一种氧气微纳气泡增强好氧发酵生物反应器及其应用

技术领域

本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种氧气微纳气泡增强好氧发酵生物反应器。

背景技术

在好氧深层发酵过程中，氧气的供应往往是发酵能否成功的重要限制因素之一。对于好氧微生物来说，必须在有分子氧的条件下才能生长，但是由于氧在水中的溶解度很小，在发酵液中的溶解度亦是如此，因此，需要不断通风和搅拌，才能满足好氧微生物对氧的需求。

微纳气泡是一种微纳米级的气泡，相比于普通气泡来说，粒径很小，故而表现出一些特殊的优势，如存在时间长、传质效率高、上升速度慢、表面电荷形成的Zeta电位高等。这些特征使微纳米气泡近年来被广泛地应用于水中污染物的降解、水产养殖、农业土壤改良等领域，陆亮等人(《上海农业科技》，2017，06：52+73)利用经纳微气液分散相界面混合发生器产生的气泡水灌溉水稻能提高水稻根系活力，增加有效穗数、每穗粒数和千粒重，从而提高产量，并能减少化肥用量，有助于控制农业面源污染、保护生态环境。袁晓玲等人(《工业水处理》，2020，40(07)：47-50)利用微纳米气泡结合臭氧化技术处理污泥，相比于臭氧普通气泡，臭氧微纳米气泡对污泥的减量化效果更高，污泥减量率可达到15％左右。CN114180670 A则提出了一种臭氧微纳气泡废水处理系统及废水处理方法，通过一次溶气和二次溶气过程来减小微纳气泡的尺寸，增强微纳气泡在水中的稳定性，从而提升废水处理效果。

发明内容

发明目的：已有的文献报道证明了微纳气泡的潜在应用价值，但是目前尚未见将微纳气泡应用于好氧微生物的发酵体系，因此，针对好氧微生物固定化发酵过程中存在的问题，如：供氧量不足、传质效率低、提高搅拌速度会导致剪切力对细胞造成损伤等，本发明提出一种氧气微纳气泡增强好氧发酵生物反应器用于提升好氧微生物的固定化细胞连续发酵性能。

为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

一种氧气微纳气泡增强好氧发酵生物反应器，包括氧气发生器、种子罐、气液混合泵、微纳气泡发生器、发酵罐、配料罐、气液分离罐和发酵产物收集罐；

所述气液混合泵、微纳气泡发生器、发酵罐、气液分离罐和发酵产物收集罐依次通过管道连接；所述配料罐与发酵罐连接；

所述氧气发生器和种子罐分别连接至气液混合泵的第一入口和第二入口，将氧气与种子液送入气液混合泵中混合，然后送入微纳气泡发生器中经剪切形成氧气微纳气泡，再送入发酵罐中与配料罐送入的原料一起发酵，发酵产物经气液分离罐分离后，送入发酵产物收集罐中。

具体地，所述微纳气泡发生器包括纳米气泡泵、安全阀、压力罐和气泡雾化器；所述纳米气泡泵进料口与气液混合泵的出料口连接；纳米气泡泵、压力罐、气泡雾化器依次连接；气泡雾化器的出料口与发酵罐的进料口连接；所述纳米气泡泵和压力罐之间，还通过一气体循环管连接，将压力罐内过量的氧气返回纳米气泡泵内，所述安全阀安装在该气体循环管上。

进一步地，所述气泡雾化器的出料口与发酵罐的侧面下方进料口连接，连接管道上设有提水泵；所述发酵罐顶部气体出口，通过一气体循环管连接至压力罐上，将发酵罐内多余氧气返回压力罐内，该气体循环管上设有抽气泵。

具体地，所述发酵罐为机械搅拌式发酵罐，其侧面下方进料口与微纳气泡发生器连接，顶部进料口与配料罐连接，底部出料口与气液分离罐连接；

发酵罐内设有搅拌桨，其与位于发酵罐顶部上方的电机连接通过电机驱动搅拌桨对发酵罐内物料进行搅拌；

发酵罐内反应腔中央设有一个圆柱形、中空的丝网固定器，用于固定棉纤维；搅拌桨贯穿于丝网固定器中部的中空处；

所述发酵罐上还设有换热器，通过换热器调整发酵罐内发酵液的温度。

进一步地，所述换热器选用内置式多组盘管换热器，固定在机械搅拌式发酵罐的反应腔内壁上，所述换热器与发酵罐外部的水箱通过水管连接，水管上设有水泵，通过水泵将水箱中预冷的无菌水送入发酵罐内的盘管中，与罐内发酵液进行热交换。

