原子的脂肪酸离子，然后与磁性纳米颗粒反应，由此可以形成如图1中所示的在具有2至20个碳原子的脂肪酸的末端包含的-COO-与磁性纳米颗粒之间的配位键。

同时，磁性颗粒的密度可以为5g/cm

具体地，磁性颗粒的密度可以为5g/cm

如上所述，由于磁性颗粒的密度为5g/cm

此外，经疏水性官能团表面处理的磁性颗粒的直径可以为100nm或更大且2000nm或更小。测量磁性颗粒的直径的方法没有特别限制，但是例如，其可以使用动态光散射(dynamic light scattering，DLS)等测量。

具体地，经疏水性官能团表面处理的磁性颗粒的直径可以为100nm或更大、300nm或更大、500nm或更大、或者2000nm或更小、1500nm或更小、1000nm或更小、800nm或更小、600nm或更小、或者100nm或更大且2000nm或更小、100nm或更大且1500nm或更小、100nm或更大且1000nm或更小、100nm或更大且800nm或更小、100nm或更大且600nm或更小、300nm或更大且2000nm或更小、300nm或更大且1500nm或更小、300nm或更大且1000nm或更小、300nm或更大且800nm或更小、300nm或更大且600nm或更小、或者500nm或更大且2000nm或更小、500nm或更大且1500nm或更小、500nm或更大且1000nm或更小、500nm或更大且800nm或更小、500nm或更大且600nm或更小。

基于聚苯乙烯的颗粒可以包含其中分散有具有12个或更多个碳原子的烃油或由其产生的孔中的至少一者以及磁性颗粒的基于聚苯乙烯的聚合物。

即，基于聚苯乙烯的颗粒可以包含基于聚苯乙烯的聚合物基体、分散在基于聚苯乙烯的聚合物基体中的具有12个或更多个碳原子的烃油或由其产生的孔中的至少一者以及磁性颗粒。

具体地，细胞培养用微载体可以以这样的状态存在：其中磁性颗粒分散在具有12个或更多个碳原子的烃油或由其产生的孔中的至少一者或更多者的内部。

如上所述，细胞培养用微载体包含含有具有12个或更多个碳原子的烃油、磁性颗粒和苯乙烯单体的单体组合物的悬浮聚合反应产物，并且可以包含孔，其为在悬浮聚合期间具有12个或更多个碳原子的烃油与聚苯乙烯相分离时形成的空间。

因此，由于磁性颗粒包含在单体组合物中，因此其可以以这样的状态存在：磁性颗粒分散在具有12个或更多个碳原子的烃油或由其产生的孔中的至少一者或更多者的内部。

具体地，基于聚苯乙烯的颗粒可以包含单体组合物的悬浮聚合反应产物，所述单体组合物包含具有12个或更多个碳原子的烃油、经疏水性官能团表面处理的磁性颗粒和苯乙烯单体。

相对于100重量份的具有12个或更多个碳原子的烃油，单体组合物可以包含0.01重量份或更多且5重量份或更少的磁性颗粒。具体地，相对于100重量份的具有12个或更多个碳原子的烃油，单体组合物可以以以下量包含磁性颗粒：0.01重量份或更多、0.02重量份或更多、或者0.04重量份或更多、且5重量份或更少、4重量份或更少，更具体地，0.01重量份或更多且5重量份或更少、0.02重量份或更多且5重量份或更少、0.02重量份或更多且4重量份或更少、0.04重量份或更多且4重量份或更少。

当相对于100重量份的具有12个或更多个碳原子的烃油，磁性颗粒过度减少至少于0.01重量份时，存在的限制在于微载体的磁性不能充分实现，并且当在细胞培养之后对微载体和细胞进行分离并回收时，不易分离和纯化，并且另外涉及回收过程，这使过程复杂。

同时，当相对于100重量份的具有12个或更多个碳原子的烃油，磁性颗粒以大于5重量份的量过量添加时，由于过量包含高密度磁性颗粒，颗粒的整体密度增加，这不仅阻止颗粒在培养箱中顺利漂浮，而且还可能表现出细胞毒性。

此外，相对于1重量份的苯乙烯单体，单体组合物可以以多于0.033重量份且少于3重量份的量包含烯键式不饱和交联剂。

具体地，当相对于1重量份的苯乙烯单体，烯键式不饱和交联剂的量过度降低至少于0.033重量份时，存在的限制在于基于聚苯乙烯的聚合物的交联密度降低，由烃油产生的空隙难以稳定地产生，这使得难以充分地降低基于聚苯乙烯的颗粒的密度。

另一方面，当相对于1重量份的苯乙烯单体，烯键式不饱和交联剂的量过度增加至3重量份或更多时，存在的限制在于虽然基于聚苯乙烯的聚合物的交联密度增加，但基于聚苯乙烯的颗粒的整体密度难以降低至目标水平。

此外，相对于单体组合物的总重量，烃油的含量可以为10重量％或更多且30重量％或更少、或者14重量％或更多且21重量％或更少。当烃油的含量过度减少时，浸渍在颗粒内部的烃油的量减少，这使得难以充分地降低基于聚苯乙烯的颗粒的密度。此外，当烃油的含量过度增加时，基于聚苯乙烯的颗粒的形状难以具有球形形状，并且所生产的颗粒的均匀性降低。

烯键式不饱和交联剂的实例包括二乙烯基苯。

基于基于聚苯乙烯的颗粒的总表面积，与存在于基于聚苯乙烯的颗粒的表面上的微孔接触的基于聚苯乙烯的颗粒的表面积的比率可以小于0.01％。基于聚苯乙烯的颗粒的总表面积意指在基于聚苯乙烯的颗粒的最外角处暴露于空气的表面积的总和，以及与存在于基于聚苯乙烯的颗粒的表面上的微孔接触的基于聚苯乙烯的颗粒的表面积意指存在于基于聚苯乙烯的颗粒的表面上的微孔与基于聚苯乙烯的颗粒的最外表面接触的表面积的总和。此外，微孔为最大直径为微米尺寸的孔，例如，意指最大直径为1μm或更大且500μm或更小的孔。

更具体地，基于基于聚苯乙烯的颗粒的总表面积，与存在于基于聚苯乙烯的颗粒的表面上的微孔接触的基于聚苯乙烯的颗粒的表面积的比率可以根据以下等式1获得。

[等式1]

基于基于聚苯乙烯的颗粒的总表面积的与存在于基于聚苯乙烯的颗粒的表面上的微孔接触的基于聚苯乙烯的颗粒的表面积的比率(％)＝[(与存在于基于聚苯乙烯的颗粒的表面上的微孔接触的基于聚苯乙烯的颗粒的表面积)/(基于聚苯乙烯的颗粒的总表面积)]*100

“基于基于聚苯乙烯的颗粒的总表面积，与存在于基于聚苯乙烯的颗粒的表面上的微孔接触的基于聚苯乙烯的颗粒的表面积的比率小于0.01％”意指存在于基于聚苯乙烯的颗粒的表面上的微米尺寸的孔非常少，以至于完全不存在或者几乎不存在。即，在基于聚苯乙烯的颗粒的表面上可以不存在微孔。

常规地，为了降低聚苯乙烯颗粒的密度，通过添加发泡剂来生产泡沫苯乙烯，但在这种情况下，聚苯乙烯颗粒的直径范围和密度范围的分布变得过宽，这使得难以确保作为细胞培养用微载体的产率在可应用的范围内。

同时，基于聚苯乙烯的颗粒具有这样的优点：可以更精确地调节聚苯乙烯颗粒的直径范围和密度范围的分布，因为基于基于聚苯乙烯的颗粒的总表面积，与存在于基于聚苯乙烯的颗粒的表面上的微孔接触的基于聚苯乙烯的颗粒的表面积的比率小于0.01％，因此，与常规形成的苯乙烯不同，利用发泡剂的发泡过程完全不进行。