进一步地，发酵罐顶部进料口与配料罐连接的管道上，设有第一气相平衡管；发酵罐底部出料口与气液分离罐连接的管道上，设有第二气相平衡管。

进一步地，氧气发生器与气液混合泵连接的管道上，设有气体过滤器，避免氧气中杂菌对种子液的污染。

具体地，所述气液分离罐底部进料口与发酵罐出料口连接，中部分离料口与发酵产物收集罐连接，顶部出气口与分水器连接。

具体地，所述分水器具有出水口、进气口、出气口、循环气出口和循环气进口，其循环气进口与气液分离罐的顶部出气口连通，循环气出口与分水器本体中的进气口连通，出水口与发酵产物收集罐连通，出气口连通至大气；分水器上设有阀门，用于控制气体的循环和发酵液的流通。

进一步地，本发明还要求保护上述氧气微纳气泡增强好氧发酵生物反应器在用于固定化谷氨酸棒杆菌发酵生产L-赖氨酸中的应用。

进一步地，上述反应器在用于固定化谷氨酸棒杆菌发酵生产L-赖氨酸的具体步骤包括：

(1)首先，分别对种子罐、配料罐中的物料以及发酵罐中的固定化载体进行蒸汽灭菌后备用；

(2)接着，将过滤除菌后的氧气与活化后的种子液同时通入微纳气泡发生器中，氧气流量控制在200～250g/h，形成含有细胞的氧气微纳米气泡，进一步以6～8L/min的流量通入发酵罐中进行固定化细胞发酵；其中，氧气微纳米气泡平均尺寸在220nm以下，存在时间在630s以上；发酵罐中搅拌速率控制在180rpm以下；

(3)待发酵结束后，利用气液分离罐和分水器对发酵液进行循环分离，产物最终流入发酵产物收集罐中。

相比现有的好氧发酵生物反应器，本发明氧气微纳气泡的形成可使搅拌速度降低10％，L-赖氨酸产量提升20％以上，L-赖氨酸产率提升68％以上，进一步循环使用则将存在时间延长6％以上。

有益效果：

(1)传统的增氧方式形成的大气泡表现出逐渐上升并变大的趋势，随后在液面附近破裂，并在发酵液中产生大量泡沫，进而导致氧气传质受限，发酵产物缓慢形成，发酵周期明显延长，同时，泡沫上升至发酵罐顶从轴封渗出又会增加染菌风险。相比之下，微纳气泡能在发酵液中持续很长时间而不破裂，直至消失，不仅传质效率提高，还减少了发酵过程中染菌的风险，并且避免了加入消泡剂对菌株活性和代谢造成影响。

(2)微纳米气泡发生装置与固定化细胞发酵体系的耦合不必增加发酵罐搅拌速度即可达到高效供氧的效果，避免了因搅拌速度过快导致细胞受水剪切力、机械作用力而受到损伤。

(3)氧气微纳米气泡的循环使用和良好的生理活性一方面可加速细胞的新陈代谢，提高细胞的生长和增殖能力，另一方面还有助于发酵罐中营养物质在固定化细胞表面的高效富集，从而改善固定化细胞的连续化发酵性能，促进产物的转化。

(4)在种子液经过一次和二次溶气过程中，氧气微米气泡裹挟着微生物细胞进入纳米气泡泵，在一定程度上提高了种子液的初始细胞活性，同时适当的压力又可增进细胞膜通透性，改善传质性能，使细胞代谢通量沿着目的产物方向加强。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。

图1是本发明氧气微纳气泡增强好氧发酵生物反应器的整体结构示意图。

其中，各附图标记分别代表：

1、氧气发生器；2、种子罐；3、气体过滤器；4、气液混合泵；5、微纳气泡发生器；6、纳米气泡泵；7、安全阀；8、压力罐；9、气泡雾化器；10、提水泵；11、抽气泵；12、电机；13、搅拌桨；14、换热器；15、第一气相平衡管；16、配料罐；17、发酵罐；18、水泵；19、水箱；20、第二气相平衡管；21、气液分离罐；22、发酵产物收集罐，23、阀门；24、分水器。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。

实施例1：

如图1所示，本发明氧气微纳气泡增强好氧发酵生物反应器，包括氧气发生器1、种子罐2、气液混合泵4、微纳气泡发生器5、发酵罐17、配料罐16、气液分离罐21和发酵产物收集罐22。