微载体的平均直径可以为50μm或更大且400μm或更小。

具体地，微载体的平均直径可以为50μm或更大、75μm或更大、100μm或更大、120μm或更大、或者400μm或更小、300μm或更小、250μm或更小、200μm或更小、或者50μm或更大且400μm或更小、50μm或更大且300μm或更小、50μm或更大且250μm或更小、50μm或更大且200μm或更小、50μm或更大且400μm或更小、75μm或更大且300μm或更小、75μm或更大且250μm或更小、75μm或更大且200μm或更小、100μm或更大且400μm或更小、100μm或更大且300μm或更小、100μm或更大且250μm或更小、100μm或更大且200μm或更小、120μm或更大且400μm或更小、120μm或更大且300μm或更小、50μm或更大且120μm或更小、或者50μm或更大且120μm或更小。当微载体的平均直径满足上述范围时，细胞粘附和培养性能优异。另一方面，当微载体的平均直径小于50μm时，存在这样的风险：可用于细胞培养的表面积会是小的并且培养效率会是低的，而当微载体的平均直径大于400μm时，贴壁细胞之间的相互作用减少，培养箱中的细胞密度降低，这导致细胞培养效率降低的问题。

微载体的直径意指穿过微载体的重心的直线与微载体的最外表面相会的两点之间的距离，并且微载体的平均直径可以通过经由光学显微镜确定细胞培养用微载体中包含的所有颗粒的直径来获得。

微载体可以为平均直径为50μm或更大且400μm或更小的单个颗粒的组，并且包含在这样的组中的单个颗粒的平均直径可以为50μm或更大且400μm或更小。更具体地，包含在该组中的单个颗粒中的95％或99％的直径可以为50μm或更大且400μm或更小。

此外，微载体的比表面积可以为200cm

用于测量比表面积的方法没有特别限制，但是例如，微载体的比表面积可以使用以下等式由表观密度计算。

[等式]

微载体的比表面积(cm

在以上等式中，r意指微载体的平均半径，以及ρ意指微载体的表观密度。

基于聚苯乙烯的颗粒的表面还可以包括底层聚合物层、细胞粘附诱导层、或其组合层。即，基于聚苯乙烯的颗粒的表面还可以包括一种类型的底层聚合物层、一种类型的细胞粘附诱导层、或者一种类型的底层聚合物层和一种类型的细胞粘附诱导层的混合层。在一种类型的底层聚合物层和一种类型的细胞粘附诱导层的混合层中，这些的堆叠顺序没有特别限制，并且其中细胞粘附诱导层层合在底层聚合物层上的结构或其中底层聚合物层层合在细胞粘附诱导层上的结构二者均适用。

同时，底层聚合物层用作可以将功能性聚合物引到没有官能团的基于聚苯乙烯的颗粒的表面上的粘合层，从而有效地将用于细胞粘附的聚合物层引到微载体的表面上，并且甚至在培养期间也使得能够稳定保持。

底层聚合物层的实例没有特别限制，但其可以为能够诱导水相粘附的儿茶酚衍生物，其可以包括选自以下中的任一者或更多者：L-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)、多巴胺、聚多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素、表儿茶素及其衍生物。

同时，细胞粘附诱导层由细胞粘附材料构成，其用于提供细胞的跨膜蛋白可以结合的位点，从而使得贴壁细胞稳定地粘附、扩散和培养。

形成细胞粘附诱导层的聚合物的实例没有特别限制，但其可以包括选自以下中的任一者或更多者：明胶、胶原、纤连蛋白壳聚糖、聚多巴胺、聚L-赖氨酸、玻连蛋白、含RGD的肽、含RGD的丙烯酸类聚合物、木质素、阳离子葡聚糖及其衍生物。

在一个实例中，微载体包含形成在基于聚苯乙烯的颗粒的表面上的底层聚合物层，因此可以通过以下而具有水分散的效果：将微载体的表面改性成亲水性的，将细胞粘附诱导层引到底层聚合物层的表面上，调节微载体在培养基中的漂浮程度，以及稳定地附着/培养细胞。

同时，基于聚苯乙烯的颗粒的半径与底层聚合物层的厚度之间的比率可以为1:0.00001至1:0.01、或1:0.0001至1:0.001。

当基于聚苯乙烯的颗粒的半径与表面涂覆层的厚度之间的比率小于1:0.00001时，与基于聚苯乙烯的颗粒相比，底层聚合物层过薄，使得将微载体的表面改性成亲水性的效果不显著，而当该比率超过1:0.01时，底层聚合物层变得比基于聚苯乙烯的颗粒更厚，使得在细胞培养期间细胞与微载体之间的粘附程度可能降低。

根据本发明的另一个实施方案，可以提供用于生产细胞培养用微载体的方法，所述方法包括使包含磁性颗粒和苯乙烯单体的单体组合物在具有12个或更多个碳原子的烃油的存在下进行悬浮聚合反应。

烃油、磁性颗粒和苯乙烯单体的内容包括所有以上在一个实施方案中描述的内容。即，磁性颗粒可以包括经疏水性官能团表面处理的磁性颗粒。

经疏水性官能团表面处理的磁性颗粒可以指其中疏水性官能团结合至磁性颗粒的表面的磁性颗粒。

具体地，表面处理意指为了防止磁性颗粒聚集并改善分散性，使磁性颗粒与包含疏水性官能团的化合物反应，以使疏水性官能团结合至磁性颗粒的表面。

在一个实施方案中，磁性颗粒是指表现出磁性特性的颗粒。所有材料都与磁场相互作用，产生吸引力或排斥力。即，如果将磁场施加于材料，则材料被磁化。根据对象被磁化的形式，磁化材料分为铁磁材料、顺磁材料、反铁磁材料和亚铁磁材料。

磁性颗粒可以通过以下制造：溶液合成、共沉淀、溶胶-凝胶法、高能散裂、水热合成、微乳液合成、通过热分解的合成、或声化学合成，但不限于此。

经疏水性官能团表面处理的磁性颗粒的直径可以为0.1nm或更大且1000nm或更小。即，经疏水性官能团表面处理的磁性颗粒可以为经疏水性官能团表面处理的磁性纳米颗粒。

纳米颗粒是指具有纳米(nm)尺寸的颗粒。纳米尺寸为微米尺寸(10

如果磁性材料的尺寸减小至纳米，则纳米颗粒形成其各自的磁性区域。在包含这些颗粒的胶体溶液中，由于颗粒的热波动，其磁偶极子在不规则方向上取向，使得表面净磁力可能为“0”。然而，当外加磁场的磁力大于内部热能时，颗粒的磁偶极子在一个方向上对齐，从而成为磁性材料。

磁性颗粒的类型没有特别限制，并且可以使用金属纳米颗粒。其实例可以包括选自以下中的一种或更多种金属或其氧化物：金(Au)、银(Ag)、钴(Co)、铜(Cu)、铁(Fe)、铬(Cr)、镍(Ni)、钯(Pd)、铂(Pt)和锡(Sn)。具体地，磁性颗粒可以包括铁(Fe)颗粒。

磁性颗粒可以包含在磁性颗粒的表面上的含有疏水性官能团的疏水性配体。即，经疏水性官能团表面处理的磁性颗粒可以包含在磁性颗粒的表面上的含有疏水性官能团的疏水性配体。

作为用于生产包含经疏水性官能团表面处理的磁性颗粒的微载体的方法，与包含未经表面处理的磁性颗粒的微载体相比，金属颗粒独立地分散从而防止颗粒聚集以及改善氧化稳定性。

配体是指结合在被配位的化合物的中心金属离子周围的分子或离子，并且可以意指在为配合物化合物中的中心金属原子提供电子对的同时形成配位键的原子或原子团。

即，疏水性配体可以指结合在经疏水性官能团表面处理的磁性颗粒的中心磁性颗粒离子周围的疏水性分子或疏水性离子。

具体地，疏水性配体可以包括选自以下中的一种或更多种配体：具有2至20个碳原子的脂肪酸或其衍生物；以及具有2至20个碳原子的脂肪酸胺或其衍生物。

脂肪酸衍生物可以包括脂肪酸离子，以及脂肪酸胺衍生物可以包括脂肪酸胺离子。

脂肪酸为包含烃链和在其末端的羧基(-COOH)的化合物，其中烃链保持其疏水性，但可以通过在其末端的羧基与亲水性材料相互作用。脂肪酸可以为不饱和脂肪酸或饱和脂肪酸。