其中，气液混合泵4、微纳气泡发生器5、发酵罐17、气液分离罐21和发酵产物收集罐22依次通过管道连接；所述配料罐16与发酵罐17连接。

氧气发生器1和种子罐2分别连接至气液混合泵4的第一入口和第二入口，将氧气与种子液送入气液混合泵4中混合，然后送入微纳气泡发生器5中经剪切形成氧气微纳气泡，再送入发酵罐17中与配料罐16送入的原料一起发酵，发酵产物经气液分离罐21分离后，送入发酵产物收集罐22中。

微纳气泡发生器5包括纳米气泡泵6、安全阀7、压力罐8和气泡雾化器9；所述纳米气泡泵6进料口与气液混合泵4的出料口连接；纳米气泡泵6、压力罐8、气泡雾化器9依次连接；气泡雾化器9的出料口与发酵罐17的进料口连接；所述纳米气泡泵6和压力罐8之间，还通过一气体循环管连接，将压力罐8内过量的氧气返回纳米气泡泵6内，所述安全阀7安装在该气体循环管上。

气泡雾化器9的出料口与发酵罐17的侧面下方进料口连接，连接管道上设有提水泵10；所述发酵罐17顶部气体出口，通过一气体循环管连接至压力罐8上，将发酵罐17内多余氧气返回压力罐8内，该气体循环管上设有抽气泵11。

发酵罐17为机械搅拌式发酵罐，其侧面下方进料口与微纳气泡发生器5连接，顶部进料口与配料罐16连接，底部出料口与气液分离罐21连接。

发酵罐17内设有搅拌桨13，其与位于发酵罐17顶部上方的电机12连接通过电机12驱动搅拌桨13对发酵罐17内物料进行搅拌。搅拌装置可以是旋桨式搅拌器、涡旋式搅拌器、桨式搅拌器、轴式搅拌器和螺带式搅拌器，搅拌速度控制在150～240rpm，以免过高的搅拌速度形成的剪切力对细胞造成不可逆损伤，过低的搅拌速度又会使得发酵过程中溶氧量不足。

发酵罐17内反应腔中央设有一个圆柱形、中空的丝网固定器，用于固定棉纤维；搅拌桨13贯穿于丝网固定器中部的中空处。棉纤维大小为60cm*120cm～80cm*160cm，加入量为30～50g/L。

发酵罐17上还设有换热器14，通过换热器14调整发酵罐17内发酵液的温度。换热器可以是夹套式换热器、U形管板式换热器、浮头式换热器、板式换热器等，换热器所用的冷媒为无菌水，水温控制在4～10℃。

换热器14选用内置式多组盘管换热器，固定在机械搅拌式发酵罐的反应腔内壁上，所述换热器14与发酵罐外部的水箱19通过水管连接，水管上设有水泵18，通过水泵18将水箱19中预冷的无菌水送入发酵罐内的盘管中，与罐内发酵液进行热交换。

发酵罐17顶部进料口与配料罐16连接的管道上，设有第一气相平衡管15；配料罐16用于盛放无菌发酵培养基，无菌发酵培养基以4～10m

氧气发生器1与气液混合泵4连接的管道上，设有气体过滤器3，避免氧气中杂菌对种子液的污染。控制氧气的气流量为200～500g/h，种子液经二次活化后进入气液混合泵的速率为3～10m

氧气微气泡与种子液混合液从气液混合泵4的出液口流出，以0.5～3m

裹挟着细胞的微纳米气泡形成后经气泡雾化器9的出口排出，流量为6～10L/min，经连接管路由机械搅拌式发酵罐17壳体底部的进气口进入反应腔，使微纳米气泡自下而上进入发酵液中。

气液分离罐21底部进料口与发酵罐17出料口连接，中部分离料口与发酵产物收集罐22连接，顶部出气口与分水器24连接。分水器24用以实现发酵产物的循环分离以及达到气液分离罐和发酵产物收集罐的分流稳压效果。

分水器24具有出水口、进气口、出气口、循环气出口和循环气进口，其循环气进口与气液分离罐21的顶部出气口连通，循环气出口与分水器本体中的进气口连通，出水口与发酵产物收集罐22连通，出气口连通至大气；气体的循环和发酵液的流通则由阀门23分别进行控制。