不饱和脂肪酸为具有一个或更多个双键的脂肪酸，其中在其末端的-COOH或-COO-可以与暴露在磁性颗粒的表面和/或磁性颗粒的不饱和配位位点上的亲水性基团形成氢键、离子键、共价键等。

由于不饱和脂肪酸包含双键，因此不饱和脂肪酸的弯曲烃链可以向磁性颗粒的外部取向从而形成疏水通道。

即，上述疏水性官能团可以包含源自具有2至20个碳原子的脂肪酸或其衍生物、或者具有2至20个碳原子的脂肪酸胺或其衍生物的烃链。更具体地，疏水性官能团可以包含具有2至50个碳原子的烷基或具有2至50个碳原子的烯基。

因此，疏水性配体可以包含疏水性官能团和键合至其末端的-COOH或-COO-。

具有2至20个碳原子的脂肪酸的类型没有特别限制，但是例如，其可以包括油酸、己酸和硬脂酸中的任一者。

此外，具有2至20个碳原子的脂肪酸胺的类型没有特别限制，但是例如，其可以包括油胺、丁胺和辛胺中的任一者。

例如，经疏水性官能团表面处理的磁性颗粒可以具有如图1中所示的键合结构。

在经疏水性官能团表面处理的磁性颗粒的生产期间，将具有2至20个碳原子的脂肪酸添加至碱性水溶液中以形成具有2至20个碳原子的脂肪酸离子，然后与磁性纳米颗粒反应，由此可以形成如图1中所示的在具有2至20个碳原子的脂肪酸的末端包含的-COO-与磁性纳米颗粒之间的配位键。

同时，磁性颗粒的密度可以为5g/cm

具体地，磁性颗粒的密度可以为5g/cm

如上所述，由于磁性颗粒的密度为5g/cm

此外，经疏水性官能团表面处理的磁性颗粒的直径可以为100nm或更大且2000nm或更小。

具体地，经疏水性官能团表面处理的磁性颗粒的直径可以为100nm或更大、300nm或更大、500nm或更大、或者2000nm或更小、1500nm或更小、1000nm或更小、800nm或更小、600nm或更小、或者100nm或更大且2000nm或更小、100nm或更大且1500nm或更小、100nm或更大且1000nm或更小、100nm或更大且800nm或更小、100nm或更大且600nm或更小、300nm或更大且2000nm或更小、300nm或更大且1500nm或更小、300nm或更大且1000nm或更小、300nm或更大且800nm或更小、300nm或更大且600nm或更小、或者500nm或更大且2000nm或更小、500nm或更大且1500nm或更小、500nm或更大且1000nm或更小、500nm或更大且800nm或更小、500nm或更大且600nm或更小。

相对于100重量份的具有12个或更多个碳原子的烃油，单体组合物可以包含0.01重量份或更多且5重量份或更少的磁性颗粒。具体地，相对于100重量份的具有12个或更多个碳原子的烃油，单体组合物可以以以下量包含磁性颗粒：0.01重量份或更多、0.02重量份或更多、或者0.04重量份或更多、且5重量份或更少、4重量份或更少，更具体地，0.01重量份或更多且5重量份或更少、0.02重量份或更多且5重量份或更少、0.02重量份或更多且4重量份或更少、0.04重量份或更多且4重量份或更少。

当相对于100重量份的具有12个或更多个碳原子的烃油，磁性颗粒过度减少至少于0.01重量份时，存在的限制在于微载体的磁性不能充分实现，并且当在细胞培养之后对微载体和细胞进行分离并回收时，不易分离和纯化，并且另外涉及回收过程，这使过程复杂。

同时，当相对于100重量份的具有12个或更多个碳原子的烃油，磁性颗粒以大于5重量份的量过量添加时，由于过量包含高密度磁性颗粒，颗粒的整体密度增加，这不仅阻止颗粒在培养箱中顺利漂浮，而且还可能表现出细胞毒性。

此外，相对于1重量份的苯乙烯单体，单体组合物可以以多于0.033重量份且少于3重量份的量包含烯键式不饱和交联剂。

具体地，当相对于1重量份的苯乙烯单体，烯键式不饱和交联剂的量过度降低至少于0.033重量份时，存在的限制在于基于聚苯乙烯的聚合物的交联密度降低，由烃油产生的空隙难以稳定地产生，这使得难以充分地降低基于聚苯乙烯的颗粒的密度。

另一方面，当相对于1重量份的苯乙烯单体，烯键式不饱和交联剂的量过度增加至3重量份或更多时，存在的限制在于虽然基于聚苯乙烯的聚合物的交联密度增加，但基于聚苯乙烯的颗粒的整体密度难以降低至目标水平。

此外，相对于单体组合物的总重量，烃油的含量可以为10重量％或更多且30重量％或更少、或者14重量％或更多且21重量％或更少。当烃油的含量过度减少时，浸渍在颗粒内部的烃油的量减少，这使得难以充分地降低基于聚苯乙烯的颗粒的密度。此外，当烃油的含量过度增加时，基于聚苯乙烯的颗粒的形状难以具有球形形状，并且所生产的颗粒的均匀性降低。

更具体地，单体组合物的悬浮聚合反应可以包括以下步骤：将单体组合物混合至水性分散体中并向其施加剪切力以使水性分散体中的单体组合物以液滴的形式均化的步骤；以及使均化的单体组合物在300rpm或更高且1000rpm或更低的搅拌速度下进行悬浮聚合反应的步骤。

在使均化的单体组合物在300rpm或更高且1000rpm或更低、或者400rpm或更高且800rpm或更低的搅拌速度下进行悬浮聚合反应的步骤中形成聚苯乙烯和烃油的颗粒结构期间，可以产生具有高比率的球形颗粒的细胞培养用微载体，同时通过聚苯乙烯与烃油的相分离而形成内部孔，并降低细胞培养用微载体的密度。

在使均化的单体组合物在300rpm或更高且1000rpm或更低、或者400rpm或更高且800rpm或更低的搅拌速度下进行悬浮聚合反应的步骤中，悬浮聚合条件的实例没有特别限制，但是例如，聚合可以在50℃或更高且100℃的温度下进行3小时或更长且18小时或更短。

同时，在进行悬浮聚合反应的步骤之后，用于生产细胞培养用微载体的方法还可以包括对悬浮聚合反应产物进行洗涤和干燥。

具体地，对悬浮聚合反应产物进行洗涤的步骤可以包括以下步骤：通过10μm或更大且100μm或更小的筛对悬浮聚合反应产物进行过滤，然后将其在室温下在100％乙醇中和/或在50℃或更高且80℃或更低的高温下在蒸馏水中搅拌5至7次。

对悬浮聚合反应产物进行干燥的步骤包括将其置于真空烘箱中并在室温下真空干燥的步骤。然而，干燥方法不限于此，并且可以没有特别限制地使用已知通常使用的任何干燥方法。

同时，在进行悬浮聚合反应的步骤之后，另一个实施方案的用于生产细胞培养用微载体的方法还可以包括将底层聚合物层、细胞粘附诱导层或其组合层施加至悬浮聚合反应产物的表面上的步骤。

底层聚合物层和细胞粘附诱导层的内容包括所有以上在一个实施方案中描述的内容。

根据本发明的又一个实施方案，可以提供包含细胞和一个实施方案的细胞培养用微载体的细胞培养组合物。

细胞为贴壁动物细胞，并且其实例没有特别限制，但是例如，其可以为成纤维细胞、上皮细胞、成骨细胞、软骨细胞、肝细胞、人源脐带血细胞、源自人骨髓的间充质干细胞、CHO(中国仓鼠卵巢)细胞、肾细胞(HEK293、BHK21、MDCK、vero细胞等)、或者其两者或更多者的混合物。

细胞的密度可以为1.02g/cm

此外，细胞培养微载体与细胞之间的密度差异可以为0.02g/cm

细胞培养组合物还可以包含培养基溶液。培养基溶液可以包含接近基于体液例如血浆和淋巴液的生物条件的营养物、以及各种添加剂以充分满足环境条件例如营养物和pH、温度、以及渗透压。可以没有限制地使用细胞培养相关技术领域中广泛已知的各种物质。