实施例2：

采用上述装置进行固定化谷氨酸棒杆菌发酵生产L-赖氨酸，具体包括：

谷氨酸棒杆菌的种子培养及发酵：

(1)发酵选用菌株：谷氨酸棒杆菌野生菌KFCC 11043，本实验室保藏。

(2)种子培养基(g/L)为蔗糖20，蛋白胨10，酵母粉5，尿素3.5，硫酸铵5，MgSO

(3)发酵培养基(g/L)为葡萄糖80，酵母粉8，尿素15，硫酸铵13.2，MgSO

(4)微量元素溶液a(mg/L)为右旋泛酸钙2，烟酰胺3，维生素B

(5)微量元素溶液b(mg/L)为硫酸铜0.9，硫酸锌1，生物素1.8，维生素B

(6)将摇瓶种子液30℃，220rpm活化12h后，以80％的接种量将活化后的谷氨酸棒杆菌种子液转接至种子罐2中30℃，220rpm培养至OD

生物反应器用于谷氨酸棒杆菌的固定化发酵操作按照如下流程进行：

(7)首先，将大小为70cm*140cm的棉纤维包裹在圆柱形、中空的丝网固定器上，加入量为35g/L，置于发酵罐17内反应腔的中央，随后分别对种子罐2、配料罐16中的物料以及发酵罐17进行115℃，30min蒸汽灭菌备用。

(8)接着，经摇瓶一次活化和种子罐2二次转接后，控制种子液OD

(9)进一步，启动电机12、配料罐16和水泵18，使得搅拌桨13对应的搅拌速度达到180rpm，配料罐16中的物料则以6m

(10)当发酵罐17中发酵液的温度稳定维持在30℃之后，将步骤(8)中制得的含有细胞的氧气微纳气泡以8L/min的流量经发酵罐17侧面下方进料口流入反应腔内进行固定化细胞发酵。

(11)待发酵20h结束后，打开第二气相平衡管20，使发酵罐17和气液分离罐21处于压力平衡状态，发酵液从连通管道进入气液分离罐21中，经分离料口排至发酵液收集罐22中，此外，为防止发酵液量过大排出不及时，以及微纳气泡对发酵液的夹带作用造成损失，产物与气体的分离进一步流经分水器24。

(12)分水器24中气体不断循环，发酵液被进一步分离出，打开对应的气体和液体阀门，最终残留的发酵液经出水口流入发酵产物收集罐22中，气体则排至大气中。

(13)待发酵液全部流出并收集完毕后，利用发酵罐17中的棉纤维表面的固定化细胞开展第二批次发酵，无需再次进行接种，其中，配料罐16中的物料重新填装并经蒸汽灭菌处理待用，具体的操作流程与(9)～(12)一致。

在单批次固定化细胞发酵过程中，发酵周期为20h，L-赖氨酸产量为38g/L，L-赖氨酸产率为1.9g/L/h，L-赖氨酸得率可达到47.5％，氧气微纳气泡尺寸为220nm，存在时间可达630s以上。

进一步在连续式固定化细胞发酵过程中，发酵周期由20h缩短至8h，在第8次时L-赖氨酸产量提升至48g/L，L-赖氨酸产率为6g/L/h，L-赖氨酸得率可达到60％，并且经多次循环，氧气微纳米气泡尺寸可缩小至7～200nm，存在时间可达到670s。

对比例

同实施例对谷氨酸棒杆菌菌株进行活化和种子培养。

参照实施例中的方法进行谷氨酸棒杆菌固定化细胞的发酵，区别在于整个生物反应器体系中不含有微纳气泡发生器5，由气液混合泵4产生的气泡直接从发酵罐17底部的进料口通入反应腔中。

相比之下，在单批次固定化细胞发酵过程中，为确保发酵周期一致，搅拌桨13对应的搅拌速度需提升至200rpm来增强溶氧，L-赖氨酸产量则为36g/L，L-赖氨酸产率为1.8g/L/h，L-赖氨酸得率可达到45％，氧气微气泡尺寸为580nm，存在时间为280s。

进一步在连续式固定化细胞发酵过程中，发酵周期由20h缩短至12h，在第10次时L-赖氨酸产量提升至43g/L，L-赖氨酸产率为3.58g/L/h，L-赖氨酸得率为53.75％，并且经多次循环，氧气微米气泡尺寸可缩小至290～560nm，存在时间可达到300s。

本发明提供了一种氧气微纳气泡增强好氧发酵生物反应器及其应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。