作为实例，一个实施方案的细胞培养用微载体的密度低于培养基溶液的密度，因此被注入至培养基溶液中并在搅拌条件下漂浮在培养基溶液中。然后，随着附着于低密度微载体的表面的细胞的数量增加，附着有细胞的微载体(在下文中，称为“微载体-细胞结合物”)的密度逐渐增加，并逐渐沉入培养基溶液中。

因此，将附着有细胞的微载体(微载体-细胞结合物)通过添加细胞分离酶来处理，然后通过离心来分离以从微载体-细胞结合物分离细胞，从而容易地得到培养的细胞。

有益效果

根据本发明，可以提供细胞培养用微载体、用于生产其的方法以及使用其的细胞培养方法，所述细胞培养用微载体具有低密度从而实现细胞培养，并且在细胞培养之后对微载体和细胞进行分离并回收时也可以更容易地分离。

附图说明

图1示出了经疏水性官能团表面处理的磁性颗粒。

图2示出了在实施例1中获得的细胞培养用微载体的SEM图像。

图3示出了在实施例1中获得的细胞培养用微载体的颗粒截面形状的SEM图像。

图4示出了在实施例1中获得的细胞培养用微载体的颗粒表面形状的SEM图像。

具体实施方式

在下文中，将通过实施例的方式更详细地描述本发明。然而，这些实施例仅用于说明性目的而提供，并且不旨在限制本发明的范围。

<生产例：磁性颗粒的生产>

将Fe

将油酸(2g)和13ml丙酮混合，然后添加至磁性颗粒水溶液中。

在搅拌30分钟之后，缓慢添加15ml氢氧化铵水溶液(固体含量：25重量％)。

将温度升到80℃至90℃，并将混合物搅拌1小时或更长时间。然后，将温度降低到65℃至75℃，并向其中添加1N HCl，直到反应物的pH达到2。

用蒸馏水洗涤混合物，直到最终反应物的pH达到7，然后在室温下干燥至少2天，以生产经表面处理的磁性颗粒(颗粒直径：500nm至600nm，颗粒密度：5.15g/cm

使用比重瓶测量磁性颗粒的真实密度。

<实施例：细胞培养用微载体的制备>

实施例1

(1)分散相的制备

将下表1中所示含量比的苯乙烯单体(styrene monomer，st)、交联剂二乙烯基苯(divinylbezene，DVB)、生产例的磁性颗粒和低密度油(Isopar M，密度0.791g/cm

(2)连续相的制备

将6g具有85000至125000范围内的重均分子量和87％至89％的水解率的PVA溶解于600g蒸馏水中。具体含量示于下表1中。

(3)通过悬浮聚合生产颗粒

将600g 1％PVA水溶液与分散相混合，并在油浴中搅拌直到获得均匀分散体。具体地，在室温下以400rpm至500rpm搅拌的同时将油浴逐渐加热，并在80℃至90℃的温度和400rpm至600rpm的速度下进行悬浮聚合。聚合在氮气吹扫下进行。

(4)获得颗粒

反应4小时之后，将产生的颗粒通过45μm筛回收，在70℃或更高且80℃或更低下用乙醇洗涤3次并用蒸馏水洗涤3次，并在80℃下在烘箱中干燥。

(5)颗粒表面处理

在聚合之后，将在室温下经干燥的颗粒浸入其中以1mg/mL溶解有盐酸多巴胺的tris缓冲液(pH 8.0)中，在室温下搅拌至少1小时以将聚多巴胺层引到颗粒表面上。在反应之后，将颗粒通过45μm筛回收，用乙醇洗涤三次，并在80℃下在烘箱中干燥。

实施例2至4

通过与实施例1中相同的步骤获得颗粒，不同之处在于分散相和连续相的组成如下表1中所示调整。

比较例1

通过与实施例1中相同的步骤获得颗粒，不同之处在于不添加磁性颗粒。

比较例2和3

通过与实施例1中相同的步骤获得颗粒，不同之处在于分散相和连续相的组成如下表1中所示调整。

参照例1

通过与实施例1中相同的步骤获得颗粒，不同之处在于添加表面未经油酸疏水改性的磁性颗粒代替生产例的磁性颗粒。

[表1]

<实验例：细胞培养用微载体的物理特性的测量>

通过以下方法测量实施例、比较例和参照例中获得的细胞培养用微载体的物理特性，并且结果示于下表2中。

1.颗粒尺寸

对于实施例、比较例和参照例中获得的细胞培养用微载体，通过光学显微镜测量100个颗粒的直径，并获得其算术平均值。

实施例1中获得的细胞培养用微载体的SEM图像示于图2中。

2.颗粒内部结构和孔直径

(1)颗粒内部结构

对于实施例1中获得的细胞培养用微载体，通过SEM确定颗粒内部结构。具体地，在将颗粒包埋在环氧树脂中之后，通过离子研磨制备截面，并通过SEM确定颗粒的截面形状，其示于图3中。

(2)空隙直径

在将实施例和比较例中获得的细胞培养用微载体包埋在环氧树脂中之后，通过离子研磨制备截面，并通过SEM确定颗粒截面的形状，并获得颗粒内部的孔中的最小直径和最大直径。

3.表观密度

对于实施例、比较例和参照例中获得的细胞培养用微载体，制备处于干燥过程已经完成的条件下的样品，并在室温(25℃)和大气压(1个大气压)的条件下，将样品分别添加至密度为0.95g/cm

1)在密度为0.95g/cm

2)在密度为1g/cm

3)在密度为0.95g/cm

4)在密度为0.95g/cm

5)在密度为0.98g/cm

4.比表面积

使用以下等式由所获得的表观密度计算细胞培养用微载体的比表面积。

[等式]

微载体的比表面积(cm

在以上等式中，r意指微载体的平均半径，以及ρ意指微载体的表观密度。

5.细胞培养效率

将包含间充质干细胞(密度：1.05g/cm

高：在细胞培养期间细胞培养效率为80％或更高

低：在细胞培养期间细胞培养效率低于80％

6.磁性分离效率

将强磁体与容纳其中分散有在实施例、比较例和参照例中获得的细胞培养用微载体的溶液的小瓶的一侧接触，并目视确定细胞培养用微载体是否移动。

如果细胞培养用微载体中的90％或更多在与磁体接触的表面的方向上移动，则评估为“优异”，而如果微载体中的少于90％移动，则评估为“不良”。

7.孔组分分析

对于在实施例、比较例和参照例中获得的细胞培养用微载体，为了分析包含在内部空隙中的组分，将细胞培养用微载体冷冻粉碎并溶解在氯仿中，提取未反应的残留化合物，并通过GC/FID(气相色谱-火焰离子化检测器)定性和定量分析详细组分。

具体地，在体积比为1:2的氯仿和甲醇的混合溶剂中制备各浓度的苯乙烯(1/4000mg/mL至1mg/mL)、二乙烯基苯(1/10000mg/mL至1mg/mL)和Isopar M(1/400mg/mL至10mg/mL)的标准样品。将1uL标准样品注入GC/FID仪器中并制备校准曲线。注入1μL表1中的样品，使用校准曲线计算含量。对于GC/FID测量，使用具有0.53mm的内径、30m的长度和5μm的膜厚度的在Rtx(苯乙烯，Isopar M)或蜡(二乙烯基苯)上的柱。从50℃的初始烘箱温度开始，以10℃/分钟的速率将温度升至250℃。作为流动相气体，使用速率为15mL/分钟的氦气。

此时，检测到油或由其产生的组分的情况用“O”表示，以及未检测到油或由其产生的组分的情况用“X”表示。

[表2]

实施例、比较例和参照例的实验例测量结果

如表2中所示，可以确定在实施例的细胞培养用微载体中，在满足小于1.05g/cm

此外，在比较例2的细胞培养用微载体中，颗粒密度大于1.05g/cm

此外，比较例3的细胞培养用微载体的颗粒密度大于1.05g/cm

此外，可以确定，由于参照例1的细胞培养用微载体包含未经疏水性官能团表面处理的磁性颗粒，因此水分散磁性颗粒未均匀分散在包含苯乙烯单体的分散相中，并且水分散磁性颗粒在聚合期间团聚。此外，在这样生产的颗粒的情况下，存在颗粒尺寸分布大并且磁性分离效率降低的问题。